梁 赫, 邵雪花, 秦子昕, 溫雪梅, 路 偉*

(1.新疆農業(yè)大學農學院,棉花教育部工程研究中心, 自治區(qū)農林有害生物監(jiān)測與安全防控重點實驗室, 烏魯木齊 830052; 2.廣東省農業(yè)科學院果樹研究所,農業(yè)農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室, 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室, 廣州 510640)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)屬于鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,主要為害棉花、玉米、大豆、馬鈴薯等農作物,我國棉區(qū)與蔬菜種植區(qū)均受到其為害,其中西北各省、黃河、遼河以及長江流域的棉區(qū)受害嚴重[1]。棉鈴蟲暴發(fā)期,可造成蕾鈴脫落率達到50%以上,影響棉花正常生長,造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。目前對棉鈴蟲的防治主要以化學防治為主,生物防治為輔。但由于長期大量施用化學農藥,在對環(huán)境造成污染的同時,還使棉鈴蟲產(chǎn)生了抗藥性[3],而生物農藥因對人畜安全,對環(huán)境污染小[4],已成為目前農藥的重點研發(fā)方向。印楝素對鱗翅目、直翅目和鞘翅目等多種農業(yè)害蟲具有良好的拒食效果[5],因其對靶標生物高效,對非靶標生物安全,對環(huán)境污染小,易分解和不破壞生態(tài)平衡,被認為是最適合于商品化開發(fā)的植物源殺蟲劑之一[4]。但印楝素目前只能從印楝Azadirachtaindica種子中提取,而種子收獲具有一定的季節(jié)性,導致印楝素價格昂貴,難以大規(guī)模推廣應用[6-7]。因此尋找新型環(huán)境友好型植物源農藥尤為重要。

寬纓酮(eurycomanone,EN)是一種苦木素二萜類化合物,來源于東革阿里Eurycomalongifolia(Jack)的根部[8-9],對抑制脂肪生成,預防肥胖具有一定效果,被廣泛用于醫(yī)學領域[10]。但其農用活性,特別是對昆蟲的生物活性卻鮮見研究報道。本課題組從東革阿里中分離得到寬纓酮,發(fā)現(xiàn)其能損傷小菜蛾Plutellaxylostella口器和中腸,抑制其生長發(fā)育[11]。故本文以印楝素(azadirachtin)為對照,研究寬纓酮對棉鈴蟲的拒食作用和對生長發(fā)育的影響,以期為其開發(fā)利用提供理論依據(jù),同時也為棉鈴蟲的生物防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及飼養(yǎng)

供試棉鈴蟲由河南省科云生物有限公司提供,使用人工飼料在恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng),飼養(yǎng)期間未使用任何殺蟲劑。飼養(yǎng)條件為:溫度(26±1)℃,相對濕度(70±10)%,光周期L∥D=14 h∥10 h。

飼養(yǎng)流程:將未凝固的人工飼料放入滅菌培養(yǎng)瓶中,待飼料凝固后用細毛筆將初孵幼蟲接入扎孔的培養(yǎng)瓶中,墊上一層滅菌紙,防止其逃逸。待棉鈴蟲幼蟲生長到3齡初期時,將幼蟲轉移到含有人工飼料的培養(yǎng)瓶中單頭飼養(yǎng),化蛹后將蛹取出消毒然后放入養(yǎng)蟲籠,成蟲羽化后飼喂10%蜂蜜水,并在養(yǎng)蟲籠頂部蓋上白色紗布供其產(chǎn)卵。每天更換紗布,將帶卵紗布放于自封袋中,放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待其孵化后按照上述方法繼續(xù)飼養(yǎng)下一代。養(yǎng)蟲所用的工具及器皿在使用前后均嚴格消毒。

1.2 儀器與藥劑

供試儀器:SPX-250B-G型微電腦光照培養(yǎng)箱,上海博迅實業(yè)有限公司;體視顯微鏡(MZ101)、顯微鏡相機(MSX2),廣州明美光電技術有限公司;FB224 電子天平(1/10 000),上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

供試藥劑:寬纓酮,純度≥98%,CAS號:84633-29-4,購于四川省維克奇生物科技有限公司,其化學結構式如圖1所示。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),純度≥99.8%,購于北京索萊寶科技有限公司;tween-80(A100442-0500),購于上海博格隆生物技術公司;印楝素,純度≥98%,華南農業(yè)大學亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室提供。

圖1 寬纓酮的化學結構式

1.3 試驗方法

1.3.1寬纓酮對棉鈴蟲的非選擇性拒食活性測定

采用浸漬葉碟法測定[12]。具體步驟:使用打孔器在鮮嫩的甘藍(京包菜)上打取直徑為1.3 cm的圓形葉碟,備用。用二甲基亞砜將寬纓酮和印楝素分別配制成10 mg/mL母液,再用0.3% tween-80水溶液稀釋為6.25、12.5、25、50 μg/mL和100 μg/mL 5個濃度。將葉碟放入不同濃度藥液中浸漬8～10 s,取出后放于干凈玻璃板上自然晾干。以0.3% tween-80水溶液處理的葉碟為對照。取大小一致且饑餓處理4 h的棉鈴蟲1齡幼蟲放于培養(yǎng)瓶中,每瓶10頭,為1個重復,每個濃度設3次重復。將1片浸藥葉碟放置于培養(yǎng)瓶中,在瓶口處放一張滅菌紙,將已扎孔瓶蓋蓋緊,防止幼蟲逃逸。將培養(yǎng)瓶放置于溫度(26±1)℃,相對濕度(70±10)%,光周期L∥D=14 h∥10 h的恒溫培養(yǎng)箱中。隨時觀察對照組葉片被取食情況,待對照組葉片被取食1/2以上,立刻在所有培養(yǎng)瓶中注滿水,阻止棉鈴蟲幼蟲繼續(xù)取食。將棉鈴蟲幼蟲全部剔除,將被取食的葉碟平鋪在玻璃板上,做好標記,并拍照掃描,掃描分辨率設置為600 dpi,用于計算取食面積。

1.3.2寬纓酮對棉鈴蟲的選擇性拒食活性測定

葉片處理方法同非選擇性拒食活性測定。葉碟分別在濃度為20、50、100 μg/mL的寬纓酮溶液中浸漬8～10 s,以0.3% tween-80水溶液處理為對照。處理組葉片與對照組葉片各取1片,正面朝上對稱放于襯有濕濾紙的8.5 cm培養(yǎng)皿兩端,在每個培養(yǎng)皿中間,距兩片葉片相等距離處接入10頭大小一致饑餓處理4 h的棉鈴蟲1齡末幼蟲,為1個重復,每個濃度設3次重復。用保鮮膜封住皿口并在膜上扎數(shù)個孔,用封口膜封緊,放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后將棉鈴蟲幼蟲剔除,將被取食的葉碟平鋪在玻璃板上,做好標記,并拍照掃描,掃描分辨率設置為600 dpi,用于計算取食面積。

1.3.3寬纓酮對棉鈴蟲幼蟲生長發(fā)育影響的測定

采用飼料混毒法[13]測定棉鈴蟲的生長發(fā)育指標。稱取一定量固體飼料,使用微波爐加熱使其熔化,加入寬纓酮溶液使其含量為10 μg/g,充分攪拌使其與飼料混合均勻。選取一定數(shù)量的棉鈴蟲初孵幼蟲,分別接入正常飼料及添加寬纓酮的飼料中,待對照棉鈴蟲幼蟲生長至2齡時,分別選取50頭幼蟲轉移至培養(yǎng)瓶中單頭喂飼,根據(jù)情況及時添加新鮮飼料。每天隨機抽取10頭幼蟲稱取體重,稱重后將棉鈴蟲放回繼續(xù)飼養(yǎng),直至幼蟲化蛹,并記錄數(shù)據(jù),期間每天拍照;成蟲羽化后飼喂10%蜂蜜水,每天觀察成蟲產(chǎn)卵情況,對照與處理分別隨機挑選300粒卵,觀察其孵化情況,并記錄數(shù)據(jù)。上述試驗重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)的計算方法及統(tǒng)計分析

各處理的非選擇性拒食率[14]、選擇性拒食率[15]、化蛹率、蛹畸形率、羽化率、成蟲的畸形率分別按照以下公式計算。使用Adobe Photoshop CC 2019計算取食面積,使用DPS軟件計算拒食中濃度AFC50,使用SPSS 21.0中的單因素方差分析進行統(tǒng)計分析,使用Origin 2017進行統(tǒng)計分析及作圖。

害蟲取食面積(S)=單個葉碟面積-剩余葉碟面積=πr2-πr2/A×剩余葉碟像素值=πr2(1-剩余葉碟像素值/A),其中r為葉碟的半徑,A為空白處理組單個葉碟的像素值。

非選擇性拒食率=(對照組取食葉面積-處理組取食葉面積)/對照組取食葉面積×100%=[1-(A-處理組剩余像素值)/(A-對照組取食像素值)]×100%;

選擇性拒食率=(對照組取食葉面積-處理組取食葉面積)/(對照組取食葉面積+處理組取食葉面積)=(處理組剩余像素值-對照組剩余像素值)/[(A-對照組剩余像素值)+(A-處理組剩余像素值)]×100%;

化蛹率=化蛹的試蟲數(shù)/試蟲總數(shù)×100%;

蛹畸形率=畸形蛹數(shù)/總化蛹數(shù)×100%;

羽化率=羽化的試蟲數(shù)/化蛹數(shù)×100%;

成蟲畸形率=畸形的成蟲數(shù)/羽化的試蟲數(shù)×100%;

孵化率=孵化的卵粒數(shù)/卵粒總數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 寬纓酮與印楝素對棉鈴蟲幼蟲的拒食活性

寬纓酮和印楝素對棉鈴蟲1齡幼蟲的拒食中濃度分別為12.04 μg/mL和21.62 μg/mL(表1)。印楝素處理的拒食中濃度比寬纓酮處理組高0.80倍,寬纓酮對棉鈴蟲的拒食活性顯著高于印楝素。圖2表明:寬纓酮對棉鈴蟲具有明顯拒食效果,其拒食效果與印楝素相似,濃度越高拒食效果越明顯。

圖2 寬纓酮和印楝素對棉鈴蟲1齡幼蟲的拒食活性

表1 寬纓酮與印楝素對棉鈴蟲1齡幼蟲的拒食活性測定

寬纓酮濃度為20、50、100 μg/mL時的拒食率分別為34.49%、57.93%、66.87%(表2),選擇性拒食活性隨濃度增加而增加,3個濃度處理間存在顯著差異(F2,6=56.25,P<0.05)。與對照相比，寬纓酮濃度越高對棉鈴蟲的選擇性拒食效果越明顯(圖3)。

表2 寬纓酮對棉鈴蟲的選擇性拒食活性1)

圖3 寬纓酮對棉鈴蟲幼蟲選擇性拒食活性

2.2 寬纓酮對棉鈴蟲幼蟲生長的抑制作用

10 μg/g寬纓酮處理后棉鈴蟲幼蟲的體重顯著低于對照組(P<0.05,圖4a);處理后第10～12 天,對照組棉鈴蟲幼蟲為5～6齡,而寬纓酮處理組的幼蟲僅為3～4齡(圖4b),幼蟲的體重比對照低87.90%、88.04%和80.74%?？梢?寬纓酮處理后可以明顯抑制棉鈴蟲幼蟲的生長。

圖4 寬纓酮對棉鈴蟲幼蟲生長的影響

2.3 寬纓酮對棉鈴蟲化蛹時間和蛹重的影響

對照組棉鈴蟲幼蟲從第14天開始化蛹,日均化蛹數(shù)量隨時間先增加后減少,在第16天和第17天化蛹數(shù)量最多,為15頭左右。寬纓酮處理的幼蟲從第19天開始化蛹,比對照組推遲5 d左右;日均化蛹數(shù)量隨時間也表現(xiàn)為先增加后減少,在第22天化蛹數(shù)量最多,為12頭左右,低于對照組的峰值(圖5a)。對照組的平均蛹重為0.303 8 g(圖5b),約為寬纓酮處理組的1.36倍(P<0.05)。

圖5 寬纓酮對棉鈴蟲化蛹時間及蛹重的影響

2.4 寬纓酮處理后棉鈴蟲的化蛹率、蛹畸形率、羽化率、成蟲畸形率和卵孵化率

寬纓酮處理組棉鈴蟲幼蟲的化蛹率、羽化率和卵孵化率均顯著低于對照(P<0.05),分別比對照低26.00、37.39和14.98百分點;而蛹畸形率和成蟲畸形率均顯著高于對照(P<0.05),分別是對照的2.89倍和3.33倍(圖6a)。可見,寬纓酮不僅降低了棉鈴蟲的化蛹率、羽化率和卵孵化率,同時還提高了蛹和成蟲的畸形率。寬纓酮處理造成的棉鈴蟲成蟲畸形主要表現(xiàn)為翅發(fā)育不良,不能正常展翅;而蛹的畸形主要表現(xiàn)為不能正常蛻皮或蛻皮不完全,蛹干癟(圖6b)。

圖6 寬纓酮對棉鈴蟲化蛹率、蛹畸形率、羽化率、成蟲畸形率和孵化率的影響

3 結論與討論

棉鈴蟲作為雜食性害蟲,嚴重威脅我國棉花、玉米、小麥等農作物的生產(chǎn),造成嚴重的經(jīng)濟損失[16]?！笆濉逼陂g,農業(yè)農村部提出化肥農藥“零增長”計劃,尋找高效防治棉鈴蟲的植物源農藥迫在眉睫。植物源農藥是利用植物本身或次生代謝產(chǎn)物作用于靶標生物[17]的一類生物農藥,因其在自然界中易降解,無殘留,對非靶標生物安全等特點,成為近幾年農藥開發(fā)的重要方向之一[18]。

目前已發(fā)現(xiàn)一些天然產(chǎn)物對棉鈴蟲具有拒食或抑制其生長發(fā)育的作用,如將何首烏Pleuropterusmultiflorus根磨成干粉與飼料(1∶10)混勻,飼喂棉鈴蟲3齡幼蟲,第5 天時對幼蟲體重抑制率可達90%,幼蟲歷期延長6 d[19];菖蒲Acoruscalamus乙醇提取物對棉鈴蟲3齡幼蟲具有明顯的拒食作用和抑制生長作用,其拒食中濃度和生長抑制中濃度分別為10.43 mg/mL和7.15 mg/mL[20];黃頂菊Flaveriabidentis干粉的乙醇提取物對棉鈴蟲幼蟲3齡幼蟲有明顯的拒食和抑制生長發(fā)育作用,其24 h的拒食率可達50.49%,藥后3 d體重抑制率可達51.44%[21]。茜草Rubiacordifolia處理棉鈴蟲3齡幼蟲后5 d,對蟲重抑制率高達89.3%,幼蟲歷期延長12.6 d,茜草干粉處理棉鈴蟲后5 d,對體重抑制率高達92.4%,幼蟲不能化蛹[22]。與其他植物源農藥[23]相似,寬纓酮不直接殺死棉鈴蟲,而是使棉鈴蟲拒食導致其取食量下降,生長發(fā)育受到抑制,不能正常蛻皮,畸形,不能正常交配繁殖,進而達到控制棉鈴蟲的作用。

本研究發(fā)現(xiàn),寬纓酮對棉鈴蟲的拒食中濃度比印楝素低0.44倍左右,該結果與寬纓酮對小菜蛾的拒食中濃度是印楝素對小菜蛾拒食中濃度的1/2結果[11]相似。取食含10 μg/g寬纓酮的飼料,棉鈴蟲體重增長受到抑制,取食11 d幼蟲體重比對照低88.04%,化蛹時間推遲5 d左右,與紫薇Lagerstroemiaindica干粉及其提取物對棉鈴蟲體重抑制率為80.89%,化蛹時間推遲4.3 d的研究結果[24]相似。但寬纓酮對棉鈴蟲2齡幼蟲表現(xiàn)出明顯抑制作用,說明棉鈴蟲低齡幼蟲對藥物敏感,推薦在棉鈴蟲1齡期開始施藥[25]。同時,取食含寬纓酮的飼料后棉鈴蟲的蛹重比對照下降26.53%,這可能是由于幼蟲生長受到抑制,化蛹前體重較輕。取食含寬纓酮的飼料后,棉鈴蟲的化蛹率、羽化率和卵孵化率降低,蛹和成蟲的畸形率增加,可能是因為寬纓酮干擾了棉鈴蟲幼蟲的代謝,使其無法積累足夠的營養(yǎng)物質用于蛻皮、化蛹與羽化,導致蛹和成蟲的畸形[26]。

本研究表明,寬纓酮對棉鈴蟲具有良好的拒食和抑制生長發(fā)育的作用,具備開發(fā)成為新型植物源農藥的潛力。未來應探尋其作用機理,闡明其作用方式,為將天然產(chǎn)物寬纓酮開發(fā)成為新型植物源農藥提供理論依據(jù)。