杜江峰,吳 瑤,向 祥,汪 峰,張鈴鐺,李 驥

重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 404000

腦出血是常見(jiàn)多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)腦血管疾病，也是發(fā)病率、致殘率和死亡率高的中風(fēng)亞型，占全球所有中風(fēng)的10%～20%，30 d內(nèi)死亡率在30%～50%，即使是幸存者也經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致腦損傷和嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。因此，了解腦出血誘導(dǎo)的腦損傷和神經(jīng)損傷的潛在機(jī)制有利于減輕腦損傷并改善腦出血后的神經(jīng)功能恢復(fù)。目前，研究證實(shí)了腦出血后的炎癥反應(yīng)參與了腦損傷[3]。微小RNA(miRNA)是一種小型、非編碼的調(diào)節(jié)性RNA，與目標(biāo)mRNA配對(duì)可抑制mRNA的翻譯過(guò)程，或?qū)е耺RNA的降解，且在血清中穩(wěn)定存在，在疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用。miR-331-3p是miR-331家族成員之一，對(duì)其的研究主要專注于癌癥中，最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p在病理生理變化中異常表達(dá)，與炎癥反應(yīng)相關(guān)，具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用[4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族(NLRs)是一種主要的先天免疫傳感器，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，近年來(lái)關(guān)于NLR在神經(jīng)損傷方面的研究越來(lái)越多[5]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白6(NLRP6)是NLR家族的一員，參與炎癥性疾病和宿主防御機(jī)制，其表達(dá)在許多生理和病理過(guò)程中受到嚴(yán)格調(diào)控[6]。在小鼠中的研究表明，miR-331-3p和NLRP6在腦出血的炎癥反應(yīng)中具有重要作用，但其在腦出血患者血清中的表達(dá)水平及與患者病情嚴(yán)重程度及神經(jīng)損傷的關(guān)系目前尚未被研究[7]。因此，本研究檢測(cè)腦出血患者血清中miR-331-3p和NLRP6的表達(dá)水平，初步探討了其表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度及神經(jīng)損傷的關(guān)系，旨在為臨床制訂新的治療措施提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取2016年5月至2018年5月于本院神經(jīng)外科診治的92例腦出血患者作為觀察組，其中男50例，女42例，年齡25～75歲，平均(50.26±11.56)歲。同時(shí)，選取同期體檢的92例體檢健康者為對(duì)照組，其中男44例，女48例，年齡30～78歲，平均(51.76±12.09)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者在發(fā)病后24 h內(nèi)入院治療，經(jīng)顱腦CT檢查確認(rèn)出現(xiàn)出血灶；(2)符合《中國(guó)腦血管病防治指南》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)含潛在血管病變、凝血功能受損和腫瘤出血的患者；(2)近1個(gè)月內(nèi)發(fā)生感染的患者；(3)頭部外傷造成出血的患者；(4)合并其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者。本研究取得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得了對(duì)照組和患者本人及親屬的書(shū)面知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集與保存 采集觀察組和對(duì)照組清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的靜脈血5 mL，在4 ℃條件下3 000×g離心10 min后，從血液中分離出血清后分裝到無(wú)菌的離心管內(nèi)，在-80 ℃保存至測(cè)定。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)miR-331-3p和NLRP6的表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，使用TRIzol(貨號(hào)：10296028，購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司)從觀察組和對(duì)照組的血清中提取總RNA。然后取0.5～1.0 μL的RNA使用PrimeScriptM RT Reagent Kit(貨號(hào)：RR037A，購(gòu)于日本TaKaRa公司)根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，使用TB Green?Premix Ex Taq Ⅱ Kit(貨號(hào)：RR820A，購(gòu)于購(gòu)于日本TaKaRa公司)在ABI7500熒光定量系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR分析。定量引物使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，分別以U6和GAPDH作miR-331-3p和NLRP6的內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1，引物干粉由上海生工生物公司合成。采用2-ΔΔct法分析各組表達(dá)水平，計(jì)算步驟為：(1)計(jì)算對(duì)照組6個(gè)復(fù)孔的miR-331-3p或NLRP6 ct的平均值，ct miR-331-3p或NLRP6對(duì)照組=ct對(duì)照組-miR-331-3p或NLRP6 ct的平均值，ct miR-331-3p或NLRP6觀察組=ct觀察組-miR-331-3p或NLRP6 ct的平均值；(2)同樣的方法計(jì)算出ct內(nèi)參對(duì)照組和ct內(nèi)參觀察組；(3)計(jì)算ct miR-331-3p或NLRP6對(duì)照組=ct miR-331-3p或NLRP6對(duì)照組-ct內(nèi)參對(duì)照組，ct miR-331-3p或NLRP6觀察組=ct miR-331-3p或NLRP6觀察組-ct內(nèi)參觀察組；(4)計(jì)算2-ΔΔct，即各組miR-331-3p或NLRP6的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-RCR引物序列

1.2.3腦出血嚴(yán)重程度及神經(jīng)損傷程度評(píng)定 根據(jù)入院時(shí)頭顱CT檢測(cè)結(jié)果，采用多田氏公式(ABC/2)法計(jì)算血腫體積評(píng)估病情嚴(yán)重程度，A：最大出血層面血腫的最長(zhǎng)徑，B：最大出血層面血腫的寬，C：血腫層面之間的厚度?；颊呖煞譃榇笱[組(>25 mL)，中血腫(11～25 mL)，小血腫組(<11 mL)。根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分評(píng)定腦出血患者的神經(jīng)功能受損程度，包括意識(shí)清醒程度和肌力等級(jí)等項(xiàng)目。NIHSS評(píng)分總分為42分，患者可分為輕型患者組(1～4分)，中型患者組(>4～15分)，重型患者組(>15分)[9]。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清miR-331-3p和NLRP6表達(dá)水平的差異 RT-PCR結(jié)果顯示，觀察組中miR-331-3p表達(dá)水平與對(duì)照組相比降低，而觀察組中NLRP6表達(dá)水平與對(duì)照組相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組血清miR-331-3p和NLRP6表達(dá)水平的差異

2.2不同血腫體積患者中血清miR-331-3p和NLRP6表達(dá)水平的差異 根據(jù)血腫體積大小將92例患者劃分為21例大血腫組，33例中血腫組和38組小血腫組。結(jié)果如表3所示，miR-331-3p表達(dá)水平在大血腫組患者血清中低于中、小血腫組，在中血腫組患者血清中低于小血腫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NLRP6表達(dá)水平在大血腫組患者血清中高于中、小血腫組，在中血腫組患者血清中高于小血腫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 不同血腫體積患者中血清miR-331-3p和NLRP6表達(dá)水平的差異

2.3不同神經(jīng)損傷患者中血清miR-331-3p和NLRP6表達(dá)水平的差異 根據(jù)NIHSS評(píng)分將92例患者劃分為33例輕型患者組、40例中型患者組和19例重型患者組。結(jié)果如表4所示，miR-331-3p表達(dá)水平在重型患者組血清中低于輕、中型患者組，在中型患者組血清中低于輕型患者組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NLRP6表達(dá)水平在重型患者組血清中高于輕、中型患者組，在中型患者組血清中高于輕型患者組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 不同神經(jīng)損傷患者中血清miR-331-3p和NLRP6表達(dá)水平的差異

2.4觀察組患者血清miR-331-3p、NLRP6表達(dá)水平與血腫體積和NIHSS評(píng)分的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腦出血患者的血清miR-331-3p表達(dá)水平與血腫體積和NIHSS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.539，P<0.05；r=-0.597，P<0.05)，血清NLRP6表達(dá)水平與血腫體積和NIHSS評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.738，P<0.05；r=0.705，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：A為血清miR-331-3p與NLRP6評(píng)分的相關(guān)性；B為血清miR-331-3p對(duì)血腫體積的相關(guān)性；C為血清NLRP6與HIHSS評(píng)分的相關(guān)性；D為血清NLRP6與血腫體積的相關(guān)性。圖1 觀察組患者血清miR-331-3p、NLRP6表達(dá)水平與血腫體積和NIHSS評(píng)分的相關(guān)性分析

2.5觀察組患者血清miR-331-3p與NLRP6表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果腦出血患者血清中miR-331-3p表達(dá)水平與NLRP6表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.483，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 觀察組患者血清miR-331-3p與NLRP6表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討 論

隨著人口的老齡化，腦出血的發(fā)病率也在逐漸升高，是社會(huì)上面臨的重大的公共健康問(wèn)題[1]。腦出血后的水腫、炎癥反應(yīng)等共同引起繼發(fā)性腦損傷，細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能受損，而目前對(duì)于腦出血這一疾病的臨床治療方式仍沒(méi)有突破性進(jìn)展[9-10]。從分子角度探索腦出血引起的神經(jīng)炎癥損傷的機(jī)制，能夠?yàn)閷ふ遗R床治療腦出血后遺癥的有效靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

miRNAs對(duì)腦出血的影響是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，大量結(jié)果證實(shí)了miRNAs廣泛參與腦出血后的病理生理機(jī)制，在腦出血后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮積極或消極的作用。例如，miR-223在腦出血疾病中通過(guò)下調(diào)NLRP3，抑制炎癥反應(yīng)，從而改善神經(jīng)功能[11]。miR-331-3p是miR-331家族的一員，位于12q22n染色體上，越來(lái)越多的研究報(bào)道，miR-331-3p在疾病中發(fā)揮重要作用。朱金源等[12]在急性肺損傷中發(fā)現(xiàn)miR-331-3p表達(dá)水平下降，并且可通過(guò)調(diào)控CCR1的表達(dá)水平參與該疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。LIU等[4]在阿爾茨海默病患者的血清中發(fā)現(xiàn)miR-331-3p表達(dá)降低，并與患者的簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表評(píng)分和促炎細(xì)胞因子水平相關(guān)，提示miR-331-3p具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。NIE等[7]在小鼠中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次提示，miR-331-3p可能在腦出血后的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。本研究在腦出血患者的血清中同樣發(fā)現(xiàn)miR-331-3p的表達(dá)水平下降，說(shuō)明血清miR-331-3p的表達(dá)水平在腦出血的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。血腫體積和NIHSS評(píng)分與患者的病情和神經(jīng)功能密切相關(guān)，本研究結(jié)果顯示，血清miR-331-3p在不同血腫體積的患者和不同NIHSS評(píng)分的患者中的表達(dá)水平存在差異，大血腫患者miR-331-3p表達(dá)水平低于中、小血腫患者，重型患者miR-331-3p表達(dá)水平低于中、輕型患者，進(jìn)一步分析顯示血清miR-331-3p表達(dá)水平與腦出血患者的血腫體積和NIHSS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，表明血清miR-331-3p的水平與腦出血的嚴(yán)重程度和神經(jīng)損傷程度之間存在密切關(guān)聯(lián)。

NLRP6是報(bào)道的第一個(gè)能抑制先天免疫反應(yīng)的NLRP家族成員，之前有研究證實(shí)其在腦缺血/再灌注損傷后表達(dá)上調(diào)，具有炎癥小體依賴性促炎作用，可作為炎癥性疾病潛在的治療靶點(diǎn)[13]。XIAO等[14]發(fā)現(xiàn)NLRP6炎性小體可能通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和IL-18參與腦出血后的炎癥反應(yīng)，敲低NLRP6可減輕腦出血后的腦損傷、緩解炎癥并抑制自噬。NLRP6的研究大都集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，本研究檢測(cè)了腦出血患者的血清中NLRP6的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比表達(dá)水平增加，說(shuō)明NLRP6表達(dá)水平與腦出血的發(fā)生有關(guān)。不同血腫體積的患者和不同NIHSS評(píng)分的患者中NLRP6的表達(dá)水平存在差異，大血腫患者NLRP6表達(dá)水平高于中、小血腫患者，重型患者NLRP6表達(dá)水平高于中、輕型患者，且血清NLRP6表達(dá)水平與腦出血患者的血腫體積和NIHSS評(píng)分呈正相關(guān)，表明NLRP6在腦出血后的腦損傷和神經(jīng)功能障礙中具有重要作用，可能參與腦損傷和神經(jīng)功能障礙發(fā)生過(guò)程。

miR-331-3p涉及多個(gè)神經(jīng)生物學(xué)過(guò)程的信號(hào)通路，并且此前的研究提出miR-331-3p下調(diào)可增加NLRP6表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腦出血后小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)[7,15]。本研究分析結(jié)果與之相似，腦出血患者血清中miR-331-3p與NLRP6表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明兩者共同影響了腦出血患者的病情和神經(jīng)受損程度，可作為臨床改善腦出血后損傷的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，腦出血患者血清中miR-331-3p表達(dá)水平降低，NLRP6表達(dá)水平升高，隨著病情和神經(jīng)受損程度的加重，miR-331-3p表達(dá)水平逐漸降低，NLRP6表達(dá)水平逐漸升高，兩者表達(dá)水平與腦出血患者的病情嚴(yán)重程度和神經(jīng)受損程度相關(guān)，共同參與腦出血的發(fā)展過(guò)程，可能作為腦出血臨床治療的靶點(diǎn)。