葛根素通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路對(duì)牙髓干細(xì)胞的增殖及成骨向分化的作用機(jī)制研究*

楊盼盼 馬鵬濤 鄭蕾

骨折、代謝性疾病、骨質(zhì)疏松或腫瘤后的骨再生/修復(fù)一直為再生醫(yī)學(xué)所面臨的挑戰(zhàn)，其中成人干細(xì)胞尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSCs）被認(rèn)為 是骨再 生的良 好來(lái)源［1］。hDPSC通?？捎诘谌パ乐蟹蛛x出來(lái)［2］，具有分化為成骨、成軟骨和神經(jīng)細(xì)胞系等能力，具有較強(qiáng)的多向分化潛能、自我更新力、成骨活性及較低的免疫原性和倫理爭(zhēng)議，有望成為治療骨再生/修復(fù)的一種理想選擇［3-5］。葛根素是一種從葛根中提取的異黃酮單體，因其具有抗氧化、抗癌、抗炎、促進(jìn)骨形成等多種藥理作用而受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注［6］。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可抑制破骨細(xì)胞形成，刺激骨形成，緩解骨質(zhì)疏松癥，誘導(dǎo)骨髓MSCs 向成骨細(xì)胞分化［7,8］，且其機(jī)制可能與Wnt 信號(hào)通路有關(guān)［9］，Wnt 通路激活與人骨髓MSCs 增殖和成骨分化關(guān)系密切［10,11］，但葛根素是否可以影響其成骨向分化尚未見(jiàn)報(bào)道。故本試驗(yàn)擬在細(xì)胞水平上探討葛根素對(duì)hDPSC 成骨向分化的影響及其作用發(fā)揮機(jī)制，旨在為葛根素藥物開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選擇17名臨床健康捐贈(zèng)者（年齡平均值25.3歲，男性6名，女性11名）的第三磨牙20顆。捐贈(zèng)者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥15歲；（2）拔除第三磨牙者或進(jìn)行正畸治療的正畸患者；（3）牙髓完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）牙髓牙周病患者；（2）惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：ZZETYY20190517），實(shí)驗(yàn)材料提供者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器 葛根素（純度≥98%）購(gòu)自西安天豐生物科技股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；ALP檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Wnt1、糖原合 成酶激 酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β）、Cyclin D1、RUNX2、OCN 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；β-catenin 抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；磷酸化糖原合成酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase3β，p-GSK-3β）抗體購(gòu)自上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；茜素紅染色試劑盒（上海拜力生物科技有限公司）；RM2016型石蠟切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；JB-P5型組織包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 hDPSCs 體外分離及培養(yǎng) 完全培養(yǎng)液配制：DMEM 培養(yǎng)基中添加1%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清；細(xì)胞分離及培養(yǎng)：第三磨牙使用PBS溶液洗滌2～3次，超凈工作臺(tái)內(nèi)分離牙髓組織。37℃下，于Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型分散酶混合液（1 mg/mL）中消化1 h，棄液離心收集細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞密度增長(zhǎng)約80%，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 細(xì)胞鑒定 取hDPSCs細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)（1×105個(gè)/mL），待細(xì)胞匯合至80%左右，棄去完全培養(yǎng)液，PBS洗滌2～3遍，并將細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組、成骨分化組、成脂分化組。分別使用完全培養(yǎng)液、DMEM+10 mM β-甘油磷酸鈉+10 nM地塞米松+50 μg/mL抗壞血酸、完全培養(yǎng)液+1 μM地塞米松+10 μM胰島素+0.5 μM IBMX+200 μM吲哚美辛進(jìn)行干預(yù)。細(xì)胞成骨化鑒定主要步驟為：PBS清洗細(xì)胞，多聚甲醛固定后，2%茜素紅溶液將細(xì)胞染色，約15 min后棄液清洗，觀察細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成。細(xì)胞成脂化鑒定主要步驟為：PBS清洗細(xì)胞，多聚甲醛常規(guī)固定細(xì)胞，使用油紅O染液染色，60%異丙醇漂洗，復(fù)染10 s后清洗細(xì)胞，觀察細(xì)胞脂滴形成狀況。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)葛根素對(duì)hDPSCs細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hDPSCs，細(xì)胞消化重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL接種于96板孔中。配制葛根素培養(yǎng)液（葛根素濃度分別為0、0.01、0.1、1、10 μmol/L），各組使用對(duì)應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)各組細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 ALP 活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hDPSCs（1×105個(gè)/孔）接種于12孔板。分別設(shè)為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組為完全培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組使用成骨分化培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組使用葛根素培養(yǎng)液（成骨分化培養(yǎng)液+1 μmol/L 葛根素）進(jìn)行干預(yù)。培養(yǎng)7 d 后，各組1孔細(xì)胞PBS 洗滌，檸檬酸鹽溶液固定30 s，后FRV堿性溶液、萘酚AS-BI 堿性溶液和亞硝酸鈉溶液避光染色15 min。為計(jì)算ALP 活性，剩余孔細(xì)胞PBS 洗滌2次，后于2 mM 氯化鎂和0.1% TritonX-100 的緩沖液（pH 值=7.6）裂解，收集細(xì)胞，離心收集上清。于96 孔板內(nèi)加入緩沖液（含1%Triton X-100、2 mM 氯化鎂和8 mM p-NPP）100 μL，后加上清液100 uL，37℃下孵育30 min，450 nm 處讀取反應(yīng)溶液中釋放的對(duì)硝基苯酚的吸光度。BCA 法測(cè)定樣品蛋白濃度，校正堿性磷酸酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成檢測(cè)21 d后，PBS清洗各組細(xì)胞，多聚甲醛溶液固定，0.1%茜素紅溶液（pH值=4.2）進(jìn)行染色，觀察各組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成情況。后每孔加入500 μL 10 mM磷酸鈉和10%西吡氯銨洗脫液，搖床洗脫2 h，后移入各組洗脫液于96孔板內(nèi)，每組各5孔，每孔各100 μL，570 nm處測(cè)定各孔吸光度值進(jìn)行半定量。

1.2.6 免疫熒光染色檢測(cè)β-catenin表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)7 d棄液，多聚甲醛固定30 min，0.25% Triton X-100進(jìn)行通透，加入山羊血清封閉。加入β-catenin一抗，4℃下孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗避光孵育1 h，后DAPI染核5 min，洗滌后滴加抗熒光猝滅劑封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察β-catenin的表達(dá)和定位。

1.2.7 Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，收集細(xì)胞并加入預(yù)冷的RIPA裂解液裂解，提取細(xì)胞蛋白，檢測(cè)各組蛋白濃度。樣品（50 μg）于10% SDS-PAGE凝膠電泳（濃縮膠80 V 20 min，分離膠120 V 65 min），轉(zhuǎn)膜（200 mA 2 h），TBST洗滌PVDF膜，37℃5%脫脂奶粉封閉2 h，Wnt1、β-catenin、GSK-3、CyclinD1、RUNX2、OCN一抗內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。加入稀釋二抗室溫孵育2 h，滴加ECL顯影曝光。分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH灰度值比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行多組間比較，LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 hDPSCs 的鑒定 空白對(duì)照組細(xì)胞未經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，進(jìn)行成骨化及成脂化染色時(shí)，未見(jiàn)明顯礦化結(jié)節(jié)及脂質(zhì)堆積；成骨化誘導(dǎo)培養(yǎng)后，結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大小不一的橙紅色礦化結(jié)節(jié)（茜素紅染色）；成脂化誘導(dǎo)培養(yǎng)后，結(jié)果顯示，細(xì)胞中可見(jiàn)明顯細(xì)小脂泡堆積（油紅O 染色）。見(jiàn)圖1。

圖1 hDPSC成骨化及成脂化鑒定（×200）

2.2 葛根素對(duì)hDPSCs增殖的影響 經(jīng)含不同濃度葛根素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)hDPSCs 3 d后，CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，與不含葛根素組細(xì)胞比較，0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L葛根素作用下的細(xì)胞吸光度值均升高（P＜0.05）；與0.01 μmol/L 葛根素組細(xì)胞比較，0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L葛根素作用下的細(xì)胞吸光度值均顯著升高（P＜0.05）；與0.1 μmol/L 葛根素組細(xì)胞比較，10 μmol/L葛根素作用下的細(xì)胞吸光度值略高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與1 μmol/L葛根素組細(xì)胞比較，10 μmol/L葛根素作用下的細(xì)胞吸光度值降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度葛根素作用下細(xì)胞增殖情況（，n=5）

表1 不同濃度葛根素作用下細(xì)胞增殖情況（，n=5）

注：與不含葛根素組比，aP＜0.05；與0.01 μmol/L葛根素組比，bP＜0.05；與0.1 μmol/L葛根素組比，cP＜0.05；與1 μmol/L葛根素組比較，dP＜0.05

2.3 葛根素對(duì)hDPSCs 礦化沉積的影響 茜素紅染色結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均見(jiàn)有橙紅色礦化沉積，實(shí)驗(yàn)組具有較明顯的礦化沉積。與陰性對(duì)照組比，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組礦化結(jié)節(jié)量顯著升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組礦化結(jié)節(jié)量顯著較高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 茜素紅染色結(jié)果（×100）

表2 各組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)定量分析（，n=3）

表2 各組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)定量分析（，n=3）

注：與陰性對(duì)照組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

2.4 葛根素對(duì)hDPSCs ALP 活性的影響ALP染色結(jié)果顯示陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞藍(lán)染程度逐漸增強(qiáng)；量化結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALP 活性升高（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALP 活性最高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3，表3。

表3 各組細(xì)胞ALP活性定量分析（，n=3）

表3 各組細(xì)胞ALP活性定量分析（，n=3）

注：與陰性對(duì)照組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

圖3 ALP染色結(jié)果（×100）

2.5 各組hDPSCs中β-catenin的表達(dá)定位 免疫熒光染色結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組中β-catenin 微弱表達(dá)于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中，β-catenin 明顯表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)，β-catenin 具有于細(xì)胞質(zhì)中強(qiáng)烈表達(dá)，并具有明顯入核趨勢(shì)。見(jiàn)圖4。

圖4 β-catenin免疫熒光染色結(jié)果（×400）

2.6 Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組與葛根素（1 μmol/L）實(shí)驗(yàn)組hDPSCs 中Wnt1、β-catenin、CyclinD1、RUNX2、OCN蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組hDPSCs中Wnt1、β-catenin、CyclinD1、RUNX2、OCN蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4，圖5。

圖5 Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表4 Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平（，n=4）

表4 Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平（，n=4）

注：與陰性對(duì)照組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

3.討論

DPSCs 一般情況下保持未分化的間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體受到病理性損害時(shí)，其可迅速增殖、遷移、并分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞形成修復(fù)性牙本質(zhì)隔離外界刺激并修復(fù)受損組織［12］。本實(shí)驗(yàn)利用組合酶消化法體外分離細(xì)胞，并通過(guò)成骨化及成脂化誘導(dǎo)鑒定，確認(rèn)所獲得細(xì)胞為具有分化功能的hDPSCs。CCK8結(jié)果顯示，各作用濃度下，葛根素均可顯著提高h(yuǎn)DPSCs 活性，且最優(yōu)作用濃度為1 μmol/L，提示葛根素在一定濃度范圍內(nèi)可呈濃度依賴(lài)性促進(jìn)hDPSCs增殖。

ALP是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物中的磷酸酶，常被用作早期成骨分化的指標(biāo)；茜素紅與鈣反應(yīng)生成深紅色，常被用作晚期成骨分化的指標(biāo)［13］。Jiang X 等［14］發(fā)現(xiàn)，葛根素可促進(jìn)骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)沉積，提高骨細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞成骨向分化；Zhou Y 等［15］研究結(jié)果顯示，葛根素可促進(jìn)骨移植大鼠的骨髓干細(xì)胞分化和骨形成，并增加了骨量。本研究結(jié)果中，葛根素作用后，hDPSCs 增殖加快，ALP 活性升高，礦化結(jié)節(jié)沉積增加，提示葛根素的促DPSCs 增殖及促成骨向分化潛能。Wnt 可通過(guò)與細(xì)胞表面受體復(fù)合物結(jié)合，抑制GSK-3β 介導(dǎo)的β-catenin 磷酸化，啟動(dòng)β-catenin 細(xì)胞內(nèi)積累，促使β-catenin 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，β-catenin 與T 細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合以激活Wnt/β-catenin 轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)［16］，經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活對(duì)骨形成和再生具有重要意義［17］。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活主要依賴(lài)于細(xì)胞質(zhì)β-catenin 向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，β-catenin核表達(dá)增加是該軸激活的重要標(biāo)志［18，19］。Yao Y等［20］研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，提高β-catenin 和cyclin D1 的蛋白表達(dá)水平。本研究中顯示，陰性對(duì)照組β-catenin 可微弱表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，而葛根素組細(xì)胞中β-catenin 可在細(xì)胞核內(nèi)高度表達(dá)，提示葛根素可誘導(dǎo)hDPSCs中Wnt/β-catenin 通路激活，研究表明，該通路激活可促進(jìn)MSCs 增殖及成骨向分化［21］。在沒(méi)有細(xì)胞外Wnt 配體的情況下，β-catenin 被招募到一種降解復(fù)合物中，包括GSK-3β，正常細(xì)胞中β-catenin 含量很低，而當(dāng)Wnt 配體存在時(shí)，GSK-3β 被磷酸化并產(chǎn)生無(wú)活性的p-GSK-3β，降解復(fù)合物被解聚，β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)中積累并移位至細(xì)胞核，激活下游靶基因［22］，其中Cyclin D1在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，Wnt/β-catenin 途徑激活可上調(diào)細(xì)胞Cyclin D1 表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖［23］，RUNX2 為Wnt/β-catenin 途徑轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)OCN、ALP 等下游靶基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨分化。本研究中，葛根素可顯著促進(jìn)Wnt1、β-catenin、Cyclin D1、RUNX2 及OCN 蛋白表達(dá)水平，顯著抑制GSK-3β 及其磷酸化水平，表明葛根素可能通過(guò)Wnt/β-catenin 軸的激活刺激hDPSCs的增殖及成骨向分化。

綜上所述，葛根素可在一定程度上促進(jìn)hDPSCs 增殖，提高其成骨向分化能力，其機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin 軸，提高h(yuǎn)DPSCs 中ALP 活性及礦化沉積并促進(jìn)CyclinD1、RUNX2、OCN 表達(dá)有關(guān)。另本研究結(jié)果提示，葛根素對(duì)于hDPSCs的促增殖及促成骨向分化能力，對(duì)于骨再生/修復(fù)的作用具有一定的遠(yuǎn)景意義。