果王素通過下調(diào)NPM表達(dá)對小鼠移植肺腺癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用*

鐘柏英 賀立洋 周美玲 賀兼斌

(1.南華大學(xué)附屬懷化醫(yī)院腫瘤中心，湖南 懷化 418000；2.懷化市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 懷化 418000)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署2018年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年新發(fā)病肺癌患者超過200萬，死亡病例數(shù)高達(dá)180萬[1-2]，肺癌在惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率高居榜首，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下，給家庭和社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)。肺癌按組織病理學(xué)分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌，近年來肺腺癌在非小細(xì)胞肺癌中比例逐漸升高。由于肺癌無特征性癥狀，早期診斷困難，約75%的患者診斷時已處于中晚期[3],大部分中晚期患者無手術(shù)治療機會，放化療為該類患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案,但近年來其療效已達(dá)到瓶頸，且副作用嚴(yán)重，部分患者因不能耐受放化療的毒副作用而中斷治療[4]。因此尋找高效、低毒的抗癌藥物，是人類將來抗腫瘤治療的新策略之一。果王素(獼猴桃果仁油脂肪酸)(Kiwi fruit essence，unsaturated fatty acid of Actinidia chinesis planch seed oil)具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用。課題組前期研究表明[5-6]，果王素能有效抑制小鼠肺腺癌的生長和轉(zhuǎn)移，但其具體的抗腫瘤機制尚不太明確。核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin，NPM)是一類能穿梭于核仁、核質(zhì)與胞質(zhì)之間在細(xì)胞增殖和生長中發(fā)揮重要調(diào)控作用的多功能核仁蛋白[7-8]。有研究顯示[9-12]，在多種腫瘤組織中NPM呈過表達(dá)，而且腫瘤的分期越晚、組織分化越差，NPM的表達(dá)水平越高。目前對于果王素是否通過調(diào)控NPM的表達(dá)抑制肺腺癌的生長與轉(zhuǎn)移，報道鮮少。本研究通過構(gòu)建小鼠肺腺癌移植瘤模型，予以每組小鼠不同劑量的果王素進(jìn)行干預(yù)，觀察各組小鼠移植瘤生長和轉(zhuǎn)移情況，檢測移植瘤組織中NPM蛋白及mRNA的表達(dá)水平，探索果王素抗腫瘤的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Lewis肺腺癌荷瘤種鼠(鼠源)2只，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，C57BL/6J 雄性小鼠32只，體重(20±2)g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實驗動物中心(許可證號：SYXK[京]2019-0019)，本研究通過本院動物倫理審查(快KY-2019082205)。

1.1.2 實驗試劑 果王素(中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸含量為600 g/L)購買于湘西老爹生物有限公司，兔抗鼠NPM多克隆抗體、β-actin、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，BCA法蛋白定量檢測試劑盒由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供，SP試劑盒、DAB顯色劑購自北京索萊寶科技有限公司，TRIzol試劑與PVDF膜購于美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴增試劑盒購于美國Promega公司，武漢博爾夫生物科技有限公司合成NPM、β-actin引物。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建實驗動物模型 斷頸處死Lewis肺腺癌荷瘤種鼠，無菌條件下剝離腫瘤，取無壞死的實性腫瘤組織，剪碎，加入生理鹽水(1g腫瘤：4 mL生理鹽水)勻漿，325目鋼網(wǎng)濾過為腫瘤細(xì)胞懸液。C57BL/6J 小鼠右后腿根部外側(cè)皮下注射 0.2 mL腫瘤細(xì)胞懸液，構(gòu)建肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型。

1.2.2 實驗分組及藥物干預(yù) 32只小鼠接種后第4天隨機分為4組：對照組、低劑量果王素組、中劑量果王素組和高劑量果王素組，每組8只，予以藥物干預(yù)。對照組小鼠予以0.3 mL生理鹽水每天灌胃一次，低劑量果王素組小鼠予以60 mg/kg果王素稀釋于0.3 mL生理鹽水每天灌胃一次，中劑量果王素組小鼠予以120 mg/kg果王素稀釋于0.3 mL生理鹽水每天灌胃一次，高劑量果王素組小鼠予以240 mg/kg果王素稀釋于0.3 mL生理鹽水每天灌胃一次。果王素組的干預(yù)藥物劑量按照相關(guān)文獻(xiàn)及課題組前期研究確定[5-6]。

1.2.3 觀察移植瘤生長和轉(zhuǎn)移 腫瘤細(xì)胞接種后第24天處死全部小鼠，分離皮下移植瘤，測量最長徑a和短徑b，按公式V=0.52a×b2計算腫瘤體積，稱腫瘤重量，按公式V=(1-ET/EC)×100%計算抑瘤率(ET為果王素組平均瘤重，EC為對照組平均瘤重)，一部分腫瘤組織經(jīng)液氮速凍后，保存于-70℃冰箱待用，剩余腫瘤組織用4%中性甲醛溶液固定后包埋于石蠟。剖胸取雙肺，置入Boins液處理后，計數(shù)小鼠雙肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，按公式計算肺轉(zhuǎn)移抑制率=(1-QT/QC)×100%(QT為果王素組平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，QC為對照組平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù))。

1.2.4 免疫組化法檢測移植瘤組織NPM蛋白表達(dá) 把移植瘤組織包埋于石蠟后切片，行二甲苯脫辣、梯度酒精脫水、抗原修復(fù)、阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后用正常山羊血清37℃封閉10 min，滴加一抗(兔抗鼠Nucleophosmin多克隆抗體)，用PBS緩沖液替代一抗為陰性對照，4℃冰箱孵育過夜，第二天滴加HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，滴加SP，37℃孵育30 min，然后行DAB染色、蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。采用顯微鏡閱片，NPM染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核中出現(xiàn)清晰棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，選擇陽性細(xì)胞密集區(qū)域，排除壞死區(qū)，每張切片計數(shù)10個高倍視野100個細(xì)胞并采用全自動圖像分析系統(tǒng)測定平均灰度值(灰度值越高,其蛋白質(zhì)表達(dá)越高)。

1.2.5 免疫印跡法檢測移植瘤組織NPM蛋白表達(dá) 取適量各組凍存的移植瘤腫瘤組織，用RIPA蛋白裂解液從組織樣本中提取細(xì)胞蛋白，用BCA法測定各組移植瘤組織的蛋白質(zhì)濃度，予以相同的上樣量，行SDS- PAGE凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)蛋白于PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后室溫下用5%脫脂牛奶封閉過夜，在PVDF膜上加入按1∶1000稀釋的一抗(兔抗鼠NPM)，4℃搖床孵育過夜，第二天用TBST沖洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG)，室溫?fù)u床孵育1 h，再次用TBST沖洗3次，在避光容器中把現(xiàn)配的ECL發(fā)光液滴在PVDF膜上均勻覆蓋，暗室顯影曝光，掃描膠片，用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各組條帶的光密度值，計算出NPM的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測移植瘤組織NPM mRNA 表達(dá) 取適量各組凍存的移植瘤腫瘤組織，用TRIzol試劑提取組織樣本中的RNA，將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴增，由上海生工公司參照NPM、β-actin基因序列合成所用引物(表1)，取10 μL cDNA稀釋液，在熒光定量PCR儀上行PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照，計算2-ΔΔCt值，分析NPM mRNA表達(dá)水平。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 果王素抑制小鼠移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移 實驗過程中小鼠皆存活，無死亡，接種瘤細(xì)胞后，所有小鼠皮下移植處均成瘤，藥物干預(yù)前各組小鼠皮下移植瘤大小無明顯差異，呈局部小結(jié)節(jié)，接種第18～24天，果王素處理組皮下移植瘤體積較對照組明顯小，且高劑量果王素組腫瘤最小。處死小鼠，解剖觀察各組小鼠移植瘤大小和雙肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量，見各劑量果王素處理組皮下移植瘤體積、質(zhì)量和雙肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均較對照組明顯降低(P<0.05)，腫瘤抑制率和肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率隨果王素劑量升高而升高，組間比較有顯著性差異(P<0.05)，移植瘤生長和轉(zhuǎn)移情況，見表2。

2.2 果王素下調(diào)小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白的表達(dá) NPM蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞核中，免疫組織化學(xué)染色后細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。對照組出現(xiàn)較多NPM陽性細(xì)胞，低、中、高劑量果王素處理組陽性細(xì)胞明顯減少，而且隨著果王素劑量升高，NPM陽性表達(dá)依次減少，各組之間相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。Western blot 法檢測皮下移植瘤NPM蛋白表達(dá)與免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果相一致，見圖2。

圖1 各組小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白表達(dá)

圖2 各組小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白表達(dá)水平(Western blot)

2.3 果王素下調(diào)小鼠皮下移植瘤中NPM mRNA水平 實時熒光定量PCR顯示，各劑量果王素處理組NPM mRNA的表達(dá)水平均較對照組明顯下降(P<0.01)，果王素劑量升高，NPM mRNA的表達(dá)水平下降更明顯，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 各組小鼠皮下移植瘤中NPM mRNA表達(dá)水平(qRT-PCR)

3 討論

肺癌的發(fā)病率和惡性程度皆高，易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，大部分患者在確診后由于進(jìn)入中晚期而失去了手術(shù)根除機會，預(yù)后較差。在肺癌的病理類型中，肺腺癌由于血管豐富，更易快速生長和轉(zhuǎn)移，給治療帶來很大困難，而對于中晚期肺癌，本世紀(jì)以前，放化療是主要的治療手段，但其毒副作用大而治療效果不理想，因而尋找有效而毒副作用小的治療藥物成為重要課題。果王素為中華獼猴桃果仁提取物，主要成分為a-亞麻酸，含有一定量維生索E及微量元素硒等物質(zhì)，具有抗癌、抗氧化、保護(hù)正常組織細(xì)胞活性的作用。課題組早期研究[5-6,13-14]發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌小鼠移植瘤模型中，我們使用果王素與GP化療方案治療對照，即腫瘤接種4 d后果王素180 mg/kg每日灌胃1次，共14 d及腫瘤接種后第 5、12、19 d腹腔注射順鉑、吉西他濱各1次,順鉑劑量3 mg/kg,吉西他濱劑量50 mg/kg，在腫瘤接種20 d后處死全部小鼠，結(jié)果顯示果王素對肺腺癌小鼠移植瘤的生長有明顯抑制作用，雖然其抑制作用仍劣于GP方案化療組(抑瘤率為14.95%及41.77%)，但轉(zhuǎn)移抑制率卻優(yōu)于GP方案化療組(轉(zhuǎn)移抑制率為74.0%及36.3%)，說明果王素可明顯抑制肺腺癌小鼠移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移，特別是在抑制轉(zhuǎn)移方面的作用更明顯。在本研究中果王素呈劑量依賴性抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移，與既往的研究結(jié)果一致。

惡性腫瘤是細(xì)胞生長與增殖調(diào)控發(fā)生嚴(yán)重紊亂的結(jié)果，其發(fā)生具有復(fù)雜的分子基礎(chǔ)，包括抑癌基因失活、原癌基因激活、凋亡調(diào)節(jié)基因和DNA修復(fù)基因功能紊亂等多種內(nèi)因外因復(fù)雜的交互作用。肺癌和其他惡性腫瘤一樣，其發(fā)生發(fā)展受多種因素的影響，但目前對其具體的分子機制尚不完全清楚。探尋肺癌發(fā)生發(fā)展過程所涉及基因及基因產(chǎn)物，有利于揭示肺癌的發(fā)病機制，并為肺癌的早期診斷、預(yù)后評估提供依據(jù)，同時這些基因及基因產(chǎn)物亦可能成為肺癌靶向治療潛在的靶標(biāo)，為肺癌的治療開辟新的治療途徑。我們前期研究表明果王素抑制肺腺癌生長和轉(zhuǎn)移可能與其抗氧化和上調(diào)含EH結(jié)構(gòu)域蛋白2有關(guān)[5-6]，但由于肺癌發(fā)生發(fā)展過程中，有復(fù)雜的分子信息網(wǎng)絡(luò)交互作用，果王素抗肺癌生長和轉(zhuǎn)移的具體作用機制遠(yuǎn)未清楚。NPM是銀染核仁組織區(qū)域蛋白之一，是主要的核仁磷酸化蛋白，能在核仁、核質(zhì)和細(xì)胞胞質(zhì)之間穿梭，具有多種功能，如與核糖體生物合成、RNA的裝配與合成、染色體復(fù)制、調(diào)節(jié)抑癌基因p14和p53活性、作為分子伴侶阻止蛋白集聚等分子生物過程密切相關(guān)，而且還參與細(xì)胞增殖和監(jiān)控核仁活性[15-16]。有研究[17]表明，NPM突變與急性髓細(xì)胞白血病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，NPM水平增高往往提示急性髓細(xì)胞白血病患者復(fù)發(fā)難治。NPM在腫瘤和增殖期細(xì)胞中的含量明顯高于靜止期細(xì)胞，在凋亡細(xì)胞中NPM表達(dá)水平下降，NPM過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖并抑制細(xì)胞凋亡，有研究證實NPM具有原癌基因的特征，直接參與了腫瘤細(xì)胞的形成，NPM在多種實體腫瘤組織中過表達(dá)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，例如腎癌[9]、胃癌[11]、子宮內(nèi)膜癌[18]、前列腺癌[19]、結(jié)直腸癌[20]等，可能為上述腫瘤的腫瘤標(biāo)志物之一。但目前NPM與肺癌的關(guān)系報道較少，課題組的前期研究[21-22]表明，NPM的高表達(dá)可能促進(jìn)肺腺癌生長與轉(zhuǎn)移，同時與減低肺腺癌對化療的敏感性或促進(jìn)化療耐藥有關(guān)。為探索果王素是否通過調(diào)控NPM的表達(dá)，抑制肺腺癌的生長與轉(zhuǎn)移，本研究通過免疫組織化學(xué)法和蛋白免疫印跡法檢測小鼠肺腺癌移植瘤內(nèi)NPM蛋白的表達(dá)量，用qRT-PCR法檢測小鼠肺腺癌移植瘤中的NPM mRNA的表達(dá)水平，實驗結(jié)果顯示，對照組腫瘤組織中NPM蛋白和mRNA呈高表達(dá)，而果王素處理組NPM蛋白和mRNA的表達(dá)水平均較對照組降低，且隨果王素劑量越高，NPM蛋白和mRNA的表達(dá)水平越低，高劑量果王素處理組最低，各組間的比較均有顯著性差異。實驗結(jié)果表明，果王素可抑制小鼠肺腺癌移植腫瘤組織中NPM的過表達(dá)，且抑制作用與果王素濃度呈正相關(guān)，說明果王素可能通過下調(diào)NPM的表達(dá)抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移。NPM在多種人類癌癥中均有表達(dá)，可能同時具有致癌和抑癌兩種活性，其具體機制可能與調(diào)控癌基因及抑癌基因表達(dá)，介導(dǎo)多種信號通路誘發(fā)腫瘤耐藥的發(fā)生有關(guān)[9,23-24]，本課題未進(jìn)行果王素調(diào)節(jié)NPM的具體直接機制的研究，有待于在以后的研究中進(jìn)一步完善。

綜上所述，果王素可呈劑量依賴性抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移并下調(diào)移植瘤組織中NPM基因及蛋白表達(dá)，果王素的抑瘤作用機制可能與下調(diào)NPM的表達(dá)有關(guān)，同時本研究提示NPM可能成為肺腺癌治療的潛在靶點。

4 結(jié)論

果王素可能通過下調(diào)NPM蛋白及基因表達(dá)，抑制小鼠肺腺癌移植瘤生長和轉(zhuǎn)移。