鄧涪元，喬中全，王曉明，李春霞，陸柳淑，李雪露，何 鋼*

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院 林木無性系育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

【研究意義】植物在生長發(fā)育過程中表現(xiàn)出不同的顏色主要取決于花青素和葉綠素?；ㄇ嗨厥亲匀唤缫活悘V泛存在于植物中的水溶性天然色素，植物中的主要呈色物質(zhì)大部分與之有關(guān)。花青素屬于黃酮類化合物，不同種類的花青素呈現(xiàn)的顏色不同，因此花青素的含量與種類直接影響著園藝植物的觀賞品質(zhì)。紫薇（Lagerstroemia indica）屬于桃金娘目（Myrtales）千屈菜科（Lythraceae）紫薇屬（Lagerstroemia），落葉或常綠灌木或小喬木[1-2]。紫薇品種繁多、色彩豐富，因其通常在盛夏開花且花期較長，故被廣泛用于公園、庭院建設(shè)和城市道路的綠化與裝飾等。近年來隨著人們生活品質(zhì)的提高，豐富多樣的園林綠化正成為城市建設(shè)的主流，因此對紫薇色彩的研究與選育具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物對于光的依賴，不僅是因?yàn)橹参锕夂献饔眯枰庾鳛槟芰?，光也是作為激活植物生長發(fā)育相關(guān)基因的重要信號之一。植物通過不同的光感受器感知光信號，并影響多種發(fā)育過程，包括幼苗光形態(tài)發(fā)生，種子發(fā)芽以及避蔭和光周期反應(yīng)。植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的光調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，這些轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)著光發(fā)育變化[3]。Elongated hypocotyl 5（HY5）是光信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，它隸屬于bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族，通過直接與光誘導(dǎo)基因的啟動子結(jié)合參與調(diào)控光形態(tài)建成、葉綠體發(fā)育和色素積累等生物學(xué)過程[4-6]。在擬南芥中，AtHY5在介導(dǎo)光激活花青素積累和CHS基因表達(dá)方面發(fā)揮了積極作用，AtHY5可以直接激活CHS、DFR等花青素結(jié)構(gòu)基因啟動子促進(jìn)花青素積累。在體外，AtHY5通過G-box 基序特異性結(jié)合CHS1 啟動子的最小光響應(yīng)啟動子單元[7]。蘋果中的MdHY5可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子MdMYB10基因啟動子區(qū)域的G-box 元件，進(jìn)而調(diào)控花青素合成途徑中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，這表明MdHY5能與轉(zhuǎn)錄因子的上游元件相互作用，從而直接或間接促進(jìn)蘋果花青素的合成[8]；在血橙中，血橙果皮中花青素的積累由CsRuby1啟動子內(nèi)的G-Box（CACGTC）調(diào)節(jié)。HY5通過與G-Box 結(jié)合來正向調(diào)節(jié)MYB 家族Ruby1 的轉(zhuǎn)錄[9]。此外，草莓[10]、葡萄[11]、桃[12]和茄子[13]等多種植物中的其他HY5基因也被證明能促進(jìn)光誘導(dǎo)的花青素的生物合成和積累?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】‘丹紅紫葉’是由湖南省林業(yè)科學(xué)院以美國紫葉紫薇為試驗(yàn)材料，選育出的優(yōu)良新品種[14]?！ぜt紫葉’葉色穩(wěn)定，在正常光照下幼嫩時期葉片為紫紅色，葉片展開后顏色由紫紅色加深至黑紫色，成熟葉片葉色維持在穩(wěn)定的黑紫色不變[15]。【擬解決的關(guān)鍵問題】鑒于HY5基因在植物光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要性，本研究通過紫薇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆出1個LiHY5基因，并進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析與不同光質(zhì)影響下的基因表達(dá)量的測定，同時在煙草中進(jìn)行了亞細(xì)胞定位。為深入研究紫薇LiHY5基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物材料：試驗(yàn)所用‘丹紅紫葉’紫薇種植于湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)林場。選擇紅光（R，730 nm）、藍(lán)光（B，450 nm）、紅藍(lán)組合光（R∶B，1∶1）處理，以白光（W）作為對照。LED光源用扎帶固定在植株頂部，用黑色遮光布遮擋，植株與光源距離可調(diào)，光暗周期的溫度為25 ℃/16 ℃，光照時間用計時器設(shè)定為12 h/d（06:00—18:00）。選取長勢基本一致無病斑、蟲害的扦插苗（苗高約40 cm），剪去多余的枝條，單株移栽到裝有育苗基質(zhì)的塑料盆中，每個光源處理10 株，每種處理植株重復(fù)3 次，置于不同LED 光源下，7，14，21，28 d后隨機(jī)剪下較嫩的葉片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑與載體：RNA 提取試劑盒、連接試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京艾德萊生物科技有限公司；2×Rapid Master Mix 高保真酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑均購自諾唯贊生物公司；KpnI和BamH I快切酶、T4 DNA連接酶購自Takara公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物公司。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)紫薇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出一條unigene 序列片段，用Primer Premier 5 軟件根據(jù)編碼序列從兩端設(shè)計上下游特異引物L(fēng)iHY5-F、LiHY5-R 進(jìn)行基因克隆。同時依據(jù)CDS 序列設(shè)計熒光定量PCR 的引物和帶有KpnI和BamH I酶切位點(diǎn)的引物連接植物載體pCAMBIA1300-35S-GFP（表1）。

表1 試驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.3 紫薇LiHY5基因的克隆

按照多糖多酚復(fù)雜植物RNA提取試劑盒說明書提取‘丹紅紫葉’紫薇葉片總RNA，并檢測RNA的質(zhì)量。將無降解的RNA 直接反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 并稀釋。按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增：cDNA 2.0 μL，克隆引物L(fēng)iHY5-F、LiHY5-R各0.5 μL，2×Rapid Master Mix 10 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。擴(kuò)增程序按照高保真酶說明書設(shè)置，退火溫度63 ℃，33 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物純化后連接轉(zhuǎn)化，挑單菌落并小搖6 h，選擇渾濁菌液進(jìn)行PCR，將電泳條帶大小與目的基因一致的菌液，送至華大基因公司進(jìn)行測序。

1.4 LiHY5基因的生物信息學(xué)分析

將LiHY5基因編碼序列翻譯成氨基酸序列后，利用NCBI 結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測LiHY5 蛋白保守結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用ExPASy 在線分析軟件（https://web.expasy.org/protparam/）對LiHY5 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；SignalP5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）分析其是否帶有信號肽位點(diǎn)，TMHMM2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/）建立蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)模型，Pymol對蛋白質(zhì)三維圖像進(jìn)行處理；imageJ對熒光圖像進(jìn)行優(yōu)化；DNAMAN 對不同的植物進(jìn)行序列比對；MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 LiHY5基因的亞細(xì)胞定位

將LiHY5基因的編碼序列雙酶切與pCAMBIA1300-35S-GFP 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并測序，得到序列正確的pCAMBIA1300-35S-LiHY5-GFP 重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至EHA105 農(nóng)桿菌，將含有農(nóng)桿菌的注射液注射至煙草下表皮，暗處理2 d后，光照1 d。輕輕撕取注射孔附近的煙草葉片下表皮并將其放置在顯微鏡下觀察。

1.6 花青素的提取

精準(zhǔn)稱取‘丹紅紫葉’紫薇不同光質(zhì)處理下的新鮮葉片0.1 g 并剪碎，放入10 mL 離心管中，用0.1%的鹽酸甲醇溶液定容至5 mL，用封口膜封住，放入冰箱4 ℃浸提24 h，直至溶液呈紫色，葉片呈無色，每個樣品重復(fù)3 次。在波長530 nm 處測量浸提液的吸光度，并計算出花青素含量。相對含量A=吸光度×0.01，花青素相對含量（mg/g）=OD530/g·FW。

1.7 不同光質(zhì)下LiHY5基因的表達(dá)量

為了探究LiHY5基因在不同光質(zhì)下的表達(dá)水平，利用熒光定量PCR 進(jìn)行基因表達(dá)量的檢測。根據(jù)LiHY5基因編碼序列設(shè)計熒光引物（表1），以白光作為樣本對照，18S基因作為內(nèi)參基因。每個樣品模板連續(xù)稀釋4倍、16倍、64倍、256倍后計算擴(kuò)增效率，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序按照說明書設(shè)定，選擇標(biāo)準(zhǔn)程序并選擇2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LiHY5基因的克隆

提取‘丹紅紫葉’紫薇幼嫩葉片總RNA（圖1A），通過電泳圖顯示28S、18S條帶清晰且28S∶18S=2∶1，說明RNA 無污染降解，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將‘丹紅紫葉’紫薇總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計LiHY5-F、LiHY5-R（表1）為克隆引物，擴(kuò)增得到清晰且單一的目的片段（圖1B）。經(jīng)過測序得到510 bp的序列，與目的片段相似度94.78%，通過NCBI 中BLAST 比對，與數(shù)據(jù)庫中多種植物的HY5基因具有較高的同源性，因此將紫薇該基因命名為LiHY5。

圖1 LiHY5基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of LiHY5 gene PCR products

2.2 LiHY5基因的理化性質(zhì)與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

LiHY5基因的CDS 序列長510 bp，編碼169 個氨基酸。將其放入ExPASy 預(yù)測蛋白基本理化性質(zhì)，結(jié)果顯示該蛋白分子式為C755H1277N263O267S4，分子量18 439.29 Da，理論等電點(diǎn)pI 為9.80，總原子個數(shù)為2 566，氨基酸含量占比最多是精氨酸和絲氨酸，為12.4%。不穩(wěn)定指數(shù)為59.42，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。帶負(fù)電殘基總數(shù)為25，帶正電殘基總數(shù)為30，脂肪系數(shù)為59.59。親水性指數(shù)-1.143，屬于親水性蛋白。信號肽位點(diǎn)預(yù)測LiHY5 無信號肽位點(diǎn)，同時預(yù)測顯示LiHY5 沒有跨膜結(jié)構(gòu)，故不屬于膜蛋白。利用NCBI 在線分析工具Conserverd Domain Serch 在線分析LiHY5 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示如圖2，該蛋白在第92～143 位存在典型的bZIP-HY5-Like 特定位點(diǎn)，屬于bZIP 超家族。bZIP 結(jié)構(gòu)含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和堿性結(jié)構(gòu)域，可參與高等植物的光轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖2 LiHY5蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 Prediction of conserved domain of LiHY5 protein

2.3 LiHY5蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

LiHY5 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果分析如圖3，LiHY5 蛋白169 個氨基酸中87 個氨基酸形成無規(guī)則卷曲，占51.48%；80個為α螺旋，占47.34%；β轉(zhuǎn)角和延伸鏈只有1個，均只占0.59%。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測見圖4，LiHY5蛋白三維圖像呈典型亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的空間結(jié)構(gòu)一致。

圖3 LiHY5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Secondary structure prediction of LiHY5 protein

圖4 LiHY5蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of LiHY5 protein tertiary structure

2.4 LiHY5蛋白多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析

將石榴（XP_031407456.1）、蒲桃（XP_030440254.1）、玫瑰木（XP_030548349.1）、大桉（XP_010048982.1）、毛果楊（XP_002308656.1）、甜櫻桃（XP_021827650.1）、橙子（KAH9760741.1）、白樺（AHY20043.1）、月季（XP_024165510.1）、大麻（XP_030495238.1）、沙梨（QRR19189.1）、棗（XP_015868446.1）12種HY5蛋白序列與紫薇HY5蛋白序列比對分析，總相似性達(dá)到85.32%（圖5），其中與石榴的蛋白序列相似度最高，達(dá)到88.17%。

圖5 不同物種HY5蛋白的氨基酸序列對比Fig.5 Comparison of amino acid sequences of HY5 proteins in different species

選擇石榴Punica granatum、大桉Eucalyptus grandis、栓皮櫟Quercus suber、橙子Citrus sinensis、蓖麻Ricinus communis、蒲桃Syzygium oleosum、玫瑰木Rhodamnia argentea、毛果楊Populus trichocarpa、白樺Betula platyphylla、棗Ziziphus jujuba、月季Rosa chinensis、大麻Cannabis sativa、沙梨Pyrus pyrifolia、甜櫻桃Prunus avium、番木瓜Carica papaya一共15種植物的HY5蛋白序列作為參照，采用Neighbor Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并利用Bootstrap 進(jìn)行檢測，采用重復(fù)抽樣1 000 次。進(jìn)化分析結(jié)果顯示（圖6），紫薇與石榴、蒲桃、大桉、玫瑰木親緣關(guān)系較近，LiHY5與石榴PgHY5歸為同一分支，說明二者的同源蛋白可能具有相似的功能。

圖6 不同植物HY5氨基酸序列的進(jìn)化分析Fig.6 Evolutionary analysis of HY5 amino acid sequences in different plants

2.5 LiHY5基因的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示LiHY5 蛋白定位于細(xì)胞核中，為驗(yàn)證紫薇LiHY5基因在細(xì)胞中的位置，采用雙酶切法構(gòu)建了LiHY5-pCAMBIA1300-35S-GFP 重組載體。將重組載體雙酶切并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，空載中熒光主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中；轉(zhuǎn)化帶有LiHY5基因的質(zhì)粒注射至煙草葉片中，熒光主要分布在細(xì)胞核中（圖7）。

圖7 LiHY5基因的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of LiHY5 gene

2.6 紫薇葉片花青素含量與LiHY5基因表達(dá)量相關(guān)性分析

為探究LiHY5基因表達(dá)量與花青素含量的關(guān)系，筆者提取了不同時間光處理的紫薇葉片花青素。由圖8可知：不同時間的光處理下花青素含量均有上調(diào)，且均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中紅藍(lán)組合光＞紅光＞藍(lán)光＞白光，紅藍(lán)組合光影響最為顯著，在14 d時含量最高，28 d時花青素含量降至最低，在不同時間段均高于其他光處理。說明不同光質(zhì)的處理能促進(jìn)紫薇葉片花青素的積累。通過qPCR 技術(shù)檢測LiHY5基因在紅光、藍(lán)光以及紅藍(lán)組合光下的基因表達(dá)量，以白光作為對照，結(jié)果如圖9 所示。由圖9可知LiHY5基因表達(dá)量在不同光的處理下呈先升高后降低趨勢，在7 d 時3 種不同顏色的光基因表達(dá)量均有下調(diào)，14 d 時紅光和紅藍(lán)光表達(dá)量明顯上調(diào)，28 d 時下調(diào)至最低。這些結(jié)果說明不同光質(zhì)均對LiHY5基因的表達(dá)有影響。其中，紅藍(lán)組合光＞紅光＞白光＞藍(lán)光，說明紅光和紅藍(lán)光在14 d時對LiHY5基因發(fā)揮了積極的作用；而藍(lán)光在28 d的處理下花青素含量和基因表達(dá)量對比白光差別不大，說明短時間的藍(lán)光對LiHY5基因影響效果不明顯。

圖8 ‘丹紅紫葉’紫薇葉片花青素含量Fig.8 Anthocyanin content in leaves of Lagerstroemia indica

圖9 LiHY5基因在不同光處理下的基因表達(dá)量Fig.9 Gene expression of LiHY5 gene under different light treatments

通過分析紫薇葉片花青素含量與LiHY5基因相對表達(dá)量的相關(guān)性，結(jié)果表明紫薇葉片花青素的含量與LiHY5基因的相對表達(dá)量相關(guān)系數(shù)為0.603，說明紫薇中花青素的含量與LiHY5基因的相對表達(dá)量相關(guān)性顯著?；ㄇ嗨睾颗cLiHY5基因相對表達(dá)量呈線性關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

HY5基因在植物幼苗生長發(fā)育中起著重要作用，并且是光形態(tài)發(fā)生的正調(diào)節(jié)因子。近年來對HY5基因的研究日益增多，HY5基因的功能也逐漸被人們發(fā)掘：HY5基因不僅感知光信號參與色素積累，也有研究報道HY5基因誘導(dǎo)了植物幼根的發(fā)育[16]、控制冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)以促進(jìn)植物的冷適應(yīng)[17]。在幼苗發(fā)育中，HY5直接與細(xì)胞核中COP1相互作用，負(fù)性調(diào)節(jié)其活性[18]。COP1（Constitutive Photomorphogeneic 1）是一種具有WD-40重復(fù)序列的環(huán)指蛋白，與HY5作用相反，其核豐度受光負(fù)調(diào)控。在黑暗下COP1定位在細(xì)胞核，與HY5蛋白相互作用后，COP1可作為泛素蛋白連接酶E3聚集E2泛素結(jié)合酶，靶向HY5和其他底物進(jìn)行泛素化并隨后被蛋白酶體降解；在可見光下，COP1與上游光感受器相互作用抑制自身功能，COP1隨后在細(xì)胞核泛素化并被排出到核外[19]。

花青素屬于黃酮類化合物，廣泛存在植物花序和果實(shí)中?；ㄇ嗨厣厥侵参镱伾闹饕獩Q定因素，可使植物呈現(xiàn)紅色和紫色，是成熟果實(shí)中傳粉者的視覺信號[20]。HY5在花青素生物合成的控制中扮演著十分重要的角色。核內(nèi)的HY5等光形態(tài)建成正調(diào)控因子將積累并激活R2R3 MYBs轉(zhuǎn)錄因子和類黃酮合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因，結(jié)合基因啟動子區(qū)域的順式作用元件，從而在光照條件下促進(jìn)植物花青素等類黃酮物質(zhì)合成[21]。

紫薇作為重要的園藝觀賞植物,通過研究紫薇花色形成機(jī)制實(shí)現(xiàn)紫薇顏色的多樣對觀賞育種以及滿足市場需求有重要的意義。本研究成功克隆得到了紫薇LiHY5基因，長度510 bp，由169 個氨基酸組成，含有典型的bZIP-HY5-Like 保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示LiHY5 與石榴PgHY5、蒲桃SoHY5 氨基酸序列親緣關(guān)系最近，可能是由于它們都屬于桃金娘目，因此發(fā)揮相似的功能。亞細(xì)胞定位結(jié)果說明LiHY5基因在核內(nèi)發(fā)揮功能，這與轉(zhuǎn)錄因子的基本特征相符合，與馬媛等[22]對日本結(jié)縷草的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致?；ㄇ嗨睾吭诓煌瑫r間的光質(zhì)影響下先升高后降低，說明短時間內(nèi)不同光質(zhì)的干預(yù)可以促進(jìn)花青素的合成，但28 d時均降低。推測可能是由于單一光質(zhì)的影響使得紫薇生長受到限制。qPCR 結(jié)果顯示不同時間、不同光質(zhì)處理對LiHY5基因影響較大，且與花青素含量的相關(guān)性較高，說明光照尤其是紅藍(lán)組合光可以促進(jìn)紫薇LiHY5基因的表達(dá)與花青素的合成。這與前人對草莓的研究結(jié)果類似[23]。本研究對LiHY5基因進(jìn)行了初步的預(yù)測分析，為接下來驗(yàn)證LiHY5基因的功能、探究紫薇遺傳轉(zhuǎn)化體系提供理論基礎(chǔ)。

致謝：長沙市杰出創(chuàng)新青年培養(yǎng)計劃（kq2106090）同時對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意!