重組膠原蛋白的生物醫(yī)學應用與發(fā)展前景★

周羽晗，袁榕穗，蔣受軍，段玉林，邊賀東

（1.廣西民族大學化學化工學院，廣西 南寧 530007；2.廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評查驗中心，廣西 南寧 530021）

膠原蛋白是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是許多生物體體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)之一。膠原蛋白的主要功能是提供機體的結(jié)構(gòu)支撐，維持組織的穩(wěn)定性和彈性[1]。在組織和器官中，膠原蛋白主要存在于骨骼、關節(jié)、肌肉、皮膚、血管、角膜等組織中。此外，膠原蛋白還能作為一種信號分子參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和遷移，對于維持正常的生理功能和機體的整體健康具有重要的作用[2]。

膠原蛋白在醫(yī)學、保健和美容領域具有廣泛的應用。在醫(yī)學領域，膠原蛋白被廣泛應用于組織工程和再生醫(yī)學，用于修復組織缺損和創(chuàng)傷[3]；在保健領域，膠原蛋白被用于預防和治療關節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等疾?。辉诿廊蓊I域，膠原蛋白被廣泛應用于護膚、美容、減肥等方面。

總之，膠原蛋白對于機體的正常生理功能和健康具有重要的作用，重組膠原蛋白的應用不僅可以改善人類健康和生活質(zhì)量，還可以促進醫(yī)療保健和美容產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，帶動相關產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，形成新的經(jīng)濟增長點。對于膠原蛋白的研究和應用具有重要的意義。

1 重組膠原蛋白的背景和發(fā)展歷程

1.1 重組膠原蛋白的背景

膠原蛋白是一種在人體內(nèi)廣泛存在的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，它在維持人體組織形態(tài)、保持身體健康方面起著非常重要的作用。但是，受到人體的生理和外部環(huán)境等因素的影響，膠原蛋白可能會受到破壞和損傷，導致身體各種組織器官的功能受到影響，甚至引發(fā)一些疾病。因此，對膠原蛋白的重組研究具有非常重要的意義[4]。

1.2 重組膠原蛋白的發(fā)展歷程

初期研究階段：20 世紀50 年代至70 年代初期。人們開始對膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)和生物學特性進行研究，但受到技術限制，研究進展緩慢。70 年代初期，人們開始嘗試通過體外重組的方式來制備膠原蛋白。但是，由于制備過程中需要大量的膠原蛋白和高昂的成本，以及技術限制，這一階段的研究成果有限[4]。

基因工程技術應用階段：20 世紀80 年代至90 年代初期。這一階段，隨著基因工程技術的發(fā)展，人們開始嘗試通過重組DNA 技術來制備膠原蛋白。通過基因工程技術[4]，可以將目標基因插入到表達載體中，并在表達宿主中表達目標蛋白質(zhì)。這一階段的研究取得了重要進展，使得膠原蛋白的體外重組成為可能。此外，還發(fā)展了多種重組膠原蛋白表達系統(tǒng)，并對重組膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學性質(zhì)進行了深入研究。

應用拓展階段：21 世紀初至今。隨著生物技術和納米技術的不斷發(fā)展，重組膠原蛋白的應用領域得到了廣泛拓展[4]。

2 重組膠原蛋白的制備和檢測方法

2.1 重組膠原蛋白的制備方法

2.1.1 基于原核表達系統(tǒng)的制備方法

唐云平等通過在大腸桿菌中將類人膠原蛋白基因與人脯氨酰-4-羥化酶（P4H）和D-阿拉伯-1，4-內(nèi)酯氧化酶（ALO）共表達，構(gòu)建了一個原核表達系統(tǒng)來生產(chǎn)羥基化類人重組膠原蛋白，并且研究了5 種不同的培養(yǎng)基以及誘導條件對該蛋白可溶性表達的影響。該方法制備周期短、成本低，適用于制備規(guī)模較小的重組膠原蛋白。但由于重組膠原蛋白的復雜性較高，可能會存在結(jié)構(gòu)和功能的問題。重組膠原蛋白傳統(tǒng)提取法生產(chǎn)主要是利用酸、堿水解法從羊皮、牛皮、魚、豬皮等中提取，由于蛋白質(zhì)的復雜性較高提取過程中會或多或少喪失其部分的生物活性，并且提取產(chǎn)品成分非常復雜。文獻中提到大腸桿菌表達系統(tǒng)還具有原核表達系統(tǒng)的翻譯后的加工修飾體系不完善、產(chǎn)生的致熱原使膠原蛋白難以應用于臨床等,也使得表達產(chǎn)物的生物活性較低。此外，國外雖然早就在真核系統(tǒng)中表達出多種膠原蛋白，但很少有在原核表達系統(tǒng)中對膠原蛋白或其片段進行表達的報道，所以這也是我們需要努力的方向。

2.1.2 基于真核表達系統(tǒng)的制備方法

該方法可以制備較高質(zhì)量的重組膠原蛋白，并且可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的復雜修飾。構(gòu)建含有Ⅵ型膠原蛋白基因的真核表達載體，并使其在畢赤酵母中的分泌表達，為深入研究Ⅵ型膠原蛋白的活性功能及其生產(chǎn)奠定基礎。漆佳麗等構(gòu)建鼠Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈（COL1A1）C 端甘氨酸重復序列的真核表達載體，探究其與成纖維細胞(Rat-1)的相互作用。為研究Ⅰ型膠原蛋白在成纖維細胞表面上的受體復合物奠定了基礎。

2.1.3 基于化學合成的制備方法

本法提供了一條快速、高效的蛋白質(zhì)制備途徑，同時它能方便地引入非天然氨基酸改變碳鏈骨架以及進行其他化學修飾來提高蛋白質(zhì)活性構(gòu)建新的蛋白。Kumar V 等利用36 個氨基酸殘基膠原，模擬多肽自組裝設計膠原納米纖維，研究發(fā)現(xiàn)，自組裝膠原納米纖維具有三螺旋結(jié)構(gòu)，這種人工合成仿生膠原纖維具有促進愈合的作用，可用于止血。但它也有缺點：成本較高，需要較高的技術水平和設備條件，同時蛋白質(zhì)的修飾也存在一定限制。

2.2 重組膠原蛋白的檢測方法

2.2.1 SDS-PAGE 法

何越等用SDS-PAGE 方法對微生物發(fā)酵并經(jīng)純化獲得的膠原蛋白進行電泳鑒別，上樣質(zhì)量濃度為1 g/L，上樣量10 μL，同時點樣Marker，樣品直接恒壓90 V 跑到底，之后采用染色液染色1 h，脫色液處理3 h，觀察電泳條帶情況。純化后獲得的重組膠原蛋白具有較高的純度，表達量高說明所用的發(fā)酵體系膠原表達高效、穩(wěn)定。該方法操作簡單，成本低，所以取發(fā)酵上清液做SDS-PAGE 鑒定，培養(yǎng)基1 中目的蛋白表達量最高，條帶最粗，說明此培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量最高。同樣為探究目的蛋白表達的最適甲醇誘導濃度，同理制備SDS-PAGE 電泳樣品電泳檢測，使用凝膠成像軟件分析表明甲醇誘導質(zhì)量分數(shù)在0.5%時目的蛋白表達量最高，條帶最粗。那治國等為了檢測膠原蛋白的結(jié)構(gòu)運用SDS-PAGE 觀察圖譜，一條在α 鏈97.2 kDa 處，另一條在116 kDa 附近出現(xiàn)兩條條帶，由鏈和鏈泳帶顏色的深淺及光密度可以大致推斷兩者含量，由此推斷膠原蛋白分子是由兩條相同的鏈和一條不同的鏈組成的異源三聚體結(jié)構(gòu)。但該方法不能對重組膠原蛋白的完整性進行判斷。

2.2.2 圓二色譜法

文獻中提到使用蛋白質(zhì)溶液的圓二色譜可以反映出蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息，得到數(shù)據(jù)后膠原三螺旋結(jié)構(gòu)特征性參數(shù)為正吸收峰與負吸收峰的比值，膠原蛋白的三重螺旋結(jié)構(gòu)完整性與比值呈正相關，所以說明三重螺旋結(jié)構(gòu)完整。此文獻作者將該蛋白樣品按照終質(zhì)量濃度250 mg/mL 溶解于Tris-HCL 溶液后，經(jīng)圓二色譜檢測，觀察峰的高低變化找到明顯的吸收峰區(qū)得到膠原蛋白的氨基酸殘基中極少含有芳香族氨基酸。但是該方法的成本較高，需要較高的技術水平和設備條件，蔡思澤在研究人源Ⅲ型膠原蛋白時，pPIC9K-COL3-4 菌株的發(fā)酵液進行Western Blot 驗證，在預期42 kDa 位置附近有明顯條帶，表明雙串聯(lián)膠原蛋白在畢赤酵母中能夠成功表達，且能分泌到胞外，但該方法需要特定的抗體，且操作較為繁瑣。

總的來說，選擇合適的方法取決于所需的量和質(zhì)量、設備條件、操作時間和成本等因素。

3 重組膠原蛋白的純化

常見的重組膠原蛋白質(zhì)純化技術包括柱層析其核心是樣品中的不同組分在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同，各組分隨著流動相的移動而在兩相中進行不斷的分配。其種類主要分為親和層析、離子交換層析、疏水作用層析以及凝膠層析4 方面。蔡思澤等通過SDS-PAGE 和western-blot 方法檢測目的蛋白的表達，并根據(jù)表達量篩選高產(chǎn)菌株。在此基礎上，通過硫酸銨沉淀、親和層析純化重組膠原蛋白，進而研究了重組膠原蛋白的抗氧化活性。并通過電鏡觀察膠原蛋白的結(jié)構(gòu)，為膠原蛋白的應用奠定一定基礎。潘明利通過大腸桿菌發(fā)酵的方式來表達重組膠原蛋白，并通過鎳離子柱親和層析及隨后的蛋白質(zhì)透析的方法對獲得的重組膠原蛋白進行分離和純化。為了盡可能采取最少的工藝步驟，來獲得最大的回收率。朱少瑜用畢赤酵母表達重組人白細胞介素11（rhIL-11）的純化生產(chǎn)工藝和以特寶rhIL-11（特爾康）的純化生產(chǎn)工藝為對比，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是相同的。王皓等使用柱層析技術在重組試驗采用Ni Sepharose6Fast Flow 樹脂親和層析進行純化，取收集的洗脫液進行SDSPAGE 電泳，并用洗脫Buffer 做空白對照，純化后得到了目的蛋白經(jīng)軟件分析可知其純度＞90%，為重組膠原蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)應用奠定基礎。此外，純化時費用偏高，純化費用占總生產(chǎn)成本的20%～30%。因此，在進行蛋白純化工藝的設計時，應根據(jù)自己實際情況來選擇合適的柱層析種類。

4 重組膠原蛋白的多方面應用

重組膠原蛋白可以作為皮膚再生和修復的生物材料，用于治療各種皮膚損傷和疾病，如燒傷、創(chuàng)傷、疤痕、痤瘡等。它可以促進皮膚細胞的增殖和分化，促進皮膚的再生和修復，改善皮膚的外觀和質(zhì)量。劉講嬌研究重組膠原蛋白貼敷料將其應用于術后皮膚修復使皮膚屏障功能、創(chuàng)面恢復時間、舒適度這幾方面取得了一些實際效果，并在酵母重組膠原蛋白貼敷料中加入甘油能夠增加敷料的黏性，可提升患者舒適度。

重組膠原蛋白可用于骨折愈合、關節(jié)置換、脊柱融合等骨科手術中，促進骨細胞的增殖和骨組織的形成。張珊珊構(gòu)建大鼠5mm 顱骨缺損模型，采用CT、MRI 等儀器對顱骨缺損模型進行分析觀察，結(jié)果表明重組膠原蛋白CL 有望作為一種生物醫(yī)用材料用于骨修復。重組膠原蛋白作為一種生物材料，在組織工程和再生醫(yī)學領域中具有廣泛的應用。另外，重組膠原蛋白還可以作為心肌修復的支架材料，用于心肌缺血和心肌梗死的治療。Yang 等利用重組Ⅲ型膠原蛋白制備三維多孔支架及水凝膠材料已被應用于醫(yī)學組織工程領域的應用研究中。

組織工程是一種利用生物材料、生物活性分子和細胞等技術，構(gòu)建組織和器官的新方法。曾斐鴻[5]進行了重組Ⅳ-α1 蛋白理化性質(zhì)的初步探究,為重組膠原蛋白Ⅳ-α1 應用于組織工程材料打下堅實的基礎。重要的是，這是首次通過HEK293F 細胞瞬時表達系統(tǒng)實現(xiàn)了膠原蛋白Ⅳ-al 編碼區(qū)全長序列的分泌表達，為重組膠原蛋白Ⅳ-al 應用于工業(yè)化生產(chǎn)和組織工程材料拉開了序幕。再生醫(yī)學是一種利用生物學和工程學的原理和方法，通過激發(fā)和促進組織、器官或整個身體的自我修復和再生能力，治療各種疾病的新興醫(yī)學領域。李偉娜等為提高重組畢赤酵母發(fā)酵重組人Ⅲ型膠原蛋白產(chǎn)量，采用響應面對其生長階段的BMGY 培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化。通過Placket-Burman 試驗使該重組膠原蛋白對大鼠乙酸灼傷胃黏膜有明顯修復作用,為生物醫(yī)用材料的應用制備奠定了基礎。

總之，重組膠原蛋白在組織工程和再生醫(yī)學領域中具有廣泛的應用前景，有望為眾多臨床醫(yī)療問題提供有效的解決方案。

5 未來展望和挑戰(zhàn)

隨著人們對生活品質(zhì)和健康水平要求的提高，重組膠原蛋白在生物醫(yī)學和生命科學領域的應用前景更是不可限量。但是在應用過程中也面臨一些挑戰(zhàn)和問題。其中最主要的挑戰(zhàn)是如何解決重組膠原蛋白的穩(wěn)定性和成本問題。重組膠原蛋白在制備和儲存過程中易受到熱、光、pH 等因素的影響而發(fā)生變性或降解，從而導致其性質(zhì)和功能的損失。此外，重組膠原蛋白的制備成本也較高，需要進一步降低成本以推廣其應用。

為了解決這些問題，科學家們正在開展一系列的研究。研究人員正在探索使用表面改性、交聯(lián)和包覆等手段來提高重組膠原蛋白的穩(wěn)定性。同時，新的生產(chǎn)技術，如分子印跡、發(fā)酵技術等，也被引入到制備過程中，以提高產(chǎn)量和降低成本。

此外，也有研究人員探索使用合成材料替代天然的膠原蛋白。這些合成材料具有更好的穩(wěn)定性和可控性，同時具有良好的生物相容性，可以有效地替代膠原蛋白在生物醫(yī)學領域的應用。