慢性乙型肝炎患者停用核苷(酸)類似物后循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg表達(dá)水平與復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析

張?jiān)婄?陳 星， 劉 嬌， 趙 敏， 梅小平

1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染科， 四川 南充 637000； 2 南充市中心醫(yī)院 感染科， 四川 南充 637000；3 遂寧市中心醫(yī)院 感染科， 四川 遂寧 629000

目前我國慢性乙型肝炎(CHB)患者主要使用核苷(酸)類似物(NUC)抗病毒治療[1]，作為目前最重要的抗HBV治療手段，NUC主要以抑制HBV的逆轉(zhuǎn)錄來降低循環(huán)血中的HBV DNA水平。目前的NUC藥物并不能完全清除肝細(xì)胞內(nèi)的HBV共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)[2-3]，cccDNA的存在是CHB患者HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵因素，因此肝內(nèi)HBV cccDNA的消失是目前國內(nèi)公認(rèn)的CHB患者最可能達(dá)到病毒學(xué)治愈的狀態(tài)。HBV cccDNA存在于肝細(xì)胞內(nèi)，其檢測具有創(chuàng)傷性，在臨床難以廣泛開展[4]。目前HBV相關(guān)的血清學(xué)標(biāo)志物包括HBV DNA、HBeAg、HBsAg，經(jīng)NUC治療后HBV DNA陰轉(zhuǎn)并不代表HBV cccDNA的清除，即使HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄沉默，整合HBV S基因區(qū)也可轉(zhuǎn)錄翻譯成HBsAg[5]，在前C區(qū)以及基本cp區(qū)變異后可導(dǎo)致HBeAg載量下調(diào)甚至消失，但檢測HBV cccDNA仍存在一定的轉(zhuǎn)錄活性。因此，目前常用的血清學(xué)標(biāo)志物反映肝內(nèi)HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄水平存在一定的局限性。

新型生物學(xué)標(biāo)志物HBV前基因組RNA(pgRNA)、乙型肝炎核心相關(guān)抗原(HBcrAg)已引起廣泛關(guān)注，HBV pgRNA作為cccDNA的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，HBcAg作為HBV衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，表達(dá)于完整的HBV Dane顆粒中[6]，其水平與cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性和水平具有良好的相關(guān)性[7-8]。本團(tuán)隊(duì)在研究了經(jīng)NUC治療CHB患者各時間段的HBV pgRNA、HBcrAg水平之后，收集到治療至少5年到達(dá)完全應(yīng)答并滿足2017年版歐洲肝病學(xué)會(EASL)指南[9]停藥標(biāo)準(zhǔn)的CHB患者，研究其停藥后各時間段HBV pgRNA、HBcrAg水平，分析pgRNA、HBcrAg水平變化與復(fù)發(fā)的相關(guān)性，探索其在臨床的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 研究對象來自2019年12月—2022年7月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診中抗HBV治療至少5年到達(dá)完全應(yīng)答并滿足2017年版EASL指南停藥標(biāo)準(zhǔn)的隨訪隊(duì)列。所有研究對象年齡均滿18周歲且具有民事行為能力。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嗜肝/非嗜肝病毒感染及其他原因所致肝組織炎癥；合并肝硬化、肝癌等其他疾病。完全應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)：滿足生化學(xué)、血清學(xué)以及病毒學(xué)聯(lián)合應(yīng)答，生化指標(biāo)ALT、AST正常，e抗原陰轉(zhuǎn)，HBV DNA檢測不到。復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：病毒學(xué)復(fù)發(fā)指的是獲得病毒學(xué)應(yīng)答的患者停藥后，間隔1個月2次檢測HBV DNA均>2×103IU/mL；臨床復(fù)發(fā)指的是病毒學(xué)復(fù)發(fā)且ALT>2倍正常值上限，但排除其他因素引起的ALT增高。

1.2 標(biāo)本的采集與處理 收集CHB患者停藥時、停藥4周、12周以及24周時的空腹靜脈血樣本3 mL于肝素抗凝管內(nèi)，在6 h內(nèi)以1000 r/min離心15 min并獲取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 檢測方法

1.3.1 HBV pgRNA檢測 采用湖南圣湘公司HBV pgRNA定量測定試劑盒檢測血清中HBV RNA含量。

1.3.2 HBcrAg檢測 采用ELISA酶聯(lián)免疫分析試劑盒，運(yùn)用CObase601全自動免疫分析系統(tǒng)檢測。

1.3.3 HBV DNA水平檢測 運(yùn)用實(shí)時熒光定量法高精度檢測樣品中HBV DNA載量，標(biāo)準(zhǔn)值>20 IU/mL，如低于檢測值下限按20 IU/mL進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，嚴(yán)格按照說明書專人操作。

2 結(jié)果

2.1 CHB患者停藥后隨訪24周內(nèi)病毒學(xué)復(fù)發(fā)人數(shù)及累積復(fù)發(fā)率 本研究收集CHB患者108例，其中失訪者26例，82例隨訪者在4周、12周、24周的復(fù)發(fā)情況見表1，累積復(fù)發(fā)率達(dá)到29.3%(24/82)。復(fù)發(fā)者均為病毒學(xué)復(fù)發(fā)，無臨床復(fù)發(fā)者，病毒學(xué)復(fù)發(fā)的患者從復(fù)發(fā)時結(jié)束隨訪觀察。

表1 CHB患者停藥后隨訪24周內(nèi)病毒學(xué)復(fù)發(fā)人數(shù)及累積復(fù)發(fā)率

2.2 CHB患者停藥后各時段循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA的表達(dá)水平 停藥24周時，CHB患者循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達(dá)水平較停藥時及停藥4周表達(dá)明顯升高(P值均<0.05)；停藥后各時段組間CHB患者循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 CHB患者停藥后各時段循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達(dá)水平比較

2.3 CHB患者停藥后復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA水平比較 對CHB患者停藥后復(fù)發(fā)組選擇復(fù)發(fā)當(dāng)時循環(huán)血清中各指標(biāo)水平狀態(tài)，未復(fù)發(fā)組選擇隨訪24周后循環(huán)血清中各指標(biāo)的水平狀態(tài)，復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA水平較未復(fù)發(fā)組顯著高表達(dá)(P值均<0.05)(表3)。對復(fù)發(fā)組進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在12～24周時復(fù)發(fā)患者循環(huán)血清中HBV pgRNA[(1.59±0.16)log10拷貝/mL vs (1.42±0.14)log10拷貝/mL，t=2.903，P<0.05]、HBcrAg[(2.43±0.12)log10U/L vs (1.73±0.06)log10U/L，t=18.163，P<0.05]以及HBV DNA[(3.97±0.44)log10IU/mL vs (3.57±0.31)log10IU/mL，t=2.640，P<0.05]水平較4～12周時高表達(dá)。

表3 CHB患者停藥后復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA、HBsAg水平比較

2.4 CHB患者停藥后復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組在停藥時循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg表達(dá)水平比較 復(fù)發(fā)組時循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg的表達(dá)水平較未復(fù)發(fā)組顯著升高(P值均<0.05)(表4)。

表4 停藥時復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組CHB患者循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg表達(dá)水平比較

2.5 CHB患者復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA的相關(guān)性分析 CHB患者停藥后復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA均呈正相關(guān)(r值分別為0.81、0.66，P值均<0.001)；未復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA均無相關(guān)性(r值分別為0.14、0.04，P值均>0.05)(圖1～4)。

圖1 復(fù)發(fā)組HBV pgRNA與HBV DNA的關(guān)系

3 討論

CHB患者經(jīng)NUC藥物治療后可以達(dá)到HBV DNA陰轉(zhuǎn)，但CHB患者體內(nèi)仍存在一定量的HBV cccDNA，HBV cccDNA的持續(xù)低表達(dá)是HBV不斷復(fù)制的根源，目前只有HBV cccDNA徹底清除才是CHB等肝病患者根治的核心指標(biāo)[5]。已有研究[10]表明，CHB患者循環(huán)血清中HBV pgRNA水平檢測可以反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA水平；也有研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，HBcrAg表達(dá)水平與HBV cccDNA水平呈正相關(guān)。因此，本研究通過檢測CHB患者停藥后各時段循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg的表達(dá)水平以及復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg的表達(dá)差異，分析HBV pgRNA、HBcrAg停藥時水平與復(fù)發(fā)的相關(guān)性以及其水平能否作為停藥的參考臨界值指標(biāo)，HBV pgRNA、HBcrAg的檢測可能為后續(xù)選擇停藥時機(jī)、評估藥物療效等提供臨床價值基礎(chǔ)。

圖2 復(fù)發(fā)組HBcrAg與HBV DNA的關(guān)系

圖3 未復(fù)發(fā)組HBV pgRNA與HBV DNA的關(guān)系

圖4 未復(fù)發(fā)組HBcrAg與HBV DNA的關(guān)系

本研究顯示，CHB患者停藥后隨訪4～12周時復(fù)發(fā)率17.1%，隨訪24周時累積復(fù)發(fā)率達(dá)到29.3%。其中單獨(dú)HBV DNA復(fù)陽者各占64.3%、60.0%，所有復(fù)發(fā)者均為病毒學(xué)復(fù)發(fā)，未發(fā)現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)患者。目前CHB患者抗病毒治療主要依賴于NUC藥物。NUC藥物主要是抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶來抑制HBV DNA的轉(zhuǎn)錄，降低CHB患者循環(huán)血清中HBV DNA的表達(dá)水平，對肝細(xì)胞內(nèi)的HBV cccDNA清除能力較低，HBV pgRNA作為HBV cccDNA的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即可長期以低水平存在于CHB患者體內(nèi)。本研究的CHB患者經(jīng)過至少5年的NUC抗病毒治療，滿足2017年版EASL指南停藥標(biāo)準(zhǔn)后停藥，由結(jié)果可見，盡管CHB患者經(jīng)治療后HBV DNA陰轉(zhuǎn)，e抗原發(fā)生轉(zhuǎn)換，在停藥后隨訪中發(fā)現(xiàn)，仍有一部分患者發(fā)生HBV DNA和/或HBeAg復(fù)陽，其中HBV DNA單獨(dú)復(fù)陽者占多數(shù)，這可能是由于CHB患者循環(huán)血清中的HBV DNA來源于HBV pgRNA，pgRNA再經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄形成HBV rcDNA，被病毒蛋白包裹后釋放到肝細(xì)胞外成為新的HBV DNA，HBV DNA形成與HBV pgRNA關(guān)系密切，在后續(xù)研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)低水平的HBV pgRNA是HBV DNA復(fù)陽的關(guān)鍵，既往也有研究[13]證實(shí)，停止NUC治療后，血清pgRNA水平與病毒復(fù)發(fā)風(fēng)險有密切關(guān)系。

本研究在CHB患者停藥24周內(nèi)的隨訪中發(fā)現(xiàn)，隨著停藥時間的延長，CHB患者循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達(dá)水平成上升趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步對復(fù)發(fā)組進(jìn)行分析，復(fù)發(fā)組CHB患者循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達(dá)水平較未復(fù)發(fā)組高表達(dá)，且12～14周復(fù)發(fā)組患者循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA表達(dá)水平較4～12周復(fù)發(fā)組高表達(dá)；停藥24周后未復(fù)發(fā)組患者循環(huán)血中HBV pgRNA、HBcrAg、HBV DNA的表達(dá)水平相比較于最初停藥時有所上升，但未達(dá)到復(fù)發(fā)組患者水平。由于本研究觀察時間較短，在后續(xù)的停藥過程中，未復(fù)發(fā)組患者循環(huán)血中各指標(biāo)水平是否會進(jìn)一步上升甚至達(dá)到復(fù)發(fā)組患者水平還需要進(jìn)一步觀察；根據(jù)未復(fù)發(fā)組患者24周時循環(huán)血中各指標(biāo)的表達(dá)水平能否預(yù)測其未來復(fù)發(fā)的可能性還需要進(jìn)一步研究證明。本研究的CHB患者停藥時HBV DNA陰轉(zhuǎn)，但檢測結(jié)果提示其循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg仍微量存在，在停藥后CHB患者循環(huán)血清中各指標(biāo)水平逐漸升高，以HBV DNA水平上升為著，這可能是由于CHB患者體內(nèi)HBV pgRNA、HBcrAg的持續(xù)存在，在失去NUC藥物的抑制后，HBV pgRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶重新生成HBV DNA，導(dǎo)致循環(huán)血清中HBV DNA表達(dá)水平上升明顯。也有研究[14]顯示，在CHB患者達(dá)到2017年版EASL指南停藥標(biāo)準(zhǔn)后，仍有約半數(shù)的患者循環(huán)血清中pgRNA未陰轉(zhuǎn)，這表明肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA仍有一定的轉(zhuǎn)錄活性，在停藥后其復(fù)制活躍程度增高，導(dǎo)致患者發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)。

進(jìn)一步分析復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組在停藥時其循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg的水平差異，研究結(jié)果提示復(fù)發(fā)組在停藥時其循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg表達(dá)水平較未復(fù)發(fā)組高表達(dá)。這表明，相比較于未復(fù)發(fā)患者，復(fù)發(fā)患者在停藥時，其循環(huán)血清中存在較高水平的HBV pgRNA、HBcrAg，這可能是導(dǎo)致復(fù)發(fā)組患者體內(nèi)HBV再活躍的關(guān)鍵指標(biāo)，因本研究停藥后觀察時間較短，未復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg停藥時水平是否能作為停藥的臨界指標(biāo)尚需進(jìn)一步觀察研究。免疫系統(tǒng)的激活與應(yīng)答對乙型肝炎的進(jìn)展和臨床結(jié)局起著關(guān)鍵作用，清除CHB患者體內(nèi)HBV需要固有免疫以及獲得性免疫的協(xié)同作用。在大多數(shù)CHB患者體內(nèi)免疫細(xì)胞處于“無應(yīng)答”狀態(tài)，經(jīng)NUC治療后，部分免疫細(xì)胞激活，免疫系統(tǒng)重新構(gòu)建。近期研究[15-16]表明，經(jīng)長期NUC治療后停藥復(fù)發(fā)與患者體內(nèi)各種細(xì)胞因子激活等也有一定關(guān)系。

復(fù)發(fā)組以及未復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA呈正相關(guān)，未復(fù)發(fā)組循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg與HBV DNA無相關(guān)性，這與部分學(xué)者[17-18]研究結(jié)果一致。作者認(rèn)為在CHB患者經(jīng)NUC藥物治療至HBV DNA陰轉(zhuǎn)后，其HBV pgRNA、HBcrAg水平下降滯后于HBV DNA，此時CHB患者體內(nèi)HBV pgRNA、HBcrAg水平不能反映HBV DNA活性，而更能準(zhǔn)確反映HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性與藥物治療療效；在復(fù)發(fā)組患者循環(huán)血清中存在較高水平的HBV pgRNA、HBcrAg，HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性更強(qiáng)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶生成HBV DNA能力提高，HBV DNA載量越高，HBV cccDNA活性越強(qiáng)，因此HBV DNA與HBV pgRNA、HBcrAg呈正相關(guān)。

綜上所述，目前CHB患者治療主要依賴NUC藥物，根據(jù)2017年版EASL指南停藥標(biāo)準(zhǔn)，即使HBV DNA陰轉(zhuǎn)，循環(huán)血清中仍存在一定量的HBV pgRNA、HBcrAg，本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組停藥時循環(huán)血清中HBV pgRNA、HBcrAg水平存在差異，但由于隨訪時間較短，未復(fù)發(fā)組患者在停藥時HBV pgRNA、HBcrAg水平是否能代表安全停藥的臨界值指標(biāo)尚需進(jìn)一步觀察研究。本研究僅納入了HBV DNA陰轉(zhuǎn)檢測HBV pgRNA仍呈陽性的患者，未檢測出HBV pgRNA陰性的患者，兩者未予以比較，對于停藥時HBV pgRNA陰性的患者停藥后其水平是否會進(jìn)一步升高、是否發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)、其水平是否更能代表安全停藥的臨界值指標(biāo)等諸多問題需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，延長隨訪時間進(jìn)行研究觀察。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2022年3月8日經(jīng)由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號：2022ER127-1，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張?jiān)婄?fù)責(zé)資料分析，撰寫論文；陳星、劉嬌、趙敏參與標(biāo)本收集，數(shù)據(jù)整理；梅小平負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。