基于 RNAi的家蠅 β-葡萄糖苷酶功能分析

吳書東，彭 建，國 果，修江帆，尚小麗*

(1．貴州省感染免疫與抗體工程特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2．貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】木質(zhì)纖維素是農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的主要成分，廣泛存在于自然界，是世界上最豐富的可再生高聚物，也是可利用的生物質(zhì)新能源，是由纖維素(32%～47%)、半纖維素(19%～30%)、木質(zhì)素(5%～24%)、少量蛋白質(zhì)(3%～5%)和灰分(4%～12%)等組成的聚合物[1-2]。然而木質(zhì)纖維素具有非常致密的、抗逆性強(qiáng)的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，是農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物進(jìn)行資源化利用的難點(diǎn)。對(duì)木質(zhì)纖維素降解的方法主要有物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法(酶解法)，其中，生物法是指利用原生動(dòng)物、細(xì)菌、真菌及某些高等植物能夠分泌木質(zhì)纖維素酶的特性，將產(chǎn)生的酶用于特異性降解木質(zhì)纖維素。由于生物法較其他方法具備對(duì)環(huán)境友好和能源再生等特點(diǎn)，近年來研究和使用最廣泛[3-5]。植物及微生物來源的纖維素酶雖具備特異性高的特點(diǎn)，但也存在生產(chǎn)成本高，且活性和化學(xué)穩(wěn)定性低。因此，尋找工業(yè)上重要的木質(zhì)纖維素酶替代來源或新木質(zhì)纖維素降解方法逐漸成為研究熱點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前大量科學(xué)研究證明，多種昆蟲可作為生物轉(zhuǎn)化器用于對(duì)木質(zhì)纖維素類有機(jī)廢棄物的降解利用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)具備木質(zhì)纖維素降解作用的昆蟲有黃粉蟲(Tenebriomolitor)[6]、象鼻蟲(Cyrtotrachelusbuqueti)[7-8]、斑衣魚(Zygentoma)[9]、黑水虻(Hermetiaillucens)[10]、白蟻(Termitidae)[11]等。家蠅(Muscadomestica)生命力旺盛、繁殖力強(qiáng)、易于規(guī)?；曫B(yǎng)。有研究表明，蠅類幼蟲可作為優(yōu)良的資源昆蟲品種用于有機(jī)廢棄物處理[12-15]。通過利用家蠅作為生物轉(zhuǎn)化器對(duì)孽生環(huán)境中農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)可有效利用酒糟生產(chǎn)蠅蛆蛋白和生物有機(jī)肥[16-17]，隨后通過試驗(yàn)證明家蠅對(duì)秸稈類木質(zhì)纖維素具有降解作用，同時(shí)隨著研究的深入，首次證實(shí)了家蠅體內(nèi)含有內(nèi)源性纖維素酶——BG酶(β-Glucosidase，β-葡萄糖苷酶)[18]，并初步對(duì)重組家蠅BG蛋白的酶學(xué)特性和組織定位進(jìn)行了研究。RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)是一種雙鏈RNA (double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達(dá)使其沉默的過程，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing，PTGS)。目前，RNAi作為分析基因功能的潛在策略已被廣泛應(yīng)用?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】作為纖維素降解的重要限速酶BG，其在家蠅體內(nèi)的具體功能尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，利用RNAi技術(shù)干擾家蠅內(nèi)源纖維素酶BG基因的表達(dá)，探究BG基因被干擾后對(duì)消化道纖維素酶活性的影響，初步分析家蠅BG在家蠅體內(nèi)的功能，為利用RNAi技術(shù)深入研究家蠅BG在木質(zhì)纖維素降解中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 家蠅(Muscadomestica)于貴州醫(yī)科大學(xué)現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代繁殖，溫度28℃，相對(duì)濕度70%，光照周期12L∶12D。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 克隆載體pMD19-T、感受態(tài)細(xì)胞Escherichia.coli-DH5α均購買于寶生物工程(大連)生物有限公司。

1.1.3 主要試劑 RNAiso plus、無水乙醇、氯仿、異丙醇、葡萄糖、瓊脂糖、LB肉湯培養(yǎng)基、醋酸-醋酸鈉溶液、氨芐(Ampicilin)粉末(貴州凱信生物科技有限責(zé)任公司)，濾紙片(杭州特種紙業(yè)有限公司)，水楊苷、羧甲基纖維素鈉(CMC)、微晶纖維素(MCC，Sigma)，DNA marker DL2000、6×Loading Buffer(TaKaRa公司)、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、DEPC水、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，索萊寶)。逆轉(zhuǎn)錄試劑：PrimeScript@RT reagent Kit with gDNA Eraser；MiniBEST小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒：TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0；DNA凝膠回收試劑盒：TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0；PCR擴(kuò)增試劑盒：Ex TaqTM Version 2.0 plus dye(以上試劑盒均購于日本TaKaRa公司)；dsRNA合成試劑盒：MEGAscriptR RNAi Kit(賽默飛)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(索萊寶)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 利用Primer 5.0和DNA Club設(shè)計(jì)BG、綠色熒光蛋白(GFP)特異性引物及干擾引物，GAPDH為內(nèi)參基因，所用引物見表1。

表1 試驗(yàn)用引物名稱及序列Table 1 Name and sequence of the tested primers

1.2.2 dsRNA的制備 用TaKaRa小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒提取預(yù)先構(gòu)建質(zhì)粒pMD19T-BG，以提取的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：質(zhì)粒DNA模板1.5 μL，2×Ex Taq酶25 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 21.5 μL。BG的PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，47℃退火60 s，72℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。GFP的PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用TaKaRa凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，置于-20℃保存。以回收的DNA片段為引物，分別以兩端加有T7啟動(dòng)子序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，分別以61.5℃、63℃、64℃退火60 s，72℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)電泳后進(jìn)行回收純化。按MEGAscriptR RNAi Kit試劑盒說明書先建立轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：膠回收產(chǎn)物 2 μg，10×T7reaction Buffer、ATP solution、CTP solution、GTP solution、UTP solution、T7Enzyme Mix各2 μL，Nuclease-free Water補(bǔ)足至20 μL，37℃恒溫水浴 8 h；所得溶液中加入10×T7Digestion Buffer、DNase Ⅰ、RNase各2 μL，Nuclease-free Water 21 μL，37℃恒溫水浴1.5 h以去除DNA和ssRNA；通過向上步獲得溶液中加入Nuclease-free Water 150 μL，10×Binding Buffer 50 μL，100% Ethanol 250 μL。再經(jīng)過柱、洗滌后進(jìn)一步純化dsRNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，ND2000檢測(cè)dsRNA濃度，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RNAi家蠅2齡幼蟲 采用顯微超微量注射儀將400 ng BG-dsRNA從家蠅2齡期幼蟲倒數(shù)第2節(jié)腹節(jié)處導(dǎo)入，以注射GFP-dsRNA的幼蟲為對(duì)照，各組幼蟲均飼養(yǎng)于28℃人工氣候箱中。

1.2.4 家蠅總RNA的提取及cDNA的合成 根據(jù)RNAiso PLUS的步驟在干擾后不同時(shí)間點(diǎn)提取幼蟲消化道的總RNA，通過電泳檢測(cè)和ND2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280的比值、濃度，選擇A260/A280為1.8～2.0的樣品，并以1 μg總RNA作為模板用PrimeScript@RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.2.5 定量PCR檢測(cè)基因沉默效率 在干擾后的9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h、30 h、36 h、48 h收集幼蟲消化道，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取4只幼蟲的消化道組織裝入1.5 mL EP管后凍存于-80℃冰箱，提取收集樣品的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR檢測(cè)干擾后BG基因的表達(dá)量，反應(yīng)體系為10 μL：cDNA 1 μL、BG-F 0.4 μL、BG-R 0.4 μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μL、ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)，溶解曲線確定擴(kuò)增片段特異性，每個(gè)重復(fù)3次。

1.2.6 家蠅幼蟲粗酶液的制備 用ddH2O清洗家蠅幼蟲體表，超純水中浸泡1 h，盡量排除幼蟲腸道內(nèi)容物，75%酒精浸泡10 min，ddH2O洗2次，濾紙吸干體表水分，取20只幼蟲置于1.5 mL EP管中，加入0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.6)500 μL，用手持均質(zhì)儀研磨勻漿后，在4℃、12 000 r/min離心10 min，所得上清為粗酶液，將其吸出轉(zhuǎn)至新無菌無酶EP管中，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 濾紙酶、BG、CBH及EG酶活性檢測(cè) 離心管中分別加入濾紙片、水楊苷、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉10 mg和0.3 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液，滴加0.1 mL粗酶液，混勻后50℃水浴1 h；加0.3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫；緩沖溶液稀釋定容至3 mL，于540 nm波長測(cè) OD540，每個(gè)樣本3次重復(fù)。陰性對(duì)照以緩沖液代替粗酶液，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生成的葡萄糖含量。以50℃，pH 5.6條件下，每1 min產(chǎn)生1 mol 葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活性國際單位(IU)。纖維素酶活性大小用比活力[19]即1 mg蛋白中的酶單位數(shù)量來表示。

纖維素酶比活力(IU/mg)=5.56m/(VCt)

式中，m為產(chǎn)生的葡萄糖含量(mg)；5.56為1 mg 葡萄糖的微摩爾數(shù)(1 000/180=5.56)C為粗酶液蛋白濃度(mg/mL)，V為反應(yīng)液中加入的粗酶液體積(mL)，t為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007整理數(shù)據(jù)及繪圖，各處理相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS Statistics 25.0，采用Duncan新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)在顯著性水平0.05條件下進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠅BG基因的擴(kuò)增

以pMD19T-BG為模板用特異性的克隆引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后顯示在1 000～2 000 bp有1條特異性的條帶(圖1)，該條帶與預(yù)期結(jié)果(1 689 bp)相一致。

注：M，DL2 000 DNA Marker；1，BG 基因擴(kuò)增產(chǎn)物。Note:M, DL2 000 DNA Marker;1,amplification product of BG gene.圖1 家蠅 BG基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of PCR amplification product of BG gene of M. domestica

2.2 目的片段連接T7啟動(dòng)子及dsRNA的合成

分別采用3對(duì)帶有T7啟動(dòng)子的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)在500～750 bp出現(xiàn)1條特異性的條帶(圖2a)，大小與預(yù)期結(jié)果一致。將產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，在T7聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄合成dsRNA，經(jīng)洗滌、過柱純化后得到dsRNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)在500～750 bp出現(xiàn)1條特異性條帶(圖2b)，經(jīng)檢測(cè)，dsRNA的吸光度值之比A260/A280為2.0～2.1，說明合成的dsRNA純度符合后續(xù)試驗(yàn)要求，且合成的dsRNA濃度分別為751 ng/μL、465 ng/μL和398 ng/μL。

注：M，DL2 000 DNA Marker；1，2，3,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
Note:M,DL2 000 DNA Marker;1,2 and 3,PCR amplification product.

圖2BG基因連接T7啟動(dòng)子后的PCR產(chǎn)物及

合成的dsRNA電泳圖譜

Fig.2 Electrophoresis of PCR products and synthesized dsRNA afterBGgene connected to T7promoter

2.3 干擾后不同時(shí)間點(diǎn)消化道中BG基因沉默效率

如圖3所示，干擾后9 h，BG基因的表達(dá)量與對(duì)照組無顯著差異；干擾后12 h、15 h、18h、21 h、24 h、30 h和48 hBG基因表達(dá)量分別顯著下降33.5%、41%、62%、29%、22%、17%和11%。其中，干擾后18 h達(dá)到最佳干擾效果，隨時(shí)間的延長家蠅消化道內(nèi)受抑制的BG基因的表達(dá)逐漸恢復(fù)。說明，合成的BG-dsRNA可成功沉默家蠅BG基因，并在干擾后18 h達(dá)最佳干擾效果。

注：ns、*、**和***分別表示無顯著性，在0.05、0.01和0.001水平上顯著。Note:The ns,*,**,*** indicates no significance,significance at 0.05 level,at 0.01 level and at 0.001 level,respectively.圖3 注射dsRNA后消化道組織中BG基因的相對(duì)表達(dá)量 Fig.3 Relative expression of BG gene in digestive tract tissue after dsRNA injection

2.4 干擾前后濾紙酶活性

由圖4可知，家蠅消化道不同時(shí)間的濾紙酶活性(Filter paper activity，F(xiàn)PA)在干擾后9 h、12 h、18 h和24 h，與對(duì)照組相比FPA顯著降低，分別降低31%、36%、49%和34%。說明，干擾BG基因抑制家蠅消化道的濾紙酶活性。

注：同一時(shí)間的不同小寫字母表示P<0.05水平上顯著，下同。Note:Different lowercase letters in the same time indicate significant difference at P<0.05 level.The same below.圖4 注射dsRNA 后家蠅的 FPAFig.4 FPA in digestive tract tissue of M. domestica after dsRNA injection

2.5 干擾前后BG酶活性

從圖5可知，干擾后9 h，BG酶活性與對(duì)照組相比無顯著變化；干擾后的12 h、18 h和24 h，BG酶活性顯著降低，分別降低24%、36%和26%。說明，干擾BG基因抑制家蠅消化道的BG酶活性。

圖5 注射dsRNA后家蠅的BG酶活性 Fig.5 BG activity of M. domestica after dsRNA injection

2.6 干擾前后外切纖維素酶(CBH)酶活性

從圖6可見，注射dsRNA后9 h、12 h、18 h和24 h后，CBH酶活性均無顯著變化。

圖6 注射dsRNA后家蠅的CBH活性Fig.6 CBH activity of M. domestica after dsRNA injection

說明，干擾BG基因不影響家蠅消化道的CBH酶活性。

2.7 干擾前后EG酶活性

從圖7可見，注射dsRNA后9 h、12 h、18 h和24 h后，dsGFP陰性對(duì)照組與dsBG組測(cè)定的EG酶活性無顯著差異。說明，干擾BG基因不影響家蠅消化道的EG酶活性。

圖7 注射dsRNA后家蠅的EG活性 Fig.7 EG activity of M. domestica after dsRNA injection

3 討論

與傳統(tǒng)的基因功能研究方法相比，RNAi技術(shù)在基因功能研究上有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，其技術(shù)靈敏、易行，結(jié)果穩(wěn)定。在本研究中，干擾組采用家蠅2齡期幼蟲注射400 ng BG-dsRNA、對(duì)照組采用家蠅2齡期幼蟲注射400 ng GFP-dsRNA，與對(duì)照組相比，在干擾后18 h達(dá)最佳干擾效果，家蠅BG的表達(dá)量下降62%，在24 h時(shí)表達(dá)量雖開始出現(xiàn)上調(diào)，但仍低于對(duì)照組BG mRNA的表達(dá)水平，由此提示合成的dsRNA可成功沉默家蠅BG基因的表達(dá)。RNAi的沉默效應(yīng)具有特異性但也具有時(shí)效性，這導(dǎo)致干擾后達(dá)最佳沉默效率后出現(xiàn)上調(diào)的原因。但在不同物種中時(shí)效性的表現(xiàn)不同。如WU等[20]通過注射及飼喂dsRNA的方式對(duì)白蟻內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行干擾顯示，在干擾后的72 h白蟻基因的表達(dá)仍處于受抑制狀態(tài)，且一直呈下降趨勢(shì)。而本研究干擾時(shí)效結(jié)果與蘇佩佩等[21]利用RNAi研究家蠅幾丁質(zhì)酶功能結(jié)果趨勢(shì)類似，表明，在干擾后12 h家蠅MdCht2干擾效果最佳，且24 h同樣出現(xiàn)上調(diào)。

現(xiàn)有昆蟲木質(zhì)纖維素酶研究表明，不同種類的昆蟲其木質(zhì)纖維素酶的組成不同，同一類木質(zhì)纖維素酶，昆蟲種類不同，酶的底物特異性、在昆蟲各組織器官的分布和行使的功能也有變化。本研究中通過設(shè)置不同的底物即可檢測(cè)出干擾前后家蠅體內(nèi)纖維素酶的變化，由于纖維素酶間的相互協(xié)作和反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，當(dāng)BG酶受到抑制時(shí)，其余2種酶的活性是否也相應(yīng)發(fā)生變化有待進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)家蠅BG基因進(jìn)行干擾后，濾紙酶活性和BG酶活性降低，而CBH酶和EG酶活性未受影響。與LIU等[22]報(bào)道的情況類似，即當(dāng)對(duì)白蟻內(nèi)源性編碼CBH酶的基因進(jìn)行干擾后，僅有CBH酶活性受到抑制，EG酶及β-葡萄糖苷酶活性不受影響。但該結(jié)果與課題組前期的研究結(jié)果[23]存在差異，其對(duì)重組家蠅BG酶活性研究發(fā)現(xiàn)，重組家蠅BG酶在體外同時(shí)具有BG、EG和CBH 3種酶的活性。分析原因，一方面可能是家蠅BG在被干擾后β-葡萄糖苷酶活性受抑制，阻礙纖維二糖水解為葡萄糖，導(dǎo)致纖維二糖的堆積，但在干擾24 h后BG酶活性逐漸恢復(fù)，短暫的抑制使負(fù)反饋機(jī)制尚未進(jìn)行或纖維二糖的堆積尚不能引起負(fù)反饋反應(yīng)；另一方面可能是家蠅內(nèi)源BG酶本身在體內(nèi)僅具有BG酶功能，不具備EG和CBH酶的功能。

4 結(jié)論

在體外完成dsRNA的合成并成功抑制BG基因在家蠅體內(nèi)表達(dá)，利用RNAi技術(shù)初步探明家蠅內(nèi)源性BG基因在家蠅體內(nèi)的功能發(fā)現(xiàn)，BG基因的表達(dá)受到抑制可顯著降低濾紙酶和β-葡萄糖苷酶活性但對(duì)家蠅體內(nèi)CBH及EG酶活性無影響，為后期繼續(xù)利用RNAi技術(shù)深入研究家蠅BG對(duì)木質(zhì)纖維素降解作用奠定基礎(chǔ)。