宗利平，侯思偉，郝明玲，雷頎，劉方洲，王希浩

1.河南省直屬機(jī)關(guān)第二門診部，河南 鄭州 450004； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008

慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease，CPID)屬于盆腔慢性炎癥疾病，通常出現(xiàn)在女性患者群體中，存在于盆腔內(nèi)生殖器官、四周結(jié)締組織和盆腔腹膜位置，是女性的常見(jiàn)病、多發(fā)病，在我國(guó)成年女性中的發(fā)病率為40%以上，且這一比例在逐年上升[1]。慢性盆腔炎包括子宮炎、輸卵管卵巢炎、盆腔結(jié)締組織炎及盆腔腹膜炎[2]，可表現(xiàn)為慢性下腹部、腰背部疼痛或墜脹不適、月經(jīng)失調(diào)、痛經(jīng)[3-4]，其反復(fù)發(fā)作給女性生活帶來(lái)負(fù)面影響。本文在千金葦莖湯合桃紅四物湯治療慢性盆腔炎臨床療效的前提下，建立大鼠模型模擬慢性盆腔炎的發(fā)病歷程，探討千金葦莖湯合桃紅四物湯對(duì)模型大鼠子宮細(xì)胞間黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule-1，ICAM-1)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor of kappa B，NF-κB)及血清中白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的影響，進(jìn)一步分析中醫(yī)藥治療在抗炎、調(diào)節(jié)免疫及抗粘連方面的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)菌Wistar雌性大鼠100只，體質(zhì)量為(200±20)g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管委會(huì)倫理審批，倫理批號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第0002331號(hào)。所有大鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)、光線良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%。溶血性鏈球菌ATCC44815、致病性大腸菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923全部源自河南省中醫(yī)院細(xì)菌室。

1.2 藥物與試劑婦炎康片(廣州德鑫制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z44023648，產(chǎn)品批號(hào)：111005)；甲硝唑片(亞寶藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H14020964，產(chǎn)品批號(hào)：110119)；阿莫西林膠囊(哈藥集團(tuán)制藥總廠，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20044605，產(chǎn)品批號(hào)：A120102429)。IL-10、NO、NOS酶免試劑盒(上海勁馬生物科技有限公司，貨號(hào)：JB975-Ra、JB131-Ra、JB132-Ra)；NF-κB、ICAM-1免疫組化試劑盒(北京中杉生物工程公司，貨號(hào)：HB-T2171、LZ-R3552)；水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑制藥廠，批號(hào)：W20101029)。

1.3 儀器BS224S型電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；大容量低速冷凍離心機(jī)(上海中科生物醫(yī)學(xué)高科技開(kāi)發(fā)有限公司)；EB-2800M LIBROR型電子天平(日本島津制作所)；HG3003-3型攤片烤片機(jī) (南京電器三廠)；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)；Biosens Digital Imaging System v1.6型分析儀(上海富山科學(xué)儀器有限公司)；冰柜(海爾電器有限公司)；DHG-9031電熱恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備千金葦莖湯合桃紅四物湯由薏苡仁、桃仁、冬瓜仁、葦莖、黃芪、當(dāng)歸、生地黃、赤芍、蒲公英、敗醬草等多種藥物組成，由河南省中醫(yī)藥研究院制劑室提供，并經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院鑒定合格。將上述飲片浸泡30 min后，武火煮沸，再文火煎煮 30 min，過(guò)濾取液；另煎藥渣取液，2次濾汁混合，煎煮濃縮之后得到濃度為含生藥量1.24 g·mL-1的浸膏，高溫消毒后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 致病菌培養(yǎng)把溶血性鏈球菌ATCC44815、大腸桿菌ATCC25922與金黃色葡萄球菌ATCC25923按照1：2：1比例全部接種到含營(yíng)養(yǎng)瓊脂的血平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h之后，使用2 mL無(wú)菌蒸餾水稀釋菌液，選取經(jīng)過(guò)24 h培育的菌株，使用標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙葷?相當(dāng)于30億個(gè)菌)得到所需混合菌液4.5×106mL-1，該操作在河南省中醫(yī)院細(xì)菌培養(yǎng)室完成。

2.3 動(dòng)物分組、造模與給藥隨機(jī)從100只Wistar雌性大鼠中取出22只作為正常組(10只)和假手術(shù)組(12只)，剩余78只大鼠進(jìn)行造模。大鼠禁食禁水24小時(shí)后，稱量每只大鼠的體質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)。采用10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠加固到操作臺(tái)上，剃去大鼠腹部被毛，以碘伏消毒，在無(wú)菌環(huán)境下，于大鼠的下腹部正中給予長(zhǎng)約0.8～1.0 cm切口，暴露子宮，使用機(jī)械損傷法用 1 mL 無(wú)菌注射器對(duì)子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行損傷后朝左側(cè)子宮卵巢灌輸0.1 mL菌液[5]；右側(cè)不進(jìn)行任何操作，正?？p合。假手術(shù)組大鼠卵巢內(nèi)灌輸0.1 mL蒸餾水，其他同上。正常組大鼠不做任何處理。術(shù)后第5天、第10天、第20天及第30天分別隨機(jī)選擇3只造模大鼠進(jìn)行觀察，當(dāng)大鼠出現(xiàn)盆腔充血、炎性腫脹，盆腔內(nèi)有明顯纖維組織粘連，子宮充血，甚至宮腔積水，子宮彈性減弱，變硬等炎性改變時(shí)視為造模成功。此外，造模大鼠分別在術(shù)后第1天、第3天、第9天各死亡2只，假手術(shù)組大鼠在術(shù)后第1天死亡2只，總計(jì)死亡20只。將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為模型組、千金葦莖湯合桃紅四物湯高劑量組、千金葦莖湯合桃紅四物湯中劑量組、千金葦莖湯合桃紅四物湯低劑量組、婦炎康組及阿莫西林+甲硝唑組，每組10只。千金葦莖湯合桃紅四物湯高、中、低劑量組大鼠分別以24.8 g·kg-1、12.4 g·kg-1、6.2 g·kg-1的劑量灌胃給予千金葦莖湯合桃紅四物湯溶液，婦炎康組大鼠以0.4 g·kg-1的劑量灌胃給予婦炎康片溶液，阿莫西林+甲硝唑組大鼠灌胃給予0.07 g·kg-1阿莫西林和0.04 g·kg-1甲硝唑混合溶液，正常組、假手術(shù)組及模型組大鼠灌胃給予等體積去離子水，灌胃體積均為20 mL·kg-1，每日灌藥2次，連續(xù)給藥30 d。

2.4 檢測(cè)血清中炎癥因子給藥結(jié)束后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，無(wú)菌條件下暴露腹主動(dòng)脈，采血5～8 mL，4 ℃、2 000 r·min-1離心15 min，取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)大鼠血清內(nèi)IL-10、NO、NOS含量。血清標(biāo)本制作過(guò)程中，婦炎康組和假手術(shù)組各發(fā)生標(biāo)本溶血1份。

2.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠子宮組織NF-κB、ICAM-1的表達(dá)水平無(wú)菌環(huán)境下將大鼠子宮組織分為2部分，分別置于固定液中備用，免疫組化法檢測(cè)組織中NF-κB、ICAM-1的表達(dá)水平，具體步驟如下：①切片脫蠟至水，PBS沖洗3次，每次 5 min；②檸檬酸抗原修復(fù)10 min，等待自然冷卻；③PBS浸泡3次，每次5 min；④室溫下3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min；⑤PBS浸泡3次，每次 5 min；⑥滴加山羊血清50 μL/片，封閉內(nèi)源性生物素，室溫下孵育 20 min；⑦甩除山羊血清，勿洗，滴加一抗(兔多隆抗體)50 μL/片，4 ℃條件下孵育過(guò)夜；⑧PBS浸泡3次，每次5 min；⑨37 ℃下滴加二抗(抗兔IgG)50 μL/片，孵育30 min；⑩PBS浸泡3次，每次5 min；37 ℃條件下滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記卵霉鏈白素50 μL/片，孵育30 min；PBS浸泡3次，每次5 min；DAB顯色，顯微鏡下控制染色并用自來(lái)水中止；用蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水；二甲苯透明，應(yīng)用中性樹(shù)膠封片，測(cè)定NF-κB、ICAM-1水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清IL-10、NO和NOS含量比較與正常組比較，模型組大鼠血清中NO、NOS水平明顯升高(P<0.01)，IL-10水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，千金葦莖湯合桃紅四物湯中、高劑量組大鼠血清中NO、NOS水平明顯降低(P<0.01)，IL-10水平明顯升高(P<0.01)；千金葦莖湯合桃紅四物湯低劑量組大鼠血清中NO水平明顯降低(P<0.05)，IL-10水平明顯升高(P<0.05)。與婦炎康組、阿莫西林+甲硝唑組比較，千金葦莖湯合桃紅四物湯高劑量組大鼠血清中NO、NOS水平明顯降低(P<0.05)，千金葦莖湯合桃紅四物湯高、中劑量組大鼠血清中IL-10含量明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清IL-10、NO和NOS含量比較

3.2 各組大鼠子宮組織NF-κB蛋白表達(dá)水平比較與正常組比較，模型組大鼠子宮組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，千金葦莖湯合桃紅四物湯各劑量組大鼠子宮組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與婦炎康組、阿莫西林+甲硝唑組比較，千金葦莖湯合桃紅四物湯高、中劑量組大鼠子宮組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖1。

注：A：正常組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：千金葦莖湯合桃紅四物湯高劑量組；E：千金葦莖湯合桃紅四物湯中劑量組；F：千金葦莖湯合桃紅四物湯低劑量組；G：婦炎康組；H：阿莫西林+甲硝唑組圖1 各組大鼠子宮組織NF-κB免疫組化檢測(cè)圖(×200)

3.3 各組大鼠子宮組織中ICAM-1蛋白表達(dá)水平比較與正常組比較，模型組大鼠子宮組織中ICAM-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，千金葦莖湯合桃紅四物湯各組大鼠子宮組織ICAM-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖2。

表2 各組大鼠子宮組織中NF-κB、ICAM-1蛋白表達(dá)水平比較

注：A：正常組；B：模型組；C：假手術(shù)組；D：千金葦莖湯合桃紅四物湯高劑量組；E：千金葦莖湯合桃紅四物湯中劑量組；F：千金葦莖湯合桃紅四物湯低劑量組；G：婦炎康組；H：阿莫西林+甲硝唑組圖2 各組大鼠子宮組織中ICAM-1免疫組化檢測(cè)圖(×200)

4 討論

慢性盆腔炎為源自盆腔的急性炎癥，也是促炎、抗炎因子失衡與身體免疫調(diào)節(jié)導(dǎo)致的結(jié)果[6]，主要癥狀是結(jié)締組織的增生粘連導(dǎo)致輸卵管輕度充血、腫脹等，進(jìn)一步與四周組織粘連，可引起不孕不育、異位妊娠以及盆腔疼痛等負(fù)面問(wèn)題[7]，嚴(yán)重影響婦女的生殖健康[8]。目前，臨床多采用抗生素進(jìn)行治療，但抗生素對(duì)慢性盆腔炎所產(chǎn)生的粘連、疼痛和血液循環(huán)障礙等的效果并不理想[9]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療慢性盆腔炎具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，療效良好[10-11]。

中醫(yī)學(xué)無(wú)慢性盆腔炎這一病名，而是依據(jù)臨床癥狀將其劃分到“婦人腹痛、不孕癥、帶下病”的范疇[12]，認(rèn)為該病多由行經(jīng)后或產(chǎn)后胞門虛弱開(kāi)闔，風(fēng)、寒、濕、熱、毒等之邪氣乘虛內(nèi)侵下焦，與沖任搏結(jié)留滯而瘀[13]，其致病機(jī)理主要包括濕熱、氣滯、血瘀等[14]。濕熱瘀虛彼此為對(duì)方的因果，相互交織為病，造成盆腔粘連、增生以及炎性包塊，這也是不可忽視的病理機(jī)制?；诖?，本研究團(tuán)隊(duì)提出健脾益氣利濕、活血解毒消癰的治療理念。千金葦莖湯合桃紅四物湯中薏苡仁、桃仁健脾除濕、活血祛瘀、解毒消癰，共為君藥；臣藥冬瓜仁、葦莖、生地黃助薏苡仁解毒消癰排膿之功；佐用黃芪扶助正氣、以利活血化瘀、消癰排毒之功；全方合用以湊健脾益氣利濕、活血解毒消癰之功效。

千金葦莖湯合桃紅四物湯解毒逐瘀排膿效果極佳，現(xiàn)代藥理研究表明，葦莖具有較強(qiáng)的解毒消炎作用[15]。桃仁提取物可顯著減少纖維肝內(nèi)的纖維間隔，有利于肝組織修復(fù)[16]。赤芍總苷下調(diào)Bcl-2、c-myc基因表達(dá)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。蒲公英具有抗菌[18]、抗氧化[19]、抑制腫瘤[20]等多種藥理學(xué)作用。NF-κB在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用，其在炎癥部位高度表達(dá)，研究表明，NF-κB作為一種存在于多種細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，能夠接受外界信息而快速活化，啟動(dòng)炎性因子促進(jìn)相應(yīng)蛋白質(zhì)合成，從而在炎癥反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用。NF-κB在受到創(chuàng)傷、感染、休克時(shí)被激活，并不斷激活下游的細(xì)胞因子(NO、NOS、TNF-α、TNF-β、ICAM-1、IL-2、IL-6、IL-8 IL-10等)[21]，使各類炎性介質(zhì)產(chǎn)生過(guò)多，從而引起一系列炎癥反應(yīng)。千金葦莖湯合桃紅四物湯可明顯降低大鼠子宮組織中NF-κB水平，抑制炎癥發(fā)展；還可抑制NO、NOS的合成，減少其產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。ICAM-1在慢性炎癥中可誘導(dǎo)組織損傷及局部組織慢性纖維化過(guò)程[22]，慢性盆腔炎組織中ICAM-1表達(dá)增加，證明ICAM-1參與了慢性炎癥及纖維化過(guò)程[23]，千金葦莖湯合桃紅四物湯通過(guò)降低子宮組織中ICAM-1的表達(dá)水平，明顯減輕局部組織損傷，改善局部組織增生、纖維化，降低慢性盆腔炎引起的組織粘連，盆腔包塊，這與楊堃[24]的研究結(jié)果相似。千金葦莖湯合桃紅四物湯可升高慢性盆腔炎大鼠血清IL-10水平，而 IL-10作為一種內(nèi)源性的抑炎因子，在炎癥負(fù)反饋調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵性作用，具有減輕炎癥細(xì)胞過(guò)度活化，抑制炎癥發(fā)展的作用[25]。機(jī)體在外來(lái)刺激作用下促炎因子(NF-κB、ICAM-1、IL-2等)被激活的同時(shí)，IL-10也被激活，抑制促炎因子的產(chǎn)生。IL-10通過(guò)調(diào)控NF-κB通路減輕炎癥細(xì)胞過(guò)度活化，抑制炎癥發(fā)展[26]，提示千金葦莖湯合桃紅四物湯的治療機(jī)制一方面是抑制炎癥因子 NF-κB 及其下游炎癥介質(zhì)NO和NOS的水平，遏制組織纖維化；另一方面又通過(guò)提高IL-10水平，增強(qiáng)自身免疫力。

綜上所述，千金葦莖湯合桃紅四物湯可改善盆腔血液循環(huán)，抑制體內(nèi)炎性反應(yīng)及纖維組織增生，提高機(jī)體免疫應(yīng)答，改善慢性盆腔炎。