張杰東，劉蘭俠，劉杜先，王利利

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第二醫(yī)院）病理科，南京 210003；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第二醫(yī)院）臨床科研中心

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一。近年來，胃癌的發(fā)病率不斷上升，發(fā)病人群呈年輕化趨勢(shì)。大多數(shù)胃癌患者早期無明顯癥狀，并且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。但目前胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚不完全清楚。有研究報(bào)道，多種生物標(biāo)志物與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶12（CDK12）是一種與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，主要通過磷酸化C 末端域的RNA 結(jié)合蛋白1，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。因此，CDK12 蛋白陽性表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［2］。沉默信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白6（SIRT6）是一種具有多種催化活性的蛋白酶，除了能抑制細(xì)胞衰老外，在調(diào)控基因表達(dá)、維持端粒穩(wěn)定、修復(fù)DNA 以及葡萄糖和脂肪代謝等過程中發(fā)揮重要作用。SIRT6 蛋白陽性表達(dá)有助于維持機(jī)體細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在一定程度上抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展［3］。本研究探討了胃癌組織CDK12、SIRT6蛋白表達(dá)變化及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月—2019年3月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院收治的胃癌患者75例。所有患者符合《內(nèi)科腫瘤學(xué)》［4］中胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合原發(fā)性胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；③接受腹腔鏡胃癌切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并胃潰瘍、萎縮性胃炎等其他胃部疾病者；②合并其他部位惡性腫瘤者；③合并內(nèi)分泌功能紊亂或免疫功能缺陷者。其中，男39例，女36例；年齡36～83歲，＜60歲22 例、≥60 歲53 例；BMI 17～26 kg/m2，＜24 kg/m252例、≥24 kg/m223例；Lauren分型：腸型36例，彌漫型39 例；腫瘤直徑2～9 cm，＜5 cm 38 例、≥5 cm 37例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期44 例，Ⅲ、Ⅳ期31 例；組織分化程度：高分化27例，中分化26例，低分化22例；有脈管侵犯33 例，無脈管侵犯42 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移32例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移43 例。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（審批編號(hào)：2017-LYkt012）。所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 CDK12、SIRT6 蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。取手術(shù)切除的胃癌組織及其配對(duì)的癌旁組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm，并經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為正常胃組織），10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，5 μm 厚連續(xù)切片。切片經(jīng)60 ℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸鈉緩沖液煮沸修復(fù)抗原，室溫自然冷卻。5%正常山羊血清室溫封閉30 min，滴加CDK12、SIRT6 蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。次日，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育20 min。DAB 顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下拍照觀察。

結(jié)果判定：CDK12、SIRT6 蛋白陽性染色均定位于細(xì)胞核，呈淺黃色至棕褐色顆粒狀。染色強(qiáng)度評(píng)分：以陽性細(xì)胞呈色反應(yīng)為準(zhǔn)，無著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)200倍不重疊視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞比例。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0 分，陽性細(xì)胞比例≤10%為1 分，陽性細(xì)胞比例＞10%～30%為2 分，陽性細(xì)胞比例＞30%～50%為3 分，陽性細(xì)胞比例＞50%為4 分。根據(jù)染色程度和陽性細(xì)胞比例半定量分析，以染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞比例評(píng)分的乘積綜合評(píng)價(jià)。CDK12 蛋白表達(dá)評(píng)價(jià)［5］：≤3 為陰性表達(dá)，4～6 為弱陽性表達(dá)，7～9 為中度陽性表達(dá)，≥10 為強(qiáng)陽性表達(dá)。陰性、弱陽性表達(dá)視為CDK12 蛋白低表達(dá)，中度陽性、強(qiáng)陽性表達(dá)視為CDK12 蛋白高表達(dá)。SIRT6 蛋白表達(dá)評(píng)價(jià)［6］：≤1 為陰性表達(dá)，＞1 為陽性表達(dá)。

1.3 隨訪 所有患者出院后以電話或門診復(fù)查形式定期隨訪，隨訪截至患者死亡或出院后3年，統(tǒng)計(jì)患者生存情況，計(jì)算3年生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織CDK12、SIRT6 蛋白陽性表達(dá)比較 胃癌組織與癌旁正常組織CDK12蛋白陽性表達(dá)率分別為86.67%（65/75）、16.00%（12/75），SIRT6 蛋白陽性表達(dá)率分別為45.33%（34/75）、77.33%（58/75）。胃癌組織CDK12 蛋白陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織（χ2=82.986，P＜0.05），SIRT6 蛋白陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織（χ2=16.192，P＜0.05）。

2.2 胃癌組織CDK12、SIRT6 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 胃癌組織CDK12、SIRT6蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

2.3 胃癌組織CDK12、SIRT6 蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年，75例胃癌患者中死亡17例，3年生存率為77.33%（58/75）。75 例胃癌患者中，胃癌組織CDK12 蛋白高表達(dá)者42 例，死亡14 例，3年生存率為66.67%（28/42）；胃癌組織CDK12 蛋白低表達(dá)者33 例，死亡3 例，3年生存率為90.91%（30/33）。胃癌組織CDK12蛋白高表達(dá)者3年生存率顯著低于胃癌組織CDK12 蛋白低表達(dá)者（χ2=6.196，P＜0.05）。胃癌組織SIRT6 蛋白陽性表達(dá)者34 例，死亡4 例，3年生存率為88.24%（30/34）；胃癌組織SIRT6 蛋白陰性表達(dá)者41 例，死亡13 例，3年生存率為68.29%（28/41）。胃癌組織SIRT6 蛋白陽性表達(dá)者3年生存率顯著高于胃癌組織SIRT6 蛋白陰性表達(dá)者（χ2=4.217，P＜0.05）。

3 討論

胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌。我國是胃癌的高發(fā)國家之一，每年新發(fā)病例約50萬例。胃癌起病隱匿，早期癥狀輕微且不典型，大多數(shù)患者出現(xiàn)明顯癥狀就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)，預(yù)后較差［7-9］。有研究報(bào)道，我國胃癌患者5年生存率不足20%［10-11］。近年來，隨著分子生物學(xué)不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸受到重視，同時(shí)伴隨個(gè)體化治療理念的普及推廣，針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路調(diào)控因子的靶向治療在惡性腫瘤治療中的價(jià)值日益凸顯［12］。因此，分子靶向治療成為胃癌精準(zhǔn)治療的理想選擇。但由于胃癌發(fā)生的分子機(jī)制非常復(fù)雜，臨床上一直缺乏精準(zhǔn)的治療靶點(diǎn)。

CDK12 是一種與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶，能夠參與細(xì)胞的多種生理過程，如DNA 損傷修復(fù)、mRNA 剪接以及細(xì)胞增殖和分化等。有研究報(bào)道，CDK12 基因定位于人染色體17q12，其編碼蛋白在多種惡性腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)［13］。有研究報(bào)道，敲除CDK12可導(dǎo)致DNA損傷反應(yīng)敏感性改變［14］，提示CDK12 在DNA 損傷應(yīng)答及修復(fù)中具有重要的調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，CCL12 可調(diào)控與腫瘤浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的生物學(xué)功能，而CCL12 為CDK12 的下游效應(yīng)基因［15］。由此推測，CDK12 可能通過CCL12 相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織CDK12 蛋白陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織；胃癌組織CDK12 蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期、組織分化程度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、年齡、BMI、Lauren 分型、腫瘤直徑無關(guān)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織CDK12 蛋白高表達(dá)者3年生存率顯著低于胃癌組織CDK12蛋白低表達(dá)者。結(jié)果表明，胃癌組織CDK12 蛋白高表達(dá)，其高表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展并與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。

SIRT6 是一種具有多種催化活性的蛋白酶，可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子E2F1去乙?；瑥亩种破涔δ?。轉(zhuǎn)錄因子E2F1 在致癌信號(hào)和DNA 損傷的影響下可促使S 期細(xì)胞數(shù)量增加，并能抑制細(xì)胞凋亡。因此，SIRT6 可能具有抑制惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用［16］。此外，SIRT6 陽性表達(dá)有助于其形成二聚體并與多種結(jié)合酶結(jié)合，抑制Akt/RAS/MEK/ERK 信號(hào)通路激活，阻止細(xì)胞增殖、遷移，進(jìn)而預(yù)防細(xì)胞癌變；而SIRT6 陰性表達(dá)可促進(jìn)Wnt 信號(hào)通路激活，促進(jìn)β-連環(huán)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并與其靶點(diǎn)特異性結(jié)合，促進(jìn)抑制細(xì)胞凋亡基因過表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡失衡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［17］。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織SIRT6 蛋白陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織；胃癌組織SIRT6 蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期、組織分化程度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、年齡、BMI、Lauren 分型、腫瘤直徑無關(guān)；胃癌組織SIRT6 蛋白陽性表達(dá)者3年生存率顯著高于胃癌組織SIRT6 蛋白陰性表達(dá)者。結(jié)果表明，胃癌組織SIRT6蛋白低表達(dá)，其低表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展并與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。

綜上所述，胃癌組織CDK12 蛋白高表達(dá)、SIRT6蛋白低表達(dá)，二者表達(dá)變化與腫瘤臨床分期、組織分化程度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征以及患者預(yù)后密切相關(guān)。