慢性乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭前期免疫細(xì)胞的表達(dá)及意義

王 芳， 盧建華， 劉勇鋼， 張新羽， 閆會(huì)敏

1 河北醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室， 石家莊 050017； 2 石家莊市第五醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所， 石家莊 050021； 3 天津市第二人民醫(yī)院 病理科， 天津 300192

慢性乙型肝炎(CHB)相關(guān)的慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF)是在慢性HBV感染引起的CHB基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性嚴(yán)重肝功能障礙臨床綜合征，病死率極高。因我國(guó)慢性HBV的高感染率，ACHBLF已成為影響患者生存質(zhì)量的重要因素[1]。在CHB向ACHBLF進(jìn)展過程中，存在著患者肝功能急劇惡化，但尚未達(dá)到肝衰竭的“肝衰竭前期(pre-ACHBLF)”階段[2]，如能在此階段進(jìn)行預(yù)警及干預(yù)，則有可能預(yù)防進(jìn)一步發(fā)展為肝衰竭。

目前普遍認(rèn)為細(xì)胞免疫功能紊亂是ACHBLF發(fā)生的病理機(jī)制之一，許多免疫細(xì)胞如髓系抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)、分泌IL-17的CD4 T淋巴細(xì)胞(IL-17-producing CD4 T cells，Th17)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等在肝衰竭的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3-5]。盡管既往許多研究已證實(shí)肝衰竭發(fā)病與免疫密切相關(guān)，但pre-ACHBLF階段的免疫狀態(tài)及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系尚不清楚，因此本研究探討了MDSC、Th17、Treg和分泌IL-17的CD8 T淋巴細(xì)胞(IL-17-producing CD8 T cells, Tc17)在pre-ACHBLF和ACHBLF患者中的表達(dá)，以期為ACHBLF的早期治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年8月—2019年5月于石家莊市第五醫(yī)院住院患者45例，其中ACHBLF患者、pre-ACHBLF患者和CHB患者各15例，同時(shí)選取于本院健康體檢者15例作為健康對(duì)照組(HC組)。ACHBLF和pre-ACHBLF的臨床診斷均符合《肝衰竭診治指南(2018年版)》[6]；CHB的臨床診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)為合并其他病毒性肝炎或由酒精、藥物等原因?qū)е碌母闻K疾病；肝癌或其他惡性腫瘤伴有肝臟轉(zhuǎn)移；患有自身免疫性疾病、HIV感染、妊娠或有嚴(yán)重的心、肺、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病。

1.2 標(biāo)本采集與儲(chǔ)存 采用EDTA-K2抗凝的真空采血管于清晨空腹采集外周靜脈血約3 mL，取100 μL用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血MDSC頻數(shù)，剩余全血分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)。所有標(biāo)本均為新鮮抗凝血，且在采集后4 h內(nèi)處理。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血免疫細(xì)胞的水平 MDSC細(xì)胞檢測(cè)：取100 μL全血加至流式管中，然后分別加入CD11b-APC、CD33-PE和HLA-DR-PE/Cy7流式抗體各2 μL，避光孵育15 min后，每管加入溶血素500 μL，室溫避光靜置15 min，離心洗滌，加入流式鞘液300 μL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDSC細(xì)胞比例。

Treg細(xì)胞檢測(cè)：收集PBMC，加入CD4-FITC和CD25-APC抗體各2 μL，4 ℃避光孵育30 min。經(jīng)固定破膜處理后，離心洗滌2次，重懸細(xì)胞，然后加入10 μL Foxp3-PE抗體，4 ℃避光孵育45 min，離心洗滌，加入流式鞘液200 μL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

Th17、Tc17細(xì)胞檢測(cè)：收集PBMC，用佛波醇酯和離子霉素刺激，同時(shí)加入GolgiStop，4 h后收集細(xì)胞至流式管，加入CD4-FITC和CD8a-PerCP/Cy5.5抗體各2 μL，4 ℃避光孵育30 min。經(jīng)固定破膜處理后，離心洗滌2次，然后加入10 μL IL-17-APC抗體，避光孵育30 min，離心洗滌，加入流式鞘液200 μL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 臨床檢驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定 肝功能檢測(cè)采用美國(guó)雅培公司C8000型生化分析儀，HBeAg檢測(cè)采用瑞士羅氏公司全自動(dòng)Cobase601型電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，血常規(guī)檢測(cè)采用日本希森美康公司XN1000血液分析儀，并計(jì)算炎癥指標(biāo)，包括中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、單核細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(monocyte-to-lymphocyte ratio, MLR)、血小板/淋巴細(xì)胞比值(platelet-to-lymphocyte ratio, PLR)與全身免疫炎癥指數(shù)(systemic immune inflammation index，SIRS)，SIRS=中性粒細(xì)胞×血小板/淋巴細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 四組間年齡與性別構(gòu)成具有可比性，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。ACHBLF組、pre-ACHBLF組和CHB組患者ALT與AST水平、HBeAg陽性比均明顯高于HC組(P值均<0.05)。ACHBLF組和pre-ACHBLF組患者TBil水平均明顯高于HC組(P值均<0.05)。ACHBLF組和pre-ACHBLF組患者PTA水平均明顯低于CHB組(P值均<0.05)(表1)。

表1 四組研究對(duì)象一般特征比較

2.2 MDSC、Th17、Treg和Tc17細(xì)胞的表達(dá) MDSC、Th17、Treg和Tc17細(xì)胞水平在四組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。與CHB組比較，ACHBLF和pre-ACHBLF組的Th17、Treg和Tc17細(xì)胞水平均明顯升高(P值均<0.05)，同時(shí)pre-ACHBLF患者的MDSC細(xì)胞水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 四組研究對(duì)象MDSC、Th17、Treg和Tc17表達(dá)水平

2.3 pre-ACHBLF患者中免疫細(xì)胞與炎癥指標(biāo)的關(guān)系 相關(guān)性分析顯示，在pre-ACHBLF患者中，MDSC與白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及NLR、MLR、SIRS呈正相關(guān)(P值均<0.05)，而Treg細(xì)胞僅與白細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(P=0.043)。相反，Th17/Treg值和Tc17細(xì)胞水平與淋巴細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P值均<0.05)(表2)。

表2 pre-ACHBLF患者免疫細(xì)胞水平與炎癥指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

ACHBLF的發(fā)生發(fā)展涉及固有免疫和獲得性免疫的多個(gè)環(huán)節(jié)，已有許多研究[8]證實(shí)免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、MDSC、T淋巴細(xì)胞等與ACHBLF的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)，但尚未有研究評(píng)價(jià)這些細(xì)胞在pre-ACHBLF中的變化。本研究發(fā)現(xiàn)pre-ACHBLF患者中MDSC、Th17、Treg和Tc17均比CHB患者明顯升高，提示ACHBLF前期已存在嚴(yán)重的細(xì)胞免疫功能紊亂。因此，關(guān)注患者的病期變化，對(duì)pre-ACHBLF患者及早進(jìn)行干預(yù)，維持細(xì)胞免疫平衡，可能對(duì)防止疾病進(jìn)展起到重要作用。

MDSC是機(jī)體重要的免疫抑制細(xì)胞，具有抑制固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用，參與多種炎癥和免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，一些研究[9]相繼分析了MDSC在ACHBLF中的作用，發(fā)現(xiàn)ACHBLF患者M(jìn)DSC頻數(shù)明顯升高，且隨患者病期程度加重，本研究也證實(shí)了以上結(jié)果。為了探討MDSC在ACHBLF疾病進(jìn)程中的變化，本研究還觀察了pre-ACHBLF患者中MDSC的頻數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) pre-ACHBLF患者中MDSC頻數(shù)明顯高于CHB患者，且高于ACHBLF患者。推測(cè)隨著各種誘因?qū)е翪HB患者病情加重，肝細(xì)胞壞死及炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的多種因子誘導(dǎo)機(jī)體MDSC快速升高，以抑制過強(qiáng)的免疫反應(yīng)；而在ACHBLF發(fā)生時(shí)，機(jī)體以免疫炎癥反應(yīng)占主導(dǎo)，使MDSC頻數(shù)相應(yīng)降低。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于MDSC在CHB-pre-ACHBLF-ACHBLF進(jìn)程中如何發(fā)揮作用的研究還很少，尚需要進(jìn)一步深入探討。

值得注意的是，筆者團(tuán)隊(duì)觀察到MDSC和Treg細(xì)胞的變化過程存在差異，MDSC水平在pre-ACHBLF患者中最高，而Treg細(xì)胞在ACHBLF患者中更高，此結(jié)果提示MDSC的增殖具有相對(duì)前置性，這兩類重要的抑制性細(xì)胞在ACHBLF進(jìn)展的不同時(shí)期分別發(fā)揮作用。此外還發(fā)現(xiàn)pre-ACHBLF患者中MDSC水平與炎癥指標(biāo)之間存在正相關(guān)性，而Treg水平僅與白細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。目前炎癥和免疫反應(yīng)是ACHBLF發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理生理機(jī)制，隨著系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生，炎癥介質(zhì)的持續(xù)釋放導(dǎo)致ACHBLF患者出現(xiàn)血管內(nèi)皮障礙，毛細(xì)血管滲漏和組織灌注不足而引起微循環(huán)紊亂,繼而引發(fā)器官衰竭。既往研究表明循環(huán)炎癥介質(zhì)及肝細(xì)胞壞死釋放的損傷相關(guān)模式分子等可促進(jìn)MDSC的增殖和分化[10]，而MDSC具有誘導(dǎo)Treg細(xì)胞擴(kuò)增和分化的作用[11-12]。因此，這些研究提示在肝衰竭前期，過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)激活MDSC使其表達(dá)升高，形成以MDSC為主的免疫抑制狀態(tài)；隨著疾病進(jìn)展，MDSC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞表達(dá)，轉(zhuǎn)變?yōu)橐訲reg細(xì)胞為主的狀態(tài)。

Th17和Tc17是以分泌IL-17為主要特征的T淋巴細(xì)胞亞群，他們有著共同的分化刺激因子及分化調(diào)節(jié)通路，共同在炎癥性疾病、病毒感染、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發(fā)揮作用[13]。但是，這兩類細(xì)胞在許多方面如分子和代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、可塑性、表達(dá)變化也存在差異[14]。一項(xiàng)肝癌相關(guān)的研究[15]顯示，肝癌組織中分泌IL-17的細(xì)胞主要是Tc17細(xì)胞，而外周血中則主要是Th17細(xì)胞。在ACHBLF病理?yè)p傷過程中，已有大量研究證實(shí)ACHBLF患者的Th17細(xì)胞明顯升高，且與預(yù)后密切相關(guān)[16]，但僅有極少數(shù)研究報(bào)道了Tc17細(xì)胞在ACHBLF發(fā)生發(fā)展中的作用[17-18],特別是罕有研究觀察Tc17細(xì)胞在pre-ACHBLF患者的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)pre-ACHBLF和ACHBLF患者外周血Th17與Tc17細(xì)胞頻數(shù)顯著高于CHB患者，且Tc17的變化更明顯，推測(cè)Th17與Tc17細(xì)胞可能協(xié)同參與ACHBLF的疾病進(jìn)程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)pre-ACHBLF患者外周血MDSC、Treg、Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞水平均明顯升高，特別是MDSC表達(dá)與炎癥指標(biāo)呈密切相關(guān)性。盡管本研究病例數(shù)偏少，但研究結(jié)果對(duì)理解ACHBLF的疾病進(jìn)展具有重要意義。將來進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，并深入探討這些免疫細(xì)胞的作用機(jī)制，將為ACHBLF早期抗免疫治療提供更多的理論依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年4月30日經(jīng)由石家莊市第五醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2019009。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王芳負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文；盧建華、劉勇鋼和張新羽參與課題設(shè)計(jì)，收集數(shù)據(jù)；閆會(huì)敏負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章，修改論文并最后定稿。