鄧宇，楊詩穎，冼文妍，楊宇哲，楊瑞麗

(廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州，510642)

鞣花酸(ellagic acid，EA)是一種廣泛分布于石榴、藍莓等水果和核桃等堅果、以及茶和多種藥用植物中的天然多酚類化合物[1]，研究顯示其具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗衰老及神經(jīng)保護等多種生物活性[2]。但是，鞣花酸有益于人體健康的臨床研究結果并不一致。歐洲食品安全局(European Food Safety Authority， EFSA)曾刊文認為，攝入富含鞣花酸的石榴與其聲稱的健康益處之間沒有因果關系。研究顯示，鞣花酸生物利用度極低，在血液及組織中往往不能達到其發(fā)揮生物活性的有效濃度[3]。不被吸收的鞣花酸到達結腸后會被腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化生成尿石素A和尿石素 B等尿石素類物質(zhì)[4]。尿石素類物質(zhì)被證實亦有抗氧化[5]、抗炎癥[6]和抗衰老[7]等多種生物活性，因此，越來越多的實驗聚焦于其腸道菌群代謝物尿石素類物質(zhì)，認為其是鞣花酸在體內(nèi)發(fā)揮其健康作用的物質(zhì)基礎[8]。但是，由于個體腸道菌群組成的差異，攝入鞣花酸后生成尿石素類物質(zhì)種類和數(shù)量存在顯著差異[9]，這可能是人群攝入富含鞣花酸的食品后臨床健康效果存在較大差異的原因之一。

研究人員根據(jù)攝入鞣花酸后產(chǎn)生的尿石素類物質(zhì)的定性分析，將人群分為3種尿石素代謝型，即尿石素代謝型A(只生成尿石素A，urolithin metabotype A，UM-A)、尿石素代謝型B(除了尿石素A 外，還生成尿石素B/異尿石素A，urolithin metabotype B，UM-B)和 尿石素代謝型0(不生成尿石素類物質(zhì)，urolithin metabotype 0，UM-0)[10]。不同種類的尿石素生物活性存在顯著差異，研究證明，尿石素A相比于尿石素B和異尿石素A具有更好的抗氧化[11]、抗炎癥活性[12]，比其母體化合物鞣花酸具有更高的生物利用度[13]。因此，開展鞣花酸在UM-A型腸道菌群代謝途徑轉(zhuǎn)化過程研究，分析參與鞣花酸代謝轉(zhuǎn)化生成尿石素A的關鍵細菌類群，以及鞣花酸對UM-A型腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，對于認識鞣花酸的健康作用具有重要意義。

本實驗采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS)檢測UM-A型菌群體外代謝鞣花酸生成尿石素A過程中主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及含量，分析其代謝規(guī)律，通過16S rRNA檢測菌群變化，分析鞣花酸對UM-A腸道菌群結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鞣花酸膠囊(鞣花酸含量≥40%)，德國Sanct Bernhard；鞣花酸(純度≥ 99%)，上海泰坦科技股份有限公司；尿石素A(純度≥99%)，Sigma-Aldrich公司；尿石素C(純度≥98%)，四川省維克奇生物技術有限公司；甲酸 (質(zhì)譜級)、乙腈(質(zhì)譜級)，美國Supelco公司；BHI肉湯培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽(純度≥99%)，MYM生物科技有限公司；乙酸乙酯(分析純)，天津市大茂化學試劑廠；糞便基因組DNA試劑盒(生物試劑)，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設備

UPLC-Q-E-MS/MS，美國Thermo公司；5810R臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；AW500SG厭氧工作站，英國伊萊泰科公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 UM-A型腸道菌群的制備

使用無菌管收集鞣花酸代謝型為A型的志愿者的糞便，要求志愿者至少3個月未服用過抗生素相關藥物，且無腸胃病史。志愿者均簽署書面知情同意書。在厭氧條件下把糞便轉(zhuǎn)移至離心管中，按1∶3.6(g∶mL)加入磷酸鹽緩沖溶液，過濾后，加入10%甘油，最終糞便按1∶4(g∶mL)的比例被稀釋，分裝后存于-80 ℃ 冷凍備用。

1.3.2 鞣花酸體外代謝實驗

稱取7.4 g粉末BHI腦心浸液培養(yǎng)基加入200 mL水稀釋攪至完全溶解，每管8 mL分裝至離心管，滅菌后轉(zhuǎn)至厭氧工作站備用。取1 mL糞菌懸液接種于BHI培養(yǎng)基的離心管中，再加入1 mL鞣花酸質(zhì)量濃度為300 μg/mL的含0.5%半胱氨酸鹽酸鹽的BHI培養(yǎng)基，即鞣花酸終質(zhì)量濃度為30 μg/mL，培養(yǎng)條件為37 ℃，N2/CO2/H2的比例為80/15/5分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h后取樣檢測，用等體積含1.5%甲酸的乙酸乙酯滅活萃取，渦旋，合并上清液，氮吹，沉淀用300 μL含15%二甲基亞砜的甲醇溶液復溶，定容，0.22 μm聚四氟乙烯濾器過濾，于4 ℃冷藏待測。

1.3.3 代謝物的鑒定

采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/M對代謝物進行定性定量檢測。質(zhì)譜條件如下：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，Milford，MA)，柱溫40 ℃，流動相A和B分別為milli-Q水(1‰甲酸)和乙腈(1‰甲酸)，流速0.3 mL/min，進樣體積為5 μL。梯度洗脫如下：0～3 min 95%～85% A，3～11 min 85%～70% A，11～15 min 70%～50% A，15～21 min 50%～10% A，21～22 min 10%～95% A。UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS以電噴霧離子化(electrospray ionization, ESI)源在負離子模式下進行定性和定量分析。質(zhì)譜實驗在以下條件下進行：干燥氣體(N2)30 arb；輔助氣體(N2)10 arb；毛細電壓3 200 V；毛細管溫度320 ℃；掃描范圍100～1 500m/z。利用保留時間、一級質(zhì)譜信息、二級碎片離子信息和峰面積外標法對代謝物進行定性定量分析。

1.3.4 16S rRNA高通量測序檢測腸道菌群

根據(jù)TIANamp Stool DNA Kit 糞便基因組DNA提取試劑盒說明書的步驟和方法抽提總DNA，V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。構建文庫后通過Illumina HiSeq 平臺進行測序[14]?？侱NA提取、PCR 擴增及Illumina HiSeq測序均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司協(xié)助完成。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有樣品平行測定3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(mean±SD)，使用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P≤0.05表示結果具有統(tǒng)計學差異。

2 結果與分析

2.1 鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS分析鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物及途徑。表1為負離子模式下二級質(zhì)譜碎片信息，結合保留時間和二級質(zhì)譜碎片離子特征，推測其代謝產(chǎn)物結構。鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化0、24、72 h的總離子流圖如圖1所示。與0 h比較，在轉(zhuǎn)化24 h時，檢測到4個代謝產(chǎn)物，其中峰2代謝物m/z260.028 1，通過文獻對比和碎片離子信息匹配，證實其為尿石素M6；峰3代謝物m/z244.082 2，與尿石素M6母離子相差16，推測峰3代謝物可能是尿石素M6在C環(huán)上損失1分子羥基得到的，其碎片離子信息與標準品尿石素C一致，鑒定其為尿石素C；峰4代謝物m/z275.014 8，與鞣花酸母離子m/z300.998 9相差26，推測峰4有可能是鞣花酸先水解再經(jīng)脫羧后得到的產(chǎn)物；峰5代謝物m/z227.034 3與尿石素C母離子相差16，推測其可能是尿石素C丟失1分子羥基得到的，通過與標準品碎片離子信息比對，鑒定其為尿石素A。推測鞣花酸的轉(zhuǎn)化路徑為EA→未知→UroM6→UroC→UroA，尿石素A為最終代謝產(chǎn)物[15]。

1-鞣花酸;2-尿石素M6;3-尿石素C;4-未知;5-尿石素A圖1 鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化 0、24、72 h總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of EA metabolites at 0, 24, 72 h incubation with UM-A human gut microbiota

UM-A菌群體外代謝過程的鞣花酸及代謝物含量變化如圖2所示。鞣花酸在24 h內(nèi)被迅速代謝，并在后續(xù)24～72 h緩慢減少，鞣花酸作為代謝底物，其消耗速率也與尿石素A的生成速率相似。尿石素A含量在0～24 h內(nèi)快速增長，在24 h含量為 (4.86±0.48) μg/mL，隨后在24～72 h緩慢升高。尿石素M6含量在24 h時最高,為 (2.05±0.43) μg/mL，在后續(xù)24～72 h含量緩慢減少，推測在體外代謝過程中鞣花酸會快速被UM-A菌群代謝成為尿石素M6[16]，隨后繼續(xù)轉(zhuǎn)化生成尿石素C。尿石素C含量在體外代謝過程中始終低于0.30 μg/mL，可能是尿石素C作為鞣花酸代謝過程的中間體，在體外被快速進一步代謝為尿石素A，因此能檢測到的尿石素C含量較低。

圖2 鞣花酸及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量隨時間變化曲線Fig.2 Time-concentration curve of EA and transformed products

2.2 鞣花酸對UM-A型腸道菌群結構的影響

2.2.1 腸道菌群α多樣性

如圖3所示，各組樣本的coverage指數(shù)均大于0.999，說明此次測序結果真實可靠。鞣花酸對UM-A菌群豐富度(chao指數(shù))無顯著影響(P>0.05)。

A-coverage指數(shù)；B-chao指數(shù)圖3 菌群α多樣性Fig.3 Alpha diversity index

2.2.2 腸道菌群主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)

采用PCoA分析樣本在操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)水平上微生物群落結構的總體差異(圖4)，其中第一成分貢獻率為95.67%，第二成分的貢獻率為2.37%，共同預測了98.10%的樣本數(shù)據(jù)。同一時間點的數(shù)據(jù)樣本分布比較密集，可知此次實驗所取的菌群樣本較為均勻及穩(wěn)定。鞣花酸在UM-A菌群體外代謝后，鞣花酸組與空白組的距離較遠，說明鞣花酸的代謝對微生物群落產(chǎn)生顯著影響。

圖4 腸道菌群PCoAFig.4 Principal co-ordinates analysis of gut microbiota

2.2.3 在門、屬水平上腸道菌群結構組成分析

如圖5-A所示，在門水平上，對照組厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門與變形菌門是優(yōu)勢菌門，其相對豐度分別為65.43%、31.63%、1.50%和0.72%。鞣花酸組厚壁菌門的相對豐度升高，擬桿菌門、放線菌門和變形菌門的相對豐度下降。ROCIO等[17]在鞣花酸體外胃腸道模擬實驗中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，隨著鞣花酸的代謝，在不同部位的結腸模擬罐中的厚壁菌門也有一定的上升趨勢，同時擬桿菌門也出現(xiàn)下降的趨勢。圖5-B所示，在屬水平上共有96個菌屬被檢測出，其中相對豐度較高的菌屬包括擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、糞球菌屬(Coprococcus)、丁酸弧菌屬(Anaerostipes)、多爾氏菌屬(Dorea)、布勞特氏菌屬(Blautia)、毛螺桿菌屬(Lachnospira)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、羅斯氏菌屬(Roseburia)、直腸真桿菌屬(Agathobacter)等。此外，黃桿菌屬(Flavonifractor)、產(chǎn)丁酸桿菌屬(Intestinimonas)、遲緩埃格特菌屬(Eggerthella)在鞣花酸組中相對豐度出現(xiàn)顯著性上升。與對照組相比，鞣花酸組Coprococcus的相對豐度極顯著升高(P<0.001)(圖6-A)，由2.16%升高至23.16%，Coprococcus能發(fā)酵碳水化合物，同時產(chǎn)生細菌素等抑菌物質(zhì)保護腸道健康、增強胃腸道機能降低炎癥水平。腸道有益菌屬Anaerostipes在鞣花酸組相對豐度極顯著上調(diào)(P<0.001)(圖6-B)，相對豐度由5.44%升高至8.90%。Anaerostipes可產(chǎn)生對人體有益的丁酸鹽[18]，參與腸屏障功能調(diào)節(jié)和免疫調(diào)控。“降解抗性淀粉的關鍵菌”Ruminococcus相對豐度由1.06%上升至3.53%(圖6-C)，大量研究表明瘤胃球菌能有效地分解如細胞壁等堅硬的植物物質(zhì)，具有穩(wěn)定腸道屏障、逆轉(zhuǎn)腹瀉、降低結直腸癌風險等作用。GU等[19]研究發(fā)現(xiàn), 瘤胃球菌科是小鼠大腸和糞便中的優(yōu)勢菌群, 與本試驗的結果相似。Lachnospira相對豐度由3.38%升至4.29%(圖6-D)，Lachnospira具有發(fā)酵碳水化合物的特點，對宿主健康維護具有重要的促進作用。Flavonifractor相對豐度出現(xiàn)顯著性上升，由0.03%升至0.5%(圖6-E),研究發(fā)現(xiàn)糞便中Flavonifractor豐度的變化與糞中戊酸含量的變化呈正相關[20]。Intestinimonas相對豐度由0.02%上升至0.04%(圖6-F)，Intestinimonas是一種產(chǎn)丁酸細菌，研究發(fā)現(xiàn)患有慢性腎病或炎癥性腸病的患者糞便中其豐度顯著低于健康人[21]，JIANG等[22]提出可以將R.intestinalis作為慢性腎病檢測的“微生物標志物”，并且R.intestinalis可以調(diào)節(jié)抗炎轉(zhuǎn)錄信號和轉(zhuǎn)錄激活因子的表達，減少結腸中炎性巨噬細胞和Th17細胞的數(shù)量，改善炎癥性腸病。被證實能把鞣花酸代謝為尿石素類物質(zhì)的Eggerthella[23]相對豐度由0.073%上升至0.47%(圖6-G)，出現(xiàn)極顯著性升高，推測Eggerthella可能是參與鞣花酸生物轉(zhuǎn)化為尿石素A的關鍵腸道菌之一。日本株式會社大賽璐在專利中報道Eggerthella具有高的尿石素類物質(zhì)產(chǎn)生能力[24]。本研究結果顯示鞣花酸能夠調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結構，促進潛在有益菌的增殖，同時富集代謝轉(zhuǎn)化自身生成尿石素的細菌類群。

A-門水平；B-屬水平圖5 鞣花酸代謝過程中UM-A腸道菌群的變化Fig.5 Composition of gut microbiota during metabolism of EA in vitro

2.2.4 鞣花酸對UM-A菌群KEGG代謝通路的影響

如圖7所示，功能預測分析發(fā)現(xiàn)鞣花酸組與對照組有182條通路有顯著性差異(P≤0.05)。與對照組相比，鞣花酸組25條通路極顯著下調(diào)，包括脂多糖生物合成蛋白、脂肪細胞因子信號通路、蛋白質(zhì)消化吸收、碳水化合物消化吸收等代謝通路，7條通路極顯著上調(diào)，包括RIG-I樣受體信號通路、金黃色葡萄球菌感染以及電子轉(zhuǎn)移載體等代謝通路。KANG等[25]發(fā)現(xiàn)，鞣花酸能夠通過腸道微生物能夠調(diào)控脂肪代謝，對高糖高脂飲食導致的血脂異常有明顯的改善作用，達到預防肥胖的效果。菌群代謝通路基因預測分析，表明鞣花酸的攝入可能通過影響腸道菌群代謝進而發(fā)揮對機體的健康作用。

A-糞球菌屬；B-丁酸弧菌屬；C-瘤胃球菌屬；D-毛螺桿菌屬；E-黃桿菌屬；F-產(chǎn)丁酸桿菌屬；G-遲緩埃格特菌屬圖6 鞣花酸影響的主要菌屬的相對豐度變化Fig.6 Relative abundance of major genera changed by EA 注：*表示P≤0.05;**表示P≤0.01;***表示P≤0.001;****表示P<0.000 1

圖7 鞣花酸對UM-A菌群KEGG代謝通路的影響Fig.7 Effect of EA on the related KEGG signaling pathway in UM-A gut microbiota

3 結論

本研究利用UPLC-Q-TOF/MS 分析鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外代謝轉(zhuǎn)化途徑，同時結合16S rRNA高通量測序技術分析鞣花酸對腸道菌群組成及代謝通路的影響。結果表明，鞣花酸在UM-A型人腸道菌群中體外轉(zhuǎn)化過程中，主要產(chǎn)物為尿石素M6，尿石素C、尿石素A；推測鞣花酸轉(zhuǎn)化路徑為EA→未知→UroM6→UroC→UroA，尿石素A為最終代謝產(chǎn)物。鞣花酸能促進丁酸弧菌(Anaerostipes)、糞球菌屬(Coprococcus)、產(chǎn)丁酸桿菌屬(Intestinimonas)等腸道潛在益生菌生長。通過腸道菌群基因功能注釋KEGG 通路的差異性分析，鞣花酸可能通過調(diào)節(jié)UM-A菌群脂多糖生物合成蛋白、脂肪細胞因子信號通路、RIG-I樣受體信號通路、以及蛋白質(zhì)和碳水化合物消化吸收等代謝通路等影響機體代謝。