岳怡明,皇昊,陳中原,盧玲,劉云章

(中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東 青島 266003)

眾所周知，氧氣是許多生化代謝途徑的電子受體，細(xì)胞需要持續(xù)的氧氣供應(yīng)作為代謝反應(yīng)的底物。當(dāng)氧濃度降低時，機(jī)體通過激活低氧信號通路來調(diào)控一系列生理病理活動。而低氧信號通路中低氧誘導(dǎo)因子(HIF)的發(fā)現(xiàn)，則開創(chuàng)了一個全新的研究領(lǐng)域，具有重要的理論價(jià)值和巨大的應(yīng)用潛力。HIF通過調(diào)節(jié)數(shù)百個基因的轉(zhuǎn)錄來維持每個細(xì)胞中氧的供需平衡，尤其是在腫瘤細(xì)胞中，HIF影響腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、轉(zhuǎn)移、侵入和凋亡。在研究過程中，如果直接將HIF-1作為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物的研發(fā)設(shè)計(jì)，可能會造成藥物的副作用，若以相互作用蛋白為研究靶點(diǎn)，對疾病的治療可能會更加有效。本文對近年來發(fā)現(xiàn)的與HIF-1α相互作用的分子及其作用機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)。

1 HIF-1的分子結(jié)構(gòu)

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β這兩個亞基組成，每一個亞基都包含基本的helix-loop-helix(bHLH)和Per-ARNT-Sim(PAS)結(jié)構(gòu)域，它們共同介導(dǎo)兩個亞基二聚化及其與DNA的結(jié)合[1-2]。其中的HIF-1α是可以響應(yīng)氧氣調(diào)控的亞基，共編碼826個氨基酸，其編碼基因定位于人染色體14q21-q24。HIF-1α蛋白N端含有bHLH結(jié)構(gòu)域、PAS-A和PAS-B結(jié)構(gòu)域；HIF-1α蛋白C端含有氧依賴的降解結(jié)構(gòu)域(ODD)以及NAD(N-terminal activation domain)和CAD(C-terminal activation domain)兩個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域；大概576～785位的氨基酸為抑制結(jié)構(gòu)域(ID)，此結(jié)構(gòu)域可以降低HIF-1α蛋白轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的活性，特別是在常氧條件下更加明顯。HIF-1β是芳基碳?xì)浠衔锖宿D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ARNT)，其編碼基因定位于人染色體1q21-24，HIF-1β可以和不同的bHLH-PAS蛋白質(zhì)二聚化，但不能響應(yīng)氧氣的變化[3]。

2 HIF-1的功能

在正常氧濃度環(huán)境中，HIF-1α的半衰期很短，在生物細(xì)胞中不停地合成與降解。在低氧條件下，HIF-1α的ODD中有兩個特殊的脯氨酸殘基(Pro402和Pro564)能夠被脯氨酰羥化酶(PHD)識別并羥基化，與腫瘤抑制蛋白(pVHL)結(jié)合，pVHL復(fù)合體能招募elongin-C/elongin-B/cullin-2 E3泛素蛋白連接酶復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致HIF-1α的26S蛋白酶體降解[4]。同樣，HIF抑制因子(FIH)是一種2-氧戊二酸和亞鐵離子依賴的雙加氧酶，它以一種依賴于氧的方式控制HIF的轉(zhuǎn)錄活性，也具有羥基化作用。FIH可以通過調(diào)節(jié)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性來發(fā)揮對HIF-1α的調(diào)節(jié)作用，HIF-1α的天冬酰胺被羥基化后，可阻斷轉(zhuǎn)錄輔助激活因子CBP/p300與TAD的結(jié)合，抑制下游基因的激活。已知公認(rèn)的經(jīng)典的低氧信號通路由PHD和FIH共同作用，F(xiàn)IH通過調(diào)節(jié)氧化，與PHD/pVHL通路協(xié)同作用，加速HIF介導(dǎo)的低氧代謝反應(yīng)[5-6]。然而，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)HIF-1的活性與HIF-1α和其他蛋白之間的相互作用息息相關(guān)，這些相互作用的蛋白不斷擴(kuò)充著低氧信號通路[7]。到目前為止，研究已證明有大量蛋白與HIF-1α相互作用。在這些相互作用的蛋白質(zhì)中，相互作用位點(diǎn)定位于特定的氨基酸殘基或HIF-1α的特殊結(jié)構(gòu)域，例如bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域(在氨基酸殘基1～390位)[1-2]、PAS-B子結(jié)構(gòu)域(在氨基酸殘基200～330位)[8]、ODD(在氨基酸殘基390～575位)[9]、CAD(在氨基酸殘基786～826位)[9]。

HIF-1α具有調(diào)節(jié)機(jī)體氧氣運(yùn)輸、血管生成和糖酵解的功能，同時它通過上調(diào)涉及腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移的基因的表達(dá)在腫瘤(乳癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤、腎癌等)低氧中發(fā)揮重要作用[10]。研究與HIF-1α相互作用的蛋白可以更好地了解疾病發(fā)生及其相關(guān)信號通路的調(diào)控機(jī)制，研究人員對相關(guān)蛋白功能的了解越精確，就越有可能為更多的疾病提供相應(yīng)藥物以及靶向治療對策。例如，阿斯利康的新型治療貧血藥物羅沙司他，作為全球首個小分子HIF PHD抑制劑(HIF-PHI)，已于2018年12月率先在中國獲批上市。同樣都是PHD抑制劑，葛蘭素史克的治療慢性腎病貧血的daprodustat(GSK1278863)也緊隨其后，在不同國家和地區(qū)提交了上市申請[11]。此外，針對HIF-1α和HIF-2α的特異性抑制劑，也正在進(jìn)行腎癌等腫瘤適應(yīng)證的早期臨床研究。

3 HIF-1α的相互作用蛋白及作用機(jī)制

3.1 影響HIF-1α氧氣依賴的蛋白降解

在HIF-1α氧氣依賴的經(jīng)典降解途徑中，一部分與HIF-1α相互作用的蛋白可以通過穩(wěn)定HIF-1α與其羥基化復(fù)合物之間的相互作用或刺激羥基化的HIF-1α泛素化過程，從而實(shí)現(xiàn)對HIF-1α的降解調(diào)控；也有一些與HIF-1α相互作用的蛋白通過抑制pVHL-E3泛素連接酶復(fù)合體或催化去泛素化來調(diào)控HIF-1α依賴于氧氣的降解過程[12-19]。這些依賴于O2/PHDs/pVHL途徑調(diào)控HIF-1α的相互作用蛋白見表1。

表1 依賴O2/PHDs/pVHL途徑調(diào)控的相互作用蛋白

HICKS等[12]認(rèn)為，Sprouty同源物2蛋白(SPYR2)充當(dāng)了HIF-1α和pVHL降解復(fù)合物之間的橋梁，從而提高pVHL的局部濃度，促進(jìn)低氧狀態(tài)下HIF-1α的泛素化降解。SPYR2對HIF-1α的調(diào)節(jié)最終轉(zhuǎn)化為對HIF-1α下游靶基因和葡萄糖攝取的調(diào)節(jié)，因此SPYR2通過調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白水平和基因轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮其抑癌作用，當(dāng)SPYR2在某些癌癥中表達(dá)減少或丟失時，HIF-1α的下游靶基因表達(dá)升高，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。KOZLOVA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，含SH3結(jié)構(gòu)域的激酶結(jié)合蛋白1(CIN85)是PHD2的新型結(jié)合伴侶，CIN85的N端結(jié)構(gòu)域與PHD2的N端結(jié)構(gòu)域中的脯氨酸、精氨酸富集區(qū)相互作用，可抑制PHD2的活性，從而抑制HIF-1α的降解。泛素C末端水解酶L1(UCHL1)與HIF-1α相互結(jié)合可以阻止pVHL與HIF-1α的直接結(jié)合，而且低氧可以增強(qiáng)兩者的相互作用，兩者的結(jié)合抑制了pVHL介導(dǎo)的HIF-1α的泛素化[14]。

近年來，隨著基因組測序分析技術(shù)飛速發(fā)展，越來越多的長鏈非編碼RNA(lncRNA)通過基因組大規(guī)模的深度測序和轉(zhuǎn)錄組分析被鑒定出來。lncRNA在生物生命過程中起著廣泛而重要的作用，它們可以通過多種機(jī)制以順式調(diào)節(jié)或反式調(diào)節(jié)的方式影響基因的表達(dá)。中山大學(xué)宋爾衛(wèi)院士課題組發(fā)現(xiàn)了可穩(wěn)定HIF-1α的lncRNA(HISLA)，HISLA能阻止PHD2與HIF-1α的相互作用，從而抑制HIF-1α的羥基化和降解[20]。有研究結(jié)果表明，lncRNA TUG1也可以靶向HIF-1α，其表達(dá)減少可以抑制肺腺癌細(xì)胞的生長[21]。lncRNA作為潛在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物，通過囊泡在免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間傳播，從而促進(jìn)癌癥的有氧糖酵解。

3.2 影響HIF-1α非氧氣依賴的蛋白降解

在與HIF-1α相互作用的蛋白中，有一些蛋白對HIF-1α的作用獨(dú)立于依賴VHL的經(jīng)典降解途徑，這些蛋白對HIF-1α的調(diào)控作用不依賴氧氣的存在，其作用途徑包括增加泛素化及類泛素化修飾、通過蛋白酶體降解的新途徑以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬(HIF-1α的溶酶體降解)；在不依賴氧氣的情況下，一部分與HIF-1α相互作用的蛋白也可以通過調(diào)節(jié)泛素化或催化去SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修飾來抑制HIF-1α的降解[22-30]。見表2。

表2 通過非氧氣依賴途徑調(diào)控的相互作用蛋白

基本螺旋-環(huán)-螺旋家族成員E41(BHLHE41)最早是由MONTAGNER等[24]發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)立于HIF-1α的pVHL泛素化降解途徑之外的蛋白，它可以促進(jìn)HIF-1α與蛋白酶體的結(jié)合，從而導(dǎo)致HIF-1α蛋白酶體降解。同樣重要的蛋白還有熱休克蛋白70羧基末端反應(yīng)蛋白(CHIP)，該蛋白作為E3泛素連接酶，在介導(dǎo)蛋白酶體或溶酶體系統(tǒng)底物降解的分類決定中起著關(guān)鍵作用。LUO等[31]研究認(rèn)為，HIF-1α可以與熱休克蛋白70(HSP70)相互作用，并且通過募集E3泛素連接酶CHIP促進(jìn)了在長時間低氧時HIF-1α的降解，這就是CHIP介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑。CHIP同時可以參與HIF-1α溶酶體降解途徑，F(xiàn)ERREIRA等[26]最早研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以進(jìn)行伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬降解。

3.3 影響HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性

另一大組與HIF-1α相互作用的蛋白可以作為共激活物或共抑制物來調(diào)節(jié)由HIF-1α介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程，同時，許多與HIF-1α相互作用的蛋白通過促進(jìn)或抑制HIF-1α與其他蛋白的相互作用來調(diào)節(jié)HIF-1α的活性，這些與HIF-1α相互作用的蛋白具有催化活性，如乙?；⑷ヒ阴；?、去甲基化、磷酸化或泛素化，導(dǎo)致HIF-1α翻譯后修飾，從而影響HIF-1α的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位或轉(zhuǎn)錄激活功能[32-40]。見表3。

表3 調(diào)節(jié)HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活的相互作用蛋白

LEE等[32]認(rèn)為，在低氧條件下，Akt信號通路被激活，誘導(dǎo)糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的第9位絲氨酸殘基磷酸化，GSK3β沉默導(dǎo)致貨物接頭蛋白1(BICD1)和HIF-1α之間的相互作用，HIF-1α被誘導(dǎo)入核，發(fā)揮對其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。甲基轉(zhuǎn)移酶G9a是Suv39h蛋白家族的一個重要成員。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的甲基轉(zhuǎn)移酶中，G9a和GLP是組蛋白H3(H3K9me1和H3K9me2)的Lys 9位點(diǎn)單、二甲基化的主要酶，主要以G9a-GLP異聚體復(fù)合物的形式存在。近年來，許多重要研究認(rèn)為G9a和GLP在各種生物過程中起著關(guān)鍵作用，它們介導(dǎo)表觀遺傳基因調(diào)控的生理相關(guān)性功能。BAO等[36]研究發(fā)現(xiàn)，G9a-GLP與HIF-1α相互作用并在體外和體內(nèi)直接催化HIF-1α的K674的單甲基化或二甲基化。G9a-GLP介導(dǎo)的K674甲基化可降低HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞中HIF-1α下游靶基因的表達(dá)，抑制GBM細(xì)胞的遷移能力。在表觀遺傳調(diào)控方面，CHEN等[38]的研究結(jié)果證實(shí)，溴區(qū)結(jié)合蛋白(ZMYND8)可以與HIF-1α和HIF-2α相互作用，通過增加BRD4的募集和釋放暫停的RNA聚合酶Ⅱ增加HIF下游癌癥基因的表達(dá)。

4 HIF-1α與癌癥的關(guān)系

HIF-1α在多種疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，包括腫瘤、腦缺血、肺動脈高壓、糖尿病等，尤其在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中至關(guān)重要，其活性的增加促進(jìn)了腫瘤血管生成相關(guān)基因、代謝相關(guān)基因的表達(dá)，同時也為癌細(xì)胞對低氧的其他適應(yīng)提供了分子基礎(chǔ)[41]。

腎細(xì)胞癌(RCC)是一種常見的惡性腫瘤，全球腎癌每年導(dǎo)致大于10 0000人死亡。腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)與pVHL息息相關(guān)，ccRCC一般都存在兩個pVHL等位基因失活，導(dǎo)致pVHL對HIF的降解功能喪失。在VHL缺陷的RCC異種移植物中重新表達(dá)pVHL會減緩腫瘤的生長，證實(shí)VHL是真正的腫瘤抑制基因。迄今為止，pVHL最具特征的靶標(biāo)是HIF的α亞基。pVHL功能的喪失導(dǎo)致HIF-1α的穩(wěn)定，因此RCC中pVHL的喪失與HIF的激活及其轉(zhuǎn)錄激活緊密相關(guān)[42]。有研究者使用不同的基因組平臺調(diào)查了400多例腎癌腫瘤樣本，結(jié)果顯示PI3K/Akt信號通路突變率很高，表明該途徑是潛在的治療靶點(diǎn)[43]。染色質(zhì)修飾基因在ccRCC中高頻的突變?yōu)楹诵◇w動力學(xué)模型的建立提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，該模型在腎癌發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。盡管有關(guān)這種調(diào)節(jié)如何促進(jìn)腎癌細(xì)胞形成的具體機(jī)制尚待確定，但已有的數(shù)據(jù)揭示了與SETD2基因突變相關(guān)的DNA甲基化的改變[44]。作為可以有效改變許多轉(zhuǎn)錄輸出的表觀遺傳過程，這些突變可能通過改變整體基因和遺傳元件的表達(dá)來改變腫瘤的基因組。PI3K/Akt途徑是ccRCC未來的一個治療靶點(diǎn)，像哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路或相關(guān)途徑抑制劑對ccRCC的治療具有潛在價(jià)值[43]。

乳癌是近幾年研究較多的癌癥類型，特別是三陰性乳癌(TNBC，侵襲性最強(qiáng)的乳癌類型之一)在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢，病死率不斷上升。眾多研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在乳癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)并且與乳癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[45]。有研究闡明了BHLHE41和HIF-1α之間的相互作用機(jī)制，這就為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并且已經(jīng)在TNBC中得到驗(yàn)證。在乳癌細(xì)胞中，ZMYND8通過增加BRD4的募集和釋放暫停的RNA聚合酶Ⅱ增加了HIF下游癌癥基因的表達(dá)，在這個過程中，ZMYND8對p300的1 007和1 034位賴氨酸的乙酰化促進(jìn)了乳癌的生長和轉(zhuǎn)移，這為診治乳癌提供了可能的分子靶標(biāo)[38]。有研究表明，表皮生長因子受體(EGFR)銜接子蛋白CIN85可以促進(jìn)乳癌惡化和HIF的穩(wěn)定性，這項(xiàng)研究使以前無法識別的腫瘤生長檢查點(diǎn)得以發(fā)現(xiàn)，該檢查點(diǎn)受CIN85-PHD2調(diào)控，并將生長因子受體與低氧信號通路聯(lián)系起來，對腫瘤的生存至關(guān)重要[13]。UCHL1在臨床中可以促進(jìn)癌癥的轉(zhuǎn)移，與乳癌和肺癌病人的不良預(yù)后密切相關(guān)，未來也可用作癌癥的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[14]。

胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第3大原因，東亞地區(qū)的發(fā)病率極高，一旦發(fā)現(xiàn)多數(shù)被診斷為晚期[46]。因此，研究胃癌的致病機(jī)制并尋找有效的腫瘤標(biāo)志物以提高早期診斷率成為了重中之重。CHEN等[47]的研究表明，lncRNA HIF1A-AS2的高表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)，HIF1A-AS2敲降可抑制胃癌細(xì)胞的體外增殖能力，所以HIF1A-AS2在胃癌的早期診斷中可作為潛在診斷標(biāo)志物。

5 總結(jié)與展望

HIF-1是轉(zhuǎn)錄因子家族的一個重要成員，在調(diào)節(jié)機(jī)體氧的穩(wěn)態(tài)、生物體生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。在低氧腫瘤細(xì)胞尤其是實(shí)體瘤中HIF-1存在著過度表達(dá)，并控制下游上百種基因的表達(dá)，包括葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-1(GLUT-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、酪氨酸激酶(c-Met)等，影響腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、轉(zhuǎn)移、侵入和凋亡。許多與HIF-1α相互作用的蛋白是HIF-1靶基因的產(chǎn)物，參與前饋或反饋回路，從而放大或消除細(xì)胞對低氧的反應(yīng)。未來對HIF-1α調(diào)節(jié)因子的研究仍然是熱點(diǎn)，探究與HIF相關(guān)的基因和結(jié)合蛋白有望為臨床以及藥物研究提供新的方向和機(jī)遇。