劉華林,李亞楠,字 敏,陳 政,段愛紅,袁黎明(云南師范大學化學化工學院,云南 昆明 650500)

在自然界的生命活動中,都有手性識別這個重要因素存在,從物種和數(shù)目上來研究,有機生命體幾乎都是由手性分子組成的[1]。特別是具有手性的藥物,雖然同一化合物的兩種光學異構體化學特性以及物理特性幾乎相同,但因其藥物對生命作用的靶位或受體是核酸和蛋白質等具有手性的生物大分子,因此對與其相作用的藥物分子也具有手性選擇性,這也導致手性藥物在生命體的生命代謝中通常呈現(xiàn)較大的藥理、毒理差異性,而在藥物動力學、藥效學方面也具有不同的功能作用[2,3]。目前用于臨床的藥物有4 000余種,其中約一半是人工合成藥物,而這些合成藥物中又有近50%是外消旋體[4]。隨著人們對單一手性藥物需求的增長,探索獲得純對映體的有效途徑變得越來越迫切,因此,探索有效分離對映體的新材料或新方法實現(xiàn)對映體的有效分離具有重要意義。

共價有機框架材料(COFs)是由有機小分子單體通過共價鍵連接形成的一種具有二維或三維結構的新型多孔晶體材料[5-8]。COFs材料作為一種純有機的晶態(tài)多孔材料,具有很多優(yōu)點,比如低密度、多變的結構和化學性質、良好的結晶度、穩(wěn)定性以及可以調節(jié)的功能[9]。因此,COFs材料是研究手性的一個很好的平臺,在手性催化、手性分離、樣品預處理[10]等領域具有潛在的應用。目前已經(jīng)有一系列功能化COFs見于報道,如TpPa系列的COFs材料,它們通過溶劑熱法[11],利用醛胺席夫堿縮合反應合成,通過后合成修飾法(PSM)進行改性,修飾上手性基團。2016年,Yan等[12]將手性羧酸衍生物引入到COFs結構中。將手性二乙酰-L-酒石酸酐與1,3,5-三甲酰基間苯三酚發(fā)生酯化反應,酒石酸酐開環(huán)后得到含3個甲?；娜人嵫苌顲Tp。以CTp為C3對稱單體,分別與1,4-苯二胺(Pa-1)、2,5-二甲基對苯二胺(Pa-2)和聯(lián)苯胺(BD)的C2對稱單體發(fā)生縮合反應,自下而上地制備了CTpPa-1、CTpPa-2和CTpBD這3種羧酸類手性COFs材料。所制備的3種羧酸類手性COFs材料具有良好的手性分離性能,上海交通大學崔勇團隊[13]于2018年合成了第一例具有手性醇特征的三維手性COFs材料。仍然采用C2對稱的四芳基-1,3-二氧戊環(huán)-4,5-二甲醇為手性片段,衍生化得到(R,R)-四苯甲醛為醛基單元,與四面體構型的四(4-苯基)甲烷為氨基單元,發(fā)生縮合反應制備了(R,R)-COFs,進一步氧化得到酰胺官能團鏈接的(R,R)-COFs。2019年,Yuan等[14]首次將手性β-環(huán)糊精(β-CD)修飾到COFs材料中,得到了基于COFs的混合基質膜(MMMs),用于選擇性傳輸氨基酸。2022年4月,Ma等[15]報告了一種新的羥基官能化共價有機骨架TzDHNDA與[(1-苯乙基)氨基]乙酸(PEAA)通過酯化反應構建PEAA官能化COF材料TzDHNDA-PEAA。

本文通過合成TpPa-NO2,對其還原得到TpPa-NH2,使用PSM將D-葡萄糖修飾到該材料上,得到手性材料TpPa-NH2的D-葡萄糖衍生物(TpPa-NH2-Glu)。采用X射線粉末衍射分析(PXRD)、紅外光譜分析(FT-IR)、掃描電鏡(SEM)、氮氣吸附測試、圓二色譜(CD)對合成的手性COFs材料進行了表征,然后將合成的TpPa-NH2-Glu與球形硅膠混合均勻后作為高效液相色譜固定相,并采用高壓勻漿法成功制備了高效液相色譜柱。在一定條件下,用TpPa-NH2-Glu液相色譜柱對外消旋化合物和常見的苯系位置異構體進行拆分,最終有16種外消旋體和2種苯系位置異構體有不同的拆分效果,表明手性TpPa-NH2-Glu用作液相色譜固定相具有很大的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Elite P230 Ⅱ高效液相色譜儀配有AT-330柱溫箱(大連依利特公司);S-3000N掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司);Chirasca圓二色譜儀(英國Applied Photophysics公司);SX2-4-10馬弗爐(上海意豐電爐有限公司);DJ-1大功率磁力攪拌(常州申光儀器有限公司);TDZ5-WS臺式低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);1666型液相色譜裝柱機(美國Alltech有限公司);DHG-9035A鼓風電熱干燥箱(上海恒以科學儀器有限公司);ASAP2020 M+C氮氣吸附儀(美國Micromeritics公司);DZF型真空干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)。

間苯三酚(純度98%)購于鄭州阿爾法化工有限公司;三氟乙酸(純度97%)、鄰硝基苯胺(純度99%)、碘化鉀(純度98%)、高碘酸鉀(純度99%)、六亞甲基四胺(純度97%)、位置異構體o,m,p-碘苯胺和o,m,p-硝基苯胺(純度99%)均購于上海Aladdin生化科技股份有限公司;氯化鈉(純度≥99%)、D-葡萄糖(純度99%)均購于天津市風船化學試劑科技有限公司;氘代氯仿(CDCl3)、單體2-硝基-1,4-苯二胺(Pa)(純度≥98%)、三乙胺(純度≥99%)、二茂鐵二氯化鈀(純度99%)、均三甲苯(純度99%)、無水SnCl2(純度99%)均購于上海Aadmas試劑有限公司;1,4-二氧六環(huán)(純度98%)以及外消旋化合物鹽酸普萘洛爾、華法林、美托洛爾、佐匹克隆、精氨酸、阿替洛爾、吲哚洛爾、3-芐氧基-1,2-丙二醇、3-丁炔-2-醇、2-丁胺、1,3-丁二醇、2-溴丙酸乙酯、丙二醇單甲醚、1,2-環(huán)氧辛烷、環(huán)氧溴丙烷、D,L-2-苯基丙醛(純度99%)均購于美國Sigma-Aldrich公司;硅膠(UniSil 5-100)購于蘇州納微科技有限公司。

1.2 1,3,5-三甲醛間苯三酚(Tp)的合成

根據(jù)已有文獻[16]合成了1,3,5-三甲醛間苯三酚,分別取7.549 g六亞甲基四胺(54 mmol)和3.007 g間苯三酚(24.5 mmol)加入到三頸燒瓶中,真空脫氣后,在氮氣環(huán)境下,加入90 mL三氟乙酸,在100 ℃條件下攪拌3 h后,再取150 mL 0.3 mol/L的鹽酸溶液加入到反應容器中,再反應2.5 h。冷卻至室溫,用二氯甲烷萃取后,取下層有機相,蒸發(fā)溶劑后,用甲醇抽濾洗滌產(chǎn)物,得到灰白色固體1,3,5-三甲醛間苯三酚。

1.3 TpPa-NH2的合成

根據(jù)已有文獻[17]合成了TpPa-NH2,分別稱取63 mg上步合成的Tp (0.3 mmol)、48 mg 2-硝基-1,4-苯二胺(Pa-NO2,0.45 mmol)、1,3,5-均三苯甲醛(0.75 mL)、1,4-二氧六環(huán)(0.75 mL)和0.5 mL 3 mol/L醋酸于Pyrex耐熱玻璃管中,超聲至其混合均勻,用液氮冷凍后,抽真空脫氣,用酒精噴燈封管,將Pyrex耐熱玻璃管在120 ℃下反應72 h,反應完成后,取出產(chǎn)物,依次用50 mL的丙酮、二氯甲烷洗滌數(shù)次,得到紅棕色產(chǎn)物。取3 g SnCl2·2H2O和150 mg上述合成的TpPa-NO2于50 mL的二頸燒瓶中,加入5 mL無水四氫呋喃使其混合均勻,在50 ℃條件下加熱回流3 h。反應完成后,將沉淀物用70 mL的1 mol/L鹽酸洗滌10次,用70 mL的水洗滌3次,再用100 mL丙酮洗滌一次。取上步得到的紅棕色粉末,置于合適的反應釜中,加入5 mL苯甲醚,在120 ℃下反應24 h。最后,將粉末過濾并用100 mL丙酮洗滌。得到紅棕色產(chǎn)物TpPa-NH2。

圖1 TpPa-NH2-Glu合成路線圖Fig.1 Synthetic route of TpPa-NH2-Glu

1.4 TpPa-NH2-Glu的合成

稱取150 mg TpPa-NH2、1.0 g干燥過的D-葡萄糖和20 mL的無水甲醇于二頸燒瓶中,在70 ℃條件下攪拌4 d,反應完成后,用純水洗去未反應完的葡萄糖,烘干,得到紅棕色產(chǎn)物。合成線路圖見圖1。

1.5 TpPa-NH2-Glu固定相的制備

1.5.1活化硅膠

稱取2 g均苯三甲酰氯于100 mL容量瓶中,用正己烷定容,然后稱取3.0 g球型硅膠于燒杯內(nèi),加入已配制好的溶液,浸透12 h后,將多余的溶液用滴管吸出,室溫下晾干。

1.5.2網(wǎng)包法制備固定相

將TpPa-NH2-Glu用瑪瑙研缽研磨,稱取1.0 g哌嗪于50 mL容量瓶內(nèi),加入異丙醇和2 mL三乙胺配制成50 mL溶液,稱取100 mg已研磨的TpPa-NH2-Glu加入到上述溶液中,超聲后浸泡3～4 h,吸出多余液體,在110 ℃烘箱里加熱處理15 min,備用。

1.5.3TpPa-NH2-Glu液相色譜柱的填充

取4.2 g制備好的TpPa-NH2-Glu固定相裝入50 mL小燒杯中,加入36 mL正己烷-異丙醇(9∶1,v/v)溶液,攪拌均勻后快速將懸濁液倒入勻漿罐中,用正己烷-異丙醇(9∶1,v/v)作為頂替液,在35 MPa的壓力下放置5 min,然后將壓力降至25 MPa，再放置30 min。最后,將制備好的TpPa-NH2-Glu液相色譜柱接入高效液相色譜儀,用正己烷-異丙醇(9∶1,v/v)溶液沖洗2 h,待基線平穩(wěn)后即可測樣。

1.6 色譜條件

鹽酸普萘洛爾、華法林、美托洛爾、佐匹克隆、精氨酸:液相色譜空柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Alltech,美國);流動相為甲醇-水(9∶1,v/v)；流速為0.5 mL/min,紫外檢測波長為254 nm、210 nm,柱溫為25 ℃。

其他11種外消旋化合物、o,m,p-碘苯胺和o,m,p-硝基苯胺：流動相為正己烷-異丙醇(9∶1,v/v)，其他色譜條件同上。

2 結果與討論

2.1 1,3,5-三甲醛間苯三酚的結構表征

對1,3,5-三甲醛間苯三酚進行核磁共振氫譜表征。1H NMR (500 MHz,CDCl3):10.18(s,3H,CHO),14.15(s,3H,OH)。MS (ESI,50 eV)m/z210 (M+),上述所得數(shù)據(jù)與文獻報道[16]一致,表明已經(jīng)成功合成1,3,5-三甲醛間苯三酚。

圖2 3種材料的X射線粉末衍射圖Fig.2 Powder X-ray diffraction patterns of the three materials

2.2 TpPa-NH2-Glu的結構表征

2.2.1X射線粉末衍射分析

采用X射線粉末衍射對按上述方法合成的TpPa-NO2(圖2a)、TpPa-NH2(圖2b)和TpPa-NH2-Glu(圖2c)進行了表征。根據(jù)文獻報道,TpPa-NO2在低角度4.7°顯示出第一個峰,對應于(100)反射面,以及8.1°、11.1°和27°處的峰,分別歸因于(200)、(210)和(001)反射面,屬于AA堆疊模式。由圖2看出,在4.7°、8.1°、11.1°和27°均出現(xiàn)了衍射峰,與文獻報道[17]一致,表明TpPa-NO2成功合成。經(jīng)還原的TpPa-NO2和用D-葡萄糖修飾后的TpPa-NH2得到TpPa-NH2-Glu,它們的主要衍射峰也在4.7°、8.1°、11.1°和27°處,三者的峰形和出峰的位置基本相似,這也說明還原以及修飾后的TpPa-NO2的晶型結構基本保持不變。

2.2.2紅外光譜分析

采用紅外光譜對合成的TpPa-NO2(圖3a)、TpPa-NH2(圖3b)和TpPa-NH2-Glu(圖3c)進行了表征。在圖3a中,1 523 cm-1和1 445 cm-1的吸收峰由-NO2振動產(chǎn)生。在圖3b中,1 523 cm-1和1 445 cm-1處的峰強度減弱,說明TpPa-NO2中的-NO2被還原了。在圖3c中,在1 069 cm-1處出現(xiàn)C-O的特征吸收峰,與圖3b對比,峰的強度增強,出現(xiàn)了明顯的尖銳峰,說明D-葡萄糖已成功衍生在TpPa-NH2上。

圖3 3種材料的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of the three materials

2.2.3圓二色譜分析

如圖4所示,經(jīng)過D-葡萄糖修飾后的TpPa-NH2顯示出了Cotton效應,表明葡萄糖成功修飾在COFs上,使衍生后的TpPa-NH2具有了手性。

圖4 TpPa-NH2-Glu的圓二色譜分析Fig.4 Circular dichroism analysis of TpPa-NH2-Glu

2.2.4氮氣吸附測試

為測試TpPa-NH2-Glu比表面積、空腔體積及孔徑大小,進行氮氣吸附試驗,結果見圖5,得到TpPa-NH2-Glu的比表面積為218 m2/g,孔體積為0.94 cm3/g,平均孔徑為1.79 nm,說明TpPa-NH2-Glu比表面積較大,適用于一般有機化合物的分離。

圖5 TpPa-NH2-Glu的(a)氮氣吸附脫附等溫線和(b)孔徑分布曲線Fig.5 (a) Nitrogen adsorption and desorption isotherms and (b) pore size distribution curve of TpPa-NH2-Glu

2.2.5掃描電鏡分析

為觀察TpPa-NH2-Glu是否固載到硅膠上,對網(wǎng)包后的固定相進行掃描電鏡分析。對比未網(wǎng)包的硅膠與網(wǎng)包后的固定相的掃描電鏡圖(見圖6),可以明顯看到硅膠外部網(wǎng)包上一層TpPa-NH2-Glu材料,說明通過網(wǎng)包法,所合成的手性COF材料成功固載在硅膠表面。

圖6 固定相掃描電鏡圖Fig.6 Stationary phase scanning electron microscopesa.pure silica;b.TpPa-NH2-Glu chiral stationary phase.

2.3 TpPa-NH2-Glu液相色譜柱對外消旋體的拆分

在流動相為正己烷-異丙醇(9∶1,v/v)或甲醇-水(9∶1,v/v)、柱溫為25 ℃、流速為0.5 mL/min的色譜條件下,用一系列手性化合物來考察TpPa-NH2-Glu液相色譜柱對外消旋體的手性拆分能力。實驗結果表明,TpPa-NH2-Glu液相色譜柱對手性化合物具有良好的拆分效果,16種手性化合物在該手性液相色譜柱上得到了拆分。表1總結了這16種外消旋化合物的分離因子(α)和分離度(Rs)等色譜參數(shù),其拆分譜圖見圖7。

表1 TpPa-NH2-Glu液相色譜柱對16種外消旋體的拆分結果Table 1 Resolution results of 16 racemates by liquid chromatographic column of TpPa-NH2-Glu

圖7 手性化合物在TpPa-NH2-Glu液相色譜柱上的拆分色譜圖Fig.7 Resolution chromatograms of chiral compounds on TpPa-NH2-Glu liquid chromatographic column

表2 TpPa-NH2-Glu液相色譜柱對于苯系位置異構體的拆分結果Table 2 Resolution results of benzene position isomers on TpPa-NH2-Glu liquid chromatographic column

2.4 TpPa-NH2-Glu液相色譜柱對苯系位置異構體的拆分

在流動相為正己烷-異丙醇(9∶1,v/v)、柱溫為25 ℃、流速為0.5 mL/min的色譜條件下,TpPa-NH2-Glu液相色譜柱對位置異構體o,m,p-碘苯胺、o,m,p-硝基苯胺也進行了分離研究(見圖8)。因位置異構體的分子結構、大小各不相同,與固定相接觸時產(chǎn)生的效果存在差異,在苯系位置異構體中,其鄰、間、對位的長寬比不一樣,與固定相的作用力大小也不一樣,其保留時間不同,從而使位置異構體分離。表2總結了o,m,p-碘苯胺、o,m,p-硝基苯胺的分離因子和分離度等色譜參數(shù)。

圖8 TpPa-NH2-Glu液相色譜柱對o,m,p-硝基苯胺和o,m,p-碘苯胺的分離色譜圖Fig.8 Separation chromatograms of o,m,p-nitroaniline and o,m,p-iodoaniline on TpPa-NH2-Glu liquid chromatographic column

圖9 不同溫度下華法林的色譜圖Fig.9 Chromatograms of warfarin at different temperatures

2.5 溫度對TpPa-NH2-Glu液相色譜柱的影響

為了研究不同溫度對TpPa-NH2-Glu液相色譜柱出峰情況的影響,以華法林為例進行測試。探究了25、30、35、40和45 ℃ 5個溫度對TpPa-NH2-Glu液相色譜柱出峰效果的影響。從圖9可以看出,在其他條件下不變的情況下,保留時間隨著溫度的增加而增加,對液相色譜柱的出峰沒有太大影響。

2.6 TpPa-NH2-Glu液相色譜柱的重復性

以分離效果較好的華法林為例,對制備的TpPa-NH2-Glu液相色譜柱的重復性進行考察。在流速為0.5 mL/min、柱溫為25 ℃、流動相為甲醇-水(9∶1,v/v)的色譜條件下,該液相色譜柱經(jīng)過5次重復測樣后的拆分色譜圖如圖10所示。從圖10可以看出,華法林的色譜拆分效果沒有明顯變化,測得的華法林的保留時間與峰面積的相對標準偏差分別為1.55%和1.46%。結果表明，用TpPa-NH2-Glu作為固定相填充的液相色譜柱具有良好的重復性。

3 結論

將手性TpPa-NH2-Glu用作高效液相色譜固定相,能對鹽酸普萘洛爾、華法林、美托洛爾、2-溴丙酸乙酯、3-丁炔-2-醇手性化合物進行基線分離,對o,m,p-硝基苯胺、o,m,p-碘苯胺位置異構體具有良好的分離效果。

該研究表明,手性TpPa-NH2-Glu是一類很有發(fā)展?jié)摿Φ氖中苑蛛x材料,特別是對藥物類的手性化合物分離分析方面有很大前景,對該類材料深入研究,將推進手性識別材料的發(fā)展。