邢菲菲，羅勝繽，溫小慶，曹一鳴，李美娟，羅春海，付世新

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

奶牛在圍產(chǎn)期由于胎兒生長(zhǎng)和產(chǎn)奶量的需要，能量需求大于攝于，易發(fā)生能量負(fù)平衡(negative energy balance,NEB)。這一階段因代謝方式轉(zhuǎn)變，體內(nèi)非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)的濃度大幅升高[1]。經(jīng)查閱資料得知，高濃度的NEFA對(duì)動(dòng)物和人類的生殖性能都有不利影響[2-3]，SWANGCHAN-UTHAI等[4]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)犢前最后1周高濃度的NEFA與胎衣不下(retained fetal membranes,RFM)的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，OSPINA等[5]則表明NEFA與酮病、子宮炎和乳腺炎等疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，與RFM的風(fēng)險(xiǎn)增加更為相關(guān)。RFM是奶牛在分娩后常見(jiàn)并且影響奶牛繁殖健康的疾病，其定義為分娩后12 h未能排出胎衣[6]。奶牛RFM的發(fā)生率為5%～50%，且夏天氣溫高時(shí)發(fā)病率會(huì)更高[7]。RFM的負(fù)面影響包括子宮復(fù)舊延遲、履配不孕、妊娠率下降等，而這些又會(huì)導(dǎo)致牛群因繁殖能力下降和產(chǎn)奶量減少造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，RFM還是繼發(fā)子宮炎、子宮內(nèi)膜炎、酮癥、皺胃變位和乳腺炎等疾病的危險(xiǎn)因素[8]。

胎衣排出的基礎(chǔ)是妊娠晚期的胎盤成熟，此時(shí)胎盤中血流減少血管收縮，子葉絨毛變小和塌陷，母體胎盤與胎兒胎盤處上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解重塑，最后經(jīng)過(guò)子宮的收縮，胎兒子葉與母體肉阜分離，胎盤得以及時(shí)分離排出[9]?，F(xiàn)如今公認(rèn)的RFM主要病理學(xué)基礎(chǔ)是胎盤組織ECM降解障礙，而母體和胎兒胎盤之間ECM中引起黏連的物質(zhì)主要是Ⅳ型膠原蛋白(collagen-Ⅳ,COL-Ⅳ)。林宏甲[10]的研究發(fā)現(xiàn)，與胎衣正常排出奶牛的胎盤相比，RFM奶牛的胎盤中COL-Ⅳ大量表達(dá)，降解膠原蛋白的主要膠原酶基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達(dá)水平顯著降低。也有報(bào)道認(rèn)為胎衣排出是一種炎癥過(guò)程，圍產(chǎn)期奶牛中性粒細(xì)胞功能受損及趨化性降低、炎癥反應(yīng)的改變與RFM有關(guān)[11]。與正常排出胎衣的奶牛相比，發(fā)生RFM的奶牛血液中白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor -α,TNF-α) 4種促炎細(xì)胞因子的濃度均顯著降低[8]。而且MMP-9在子宮收縮開(kāi)始時(shí)是由IL-8通過(guò)趨化因子受體-2誘導(dǎo)釋放，其分泌還觸發(fā)了TNF-α的快速釋放，TNF-α又可以募集中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞進(jìn)一步的誘導(dǎo)釋放MMP-2和MMP-9。妊娠末期胎盤處促炎細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞的大量涌入，通過(guò)調(diào)節(jié)了MMPs的分泌而調(diào)節(jié)ECM降解，進(jìn)而促使胎盤排出[12]。并且高濃度的NEFA會(huì)誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥和細(xì)胞凋亡[13]，在大鼠上還可以影響MMPs及其抑制劑之間的動(dòng)態(tài)平衡[14]。由此可見(jiàn)，MMPs的表達(dá)與活性受到NEFA的調(diào)控。

目前關(guān)于NEFA是如何影響奶牛RFM發(fā)生的研究很少，故本試驗(yàn)擬通過(guò)使用不同濃度的NEFA刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，來(lái)探討NEFA是否通過(guò)影響MMPs和炎性因子的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)胎盤處ECM的降解，進(jìn)而影響RFM的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 主要試劑棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自上海索萊寶公司；胎牛血清購(gòu)自四季青公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本TaKaRa公司；RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、彩色預(yù)染蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、二抗(兔抗鼠、山羊抗兔)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠源Anti-MMP-2單抗購(gòu)自美國(guó)Merck公司；鼠源Anti-MMP-9單抗購(gòu)自Cloud-Clone Corp公司；兔源Anti-Collagen Ⅳ多抗購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；鼠源Anti-β-actin多抗購(gòu)自中國(guó)博奧森公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)奶牛原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是由本實(shí)驗(yàn)室鄭程遠(yuǎn)等[15]利用貼壁法分離培養(yǎng)的，經(jīng)過(guò)純化后，純度可達(dá)90%以上。將凍存的細(xì)胞從液氮中拿出后迅速放入37℃水浴鍋中搖晃，融化的細(xì)胞懸液吸入到EP管中，4 min、1 000×g離心后棄上清。加入新的培養(yǎng)液混勻細(xì)胞團(tuán)，然后按適當(dāng)比例將細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，隔2 d傳代1次，在第3代后加藥刺激，準(zhǔn)備后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 NEFA刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，加入NEFA(含1.595 mmol/L棕櫚酸、0.720 mmol/L 硬脂酸、0.265 mmol/L棕櫚油酸、2.175 mmol/L 油酸、0.245 mmol/L亞油酸)刺激細(xì)胞。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的試驗(yàn)結(jié)果按添加的NEFA濃度設(shè)置分組[16]：對(duì)照組(0 mmol/L)、低濃度組(0.2 mmol/L)和高濃度組(1.2 mmol/L)。刺激12 h 后棄去舊培養(yǎng)液，胰酶消化下細(xì)胞，PBS洗2遍后棄去上清，留下底部細(xì)胞團(tuán)，以待后續(xù)RNA和蛋白質(zhì)的提取。

1.4 總RNA的提取提取RNA過(guò)程中所有耗材皆為無(wú)RNA酶耗材，在冰上操作。取TRIzol加入到每個(gè)EP管中，每孔1 000 μL。裂解5 min后吸取液體到EP管中，每管加入200 μL的氯仿，劇烈震蕩混勻，4℃、12 000×g離心10 min。小心吸取上層水相至新的EP管中，加入400 μL異丙醇，靜置10 min 后4℃、12 000×g離心10 min。棄上清，往管中沉淀加入75%的乙醇，輕輕上下混勻，4℃、7 500×g離心5 min。棄上清后再4℃、7 500×g離心5 min，用槍頭吸取殘余的液體，最后晾干EP管。往管中加入適量的DEPC水，拿去測(cè)定RNA濃度。

1.5 總蛋白的提取向收集的細(xì)胞團(tuán)中加入適量的RIPA裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物，冰上裂解30 min，每隔5 min震蕩離心管。然后4℃、12 000×g離心30 min，小心吸取上清液至新的EP管中，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度，加入PBS和Loading Buffer調(diào)整至相同濃度，煮沸10 min后-20℃保存。

1.6 qRT-PCR使用PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：4 μL的5×PrimeScript Buffer，1 μL的PrimeScript RT Enzyme MixⅠ、Oligo dT Primer、Random 6 mers，500 ng的總RNA，最后補(bǔ)加RNase Free dH2O至20 μL。將配置好的體系放入PCR儀中，37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃冷卻。得到的產(chǎn)物-20℃保存。引物設(shè)計(jì)和購(gòu)買來(lái)自上海生工生物工程有限公司，使用β-actin為內(nèi)參，qRT-PCR法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9，膠原蛋白COL-Ⅳ和炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的基因相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s，melt curve 65～95℃。2-△△Ct法分析試驗(yàn)結(jié)果。

表1 引物序列

1.7 Western blot將提取的蛋白樣品沸水煮5 min，冷卻室溫后將各組樣品與彩虹預(yù)染Marker分別加入到SDS-PAGE凝膠的孔中，每孔10 μL。80 V 電壓運(yùn)行30 min，然后調(diào)為120 V電壓運(yùn)行45 min。電泳后的凝膠采用300 mA、3 h濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上后，膜用5%脫脂奶粉封閉3 h，TBST洗2次，每次5 min。之后分別使用一抗Anti-MMP-2(1∶1 000稀釋)、Anti-MMP-9(1∶1 000稀釋)和Anti-Collagen Ⅳ(1∶500稀釋)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min。二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗3次后用凝膠成像分析系統(tǒng)照膜，Image Lab軟件分析條帶灰度值，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)分析qRT-PCR和Western blot試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算分析后的結(jié)果使用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(ANOVA分析)，“*”為差異顯著(P<0.05)，“**”為差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 NEFA對(duì)MMPs、COL-Ⅳ表達(dá)的影響如圖1所示，NEFA處理細(xì)胞12 h后，與對(duì)照組相比，在低濃度組0.2 mmol/L和高濃度組1.2 mmol/L時(shí)細(xì)胞內(nèi)MMP-2和COL-Ⅳ的mRNA表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，MMP-9的mRNA表達(dá)在高濃度時(shí)被極顯著下調(diào)(P<0.01)。Western blot的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高濃度組的MMP-2和COL-Ⅳ的蛋白表達(dá)極顯著上升(P<0.01)，MMP-9的蛋白表達(dá)極顯著下降(P<0.01)(圖2)。

*.與對(duì)照組相比P<0.05； **.與對(duì)照組相比P<0.01。下同

A.MMP-2、MMP-9、COL-Ⅳ的Western blot結(jié)果；B.MMP-2、MMP-9、COL-Ⅳ的蛋白表達(dá)水平

2.2 NEFA對(duì)各炎性因子表達(dá)的影響經(jīng)NEFA作用后，與對(duì)照組相比，炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表達(dá)在高濃度組均極顯著上調(diào)(P<0.01)，在低濃度組，IL-6的mRNA基因被極顯著上調(diào)(P<0.01)，IL-8和TNF-α的mRNA基因被顯著上調(diào)(P<0.05)(圖3)。

圖3 NEFA對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性因子基因表達(dá)的影響

3 討論

奶牛RFM的病因有很多，包括早產(chǎn)、難產(chǎn)、氧化應(yīng)激、礦物質(zhì)缺乏造成的營(yíng)養(yǎng)不良等等，且這些因素影響RFM發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制還不完全清楚。但不論是免疫系統(tǒng)的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、炎癥還是MMPs系統(tǒng)，最終影響的還是ECM的降解，可以說(shuō)ECM的降解程度才是胎衣排出的關(guān)鍵[12]。MMPs及其抑制劑—組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)家族可以調(diào)節(jié)ECM的組裝和降解[17-18]。其中MMPs里的明膠酶MMP-2和MMP-9在反芻動(dòng)物中有很好的表達(dá)。MMP-2能夠降解不同類型的膠原，包括Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ型明膠、彈性蛋白和纖維連接蛋白[19]。MMP-9可以降解Ⅳ和Ⅴ型膠原蛋白，存在于中性粒細(xì)胞的第三級(jí)顆粒中。有研究表明，RFM與非RFM奶牛胎盤中的蛋白酶存在差異，表明酶活性的改變?cè)赗FM的致病過(guò)程中起作用。例如，RFM奶牛胎盤中的MMP-2和MMP-9的活性下降[11]?？墒窃诒狙芯恐?，MMP-2和COL-Ⅳ的基因和蛋白表達(dá)均顯著升高，MMP-9的表達(dá)卻顯著下降。MMPs的表達(dá)對(duì)子葉和肉阜間的連接和胎盤的釋放很重要，NEFA處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后，本研究檢測(cè)到這些酶的表達(dá)跟之前的研究結(jié)果不完全一致，提示NEFA對(duì)細(xì)胞的影響可能還有別的方面，多種因素導(dǎo)致MMPs的活性表達(dá)出現(xiàn)了這樣的結(jié)果。但是在奶牛胎盤處的ECM中，COL-Ⅳ才是主要的膠原蛋白，而MMP-9是體內(nèi)降解COL-Ⅳ的主要基質(zhì)金屬蛋白酶，MMP-2雖然也可以降解COL-Ⅳ，但可能其在奶牛上與COL-Ⅳ的親和力不如MMP-9，或者M(jìn)MP-2還受到了其他物質(zhì)的調(diào)控。故本試驗(yàn)結(jié)果也表明了NEFA可能通過(guò)調(diào)節(jié)了MMP-2和MMP-9的表達(dá)，調(diào)節(jié)了ECM的降解，從而影響RFM的發(fā)生。

IL-1β被認(rèn)為是由各種類型的細(xì)胞分泌以應(yīng)對(duì)損傷或炎癥，并通過(guò)調(diào)節(jié)其吞噬活性(如黏附、細(xì)胞遷移、呼吸暴發(fā)、溶酶體酶釋放和細(xì)胞表面受體表達(dá))影響中性粒細(xì)胞，較低水平的IL-1β可能會(huì)損傷中性粒細(xì)胞的功能。IL-6在增強(qiáng)或限制免疫反應(yīng)方面具有復(fù)雜作用[20]，IL-6作為一種促炎因子，在某些情況下也可能抑制中性粒細(xì)胞的遷移。IL-8，也稱為中性粒細(xì)胞激活因子，是一種由多種細(xì)胞類型在脂多糖等炎癥刺激物存在下產(chǎn)生的細(xì)胞因子。IL-8還可引起宮頸擴(kuò)張和膠原酶分泌增加[21]，從而加速胎兒子葉與母體肉阜的分離[22]。而TNF-α在增強(qiáng)中性粒細(xì)胞功能方面具有重要作用，如中性粒細(xì)胞呼吸暴發(fā)和溶酶體酶釋放，以響應(yīng)各種可溶性和顆粒細(xì)胞刺激。這4種炎性因子都與中性粒細(xì)胞的功能相關(guān)，會(huì)影響胎衣排出時(shí)的炎癥反應(yīng)及MMP-2、MMP-9的釋放。因此低水平的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α在分娩后炎癥過(guò)程中負(fù)面調(diào)節(jié)了中性粒細(xì)胞的功能，減少了MMPs的分泌，這是影響胎衣排出的關(guān)鍵[8]。正常范圍內(nèi)的炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)MMPs的釋放，而過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能反而會(huì)損害細(xì)胞功能。在本試驗(yàn)結(jié)果中，4種炎性因子的基因表達(dá)都是上調(diào)的，猜測(cè)NEFA可能通過(guò)影響炎癥反應(yīng)的程度來(lái)誘導(dǎo)RFM的發(fā)生。

綜上所述，NEFA可直接通過(guò)降低MMP-9的表達(dá)，引起ECM降解障礙，并可通過(guò)增加炎性因子和MMP-2的表達(dá)，干擾ECM降解，但其具體的調(diào)控作用還有待于進(jìn)一步研究。