楊正麗，劉君麗，錢科蕾，劉 璽，楊 雋，洪新宇

（上海市疾病預防控制中心，上海 200336）

人參果是五加科植物人參的成熟果實。與人參其他部位如根和根莖等悠久的藥用歷史比較，人參果的開發(fā)與應用相對較少；隨著科學技術的發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)，人參果具有與人參其他部位相似的成分和藥理功效[1]。Yahara等[2]研究了人參不同部位人參皂苷的含量，發(fā)現(xiàn)人參根、莖、葉、花和果均含有人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1，其中在人參果中Re含量最高。從人參果中提取的人參果皂苷具有舒張血管、抗氧化和抗炎功效，因此被廣泛用于治療中風、阿爾茨海默病、帕金森病、高血壓、高膽固醇血癥和心肌缺血等疾病[3-4]。Liu Meiyan等[5]研究發(fā)現(xiàn)人參果皂苷通過調(diào)節(jié)大腦皮層5-羥色胺水平發(fā)揮抗抑郁癥作用。上述研究均提示人參果具有潛在的藥用功效。

皂苷、黃酮類化合物、萜類化合物和木脂素等植物化學物可調(diào)節(jié)機體免疫功能[6]。姚月梅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，人參果汁可提高小鼠吞噬細胞吞噬功能和細胞免疫功能，提示人參果可增強小鼠的固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)功能。然而，關于人參果的免疫調(diào)節(jié)功能目前研究仍較少。本研究擬通過分析人參果汁濃縮液對環(huán)磷酰胺誘導的免疫低下小鼠體質(zhì)量、免疫器官質(zhì)量、外周血白細胞數(shù)量、淋巴細胞亞群數(shù)量、血清細胞因子水平和免疫細胞核轉(zhuǎn)錄因子表達的影響，探討其免疫調(diào)節(jié)功能，以期為人參果汁濃縮液的藥理功效和進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級雄性C57BL/6J小鼠，6～8 周，體質(zhì)量18～22 g，由浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2020-0002。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，溫度23～26 ℃、相對濕度50%～60%，照明模擬自然光照，12 h/12 h明暗更替。實驗期間小鼠自由飲水與進食。動物實驗通過上海市疾病預防控制中心實驗動物倫理審查委員會批準。

五加科植物人參（Panax ginsengC.A.Mey.）鮮果產(chǎn)自吉林撫松；環(huán)磷酰胺 美國Sigma公司；STROMATOLYSER-4DL白細胞分類溶血劑 日本Sysmex公司；小牛血清 美國Gibco公司；抗小鼠抗體（CD16/32、CD3、CD4、CD8a和CD19） 美國Biolegend公司；小鼠轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β、白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-17A、IL-2試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TRIzol 美國Invitrogen公司；SuperReal熒光定量預混試劑增強版 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

XT-2000i動物血液細胞分析儀 日本Sysmex公司；Spark全波長多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；CytoFlex流式細胞儀 美國Thermo公司；5910R 4 ℃平板離心機 德國Eppendorf公司；熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 人參果汁濃縮液制備

人參果經(jīng)壓榨、過濾、濃縮等工藝制成人參果汁濃縮液，每100 g鮮人參果經(jīng)濃縮得到2 g人參果汁濃縮液。

1.3.2 小鼠分組及其處理

將72 只C57BL/6J雄性小鼠分成6 組：空白組（蒸餾水）、模型組（40 mg/kgmb環(huán)磷酰胺＋蒸餾水）、83 mg/kgmb人參果汁濃縮液組（40 mg/kgmb環(huán)磷酰胺）、166 mg/kgmb人參果汁濃縮液組（40 mg/kgmb環(huán)磷酰胺）、249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組（40 mg/kgmb環(huán)磷酰胺）和332 mg/kgmb人參果汁濃縮液組（40 mg/kgmb環(huán)磷酰胺）（依次相當于人體推薦劑量的10、20、30 倍和40 倍），每組12 只小鼠。模型組和人參果汁濃縮液各劑量組自第1天開始，每日腹腔注射40 mg/kgmb環(huán)磷酰胺，連續(xù)10 d，以建立免疫低下小鼠模型，空白組腹腔注射等量的pH為7.4的1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）。同時自第1天開始，人參果汁濃縮液各劑量組每天灌胃人參果汁濃縮液1 次，灌胃劑量為20 mL/kgmb，空白組和模型組灌胃等量的蒸餾水，連續(xù)15 d。第16天稱取小鼠體質(zhì)量并取材，計算和檢測各組小鼠的免疫器官臟器指數(shù)、外周血白細胞（white blood cell，WBC）數(shù)量、淋巴細胞（lymphocyte，LYM）亞群數(shù)量、血清細胞因子水平和免疫細胞核轉(zhuǎn)錄因子表達。

1.3.3 免疫器官臟器指數(shù)測定

各組小鼠摘眼球取血后斷頸處死，稱量分離的脾臟和胸腺質(zhì)量。臟器指數(shù)按式（1）計算。

1.3.4 小鼠外周血液學指標測定

小鼠摘眼球取血后，取適量全血于EDTA-K2抗凝管中，充分混勻，用動物血液細胞分析儀測定WBC、LYM數(shù)量和LYM比例（LYM與WBC之比）。

1.3.5 小鼠免疫細胞分型測定

分離小鼠胸腺與脾臟，經(jīng)研磨過濾，移至離心管中，493hg離心5 min，棄上清液，其中胸腺加入1 mL含體積分數(shù)5%小牛血清的PBS，制備成單細胞懸液備用；脾臟中加入1 mL紅細胞裂解液混勻，室溫靜置340 s，加入10 mL含5%小牛血清的PBS終止裂解，493hg離心5 min，棄上清液，加入4 mL含5%小牛血清的PBS，制備成單細胞懸液備用。胸腺和脾臟細胞懸液以每孔200 μL鋪于96 孔板中，于4 ℃平板離心機中493hg離心5 min，棄上清液，每孔加入50 μL抗小鼠CD16/32抗體，冰上孵育20 min；于4 ℃平板離心機中493hg離心5 min，棄上清液后，胸腺細胞中加入50 μL含有抗小鼠CD3、CD4和CD8a的抗體混合液，脾臟細胞中加入50 μL含有抗小鼠CD3、CD4、CD8a和CD19的抗體混合液，避光于冰上孵育30 min，于4 ℃平板離心機493hg離心5 min，棄上清液，PBS洗滌一遍后，493hg離心5 min，棄上清液，每孔加入200 μL體積分數(shù)1%多聚甲醛溶液固定細胞。用流式細胞儀檢測T、CD4＋T、CD8＋T細胞和B細胞數(shù)量占比。

1.3.6 小鼠血清中細胞因子水平測定

小鼠摘眼球取血，12000 r/min離心10 min，制備血清，取適量血清按照試劑盒說明書測定IL-4、IL-17A、IL-2、TGF-β質(zhì)量濃度。

1.3.7 免疫細胞核轉(zhuǎn)錄因子表達測定

按照TRIzol說明書提取小鼠脾臟細胞RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時熒光定量PCR擴增。引物序列見表1。采用式（2）計算基因相對表達量。

表1 擴增基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。采用單因素方差分析比較組間差異；方差齊時，兩兩比較采用最小顯著差異法-t分析；方差不齊時，兩兩比較則采用Dunnett-t檢驗。數(shù)據(jù)不滿足方差分析條件時，采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異的判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠體質(zhì)量的影響

如表2所示，各組間小鼠初始體質(zhì)量差異不顯著（P＞0.05）。與空白組比較，模型組小鼠終末體質(zhì)量極顯著降低（P＜0.01）；人參果汁濃縮液各劑量組小鼠終末體質(zhì)量與模型組比較差異不顯著（P＞0.05）；人參果汁濃縮液各劑量組間終末體質(zhì)量差異不顯著（P＞0.05）。上述結(jié)果表明環(huán)磷酰胺可降低小鼠體質(zhì)量，本研究中人參果汁濃縮液并不能恢復環(huán)磷酰胺引起的小鼠體質(zhì)量降低。

表2 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effects of Panax ginseng fruit juice concentrate on body mass in immunocompromised mice

2.2 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠免疫器官的影響

如表3所示，與空白組比較，模型組小鼠脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組小鼠脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組小鼠胸腺質(zhì)量極顯著降低（P＜0.01）；人參果汁濃縮液各劑量組小鼠胸腺質(zhì)量與模型組比較差異并不顯著（P＞0.05）。各組小鼠胸腺指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。上述結(jié)果表明環(huán)磷酰胺可損傷小鼠的免疫器官，人參果汁濃縮液可減輕環(huán)磷酰胺對脾臟的損傷，但對環(huán)磷酰胺引起的胸腺損傷并無恢復作用。

表3 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠免疫器官的影響Table 3 Effects of Panax ginseng fruit juice concentrate on immune organ indices in immunocompromised mice

2.3 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠血液學指標的影響

如表4所示，與空白組比較，模型組WBC數(shù)量降低（P＞0.05）；與模型組比較，83 mg/kgmb人參果汁濃縮液組小鼠WBC數(shù)量顯著升高（P＜0.05）。與空白組比較，模型組LYM比例極顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組小鼠LYM比例顯著升高（P＜0.05）。上述結(jié)果表明人參果汁濃縮液對環(huán)磷酰胺引起的外周血免疫細胞失衡有一定的緩解作用。

表4 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠血液學指標的影響Table 4 Effects of Panax ginseng fruit juice concentrate on hematological indicators in immunocompromised mice

2.4 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠脾臟和胸腺中淋巴細胞的影響

如表5所示，與空白組比較，模型組小鼠胸腺中CD4＋T細胞占比和CD8＋T細胞占比極顯著降低（P＜0.05）；249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組小鼠胸腺中CD4＋T細胞占比顯著高于模型組（P＜0.05），接近空白組水平；249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組小鼠胸腺中CD8＋T細胞占比顯著高于模型組（P＜0.05）。上述結(jié)果表明人參果汁濃縮液在一定劑量下可以恢復免疫低下小鼠胸腺淋巴細胞的數(shù)量。

表5 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠胸腺淋巴細胞的影響Table 5 Effects of Panax ginseng fruit juice concentrate on percentages of thymic lymphocytes in immunocompromised mice

如表6所示，與空白組比較，模型組小鼠脾臟中T細胞、CD4＋T細胞和CD8＋T細胞比例極顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參果汁濃縮液各劑量組小鼠脾臟中T細胞、CD4＋T細胞和CD8＋T細胞比例均升高，其中249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。與空白組比較，模型組小鼠脾臟中B細胞比例極顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，83、166 mg/kgmb和249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組小鼠脾臟中B細胞比例均升高，其中249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組B細胞比例極顯著升高（P＜0.01）。上述結(jié)果表明249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組對恢復免疫低下小鼠脾臟中淋巴細胞有較好的效果。

表6 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠脾臟淋巴細胞的影響Table 6 Effects of Panax ginseng fruit juice concentrate on percentages of splenic lymphocytes in immunocompromised mice

2.5 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠血清中細胞因子水平的影響

如表7所示，模型組與空白組IL-2、IL-4、IL-17A和TGF-β質(zhì)量濃度均差異不顯著（P＞0.05）。與空白組比較，166 mg/kgmb人參果汁濃縮液組IL-2質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），而332 mg/kgmb人參果汁濃縮液組IL-2質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，166 mg/kgmb人參果汁濃縮液組IL-2質(zhì)量濃度極顯著降低（P＜0.01）。與空白組比較，249、332 mg/kgmb人參果汁濃縮液組IL-4質(zhì)量濃度顯著或極顯著升高（P＜0.05、P＜0.01）；與模型組比較，166、249 mg/kgmb和332 mg/kgmb人參果汁濃縮液組IL-4質(zhì)量濃度顯著或極顯著升高（P＜0.05、P＜0.01）。與空白組和模型組比較，332 mg/kgmb人參果汁濃縮液組IL-17A質(zhì)量濃度均極顯著升高（P＜0.01）。與空白組和模型組比較，332 mg/kgmb人參果汁濃縮液組TGF-β質(zhì)量濃度顯著或極顯著降低（P＜0.05、P＜0.01）。上述結(jié)果表明332 mg/kgmb人參果汁濃縮液對改善免疫低下小鼠免疫活性分子水平效果較好。

表7 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠血清中細胞因子的影響Table 7 Effects of Panax ginseng fruit juice concentrate on serum cytokine levels in immunocompromised mice

2.6 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠脾臟中免疫細胞核轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對表達量的影響

如圖1 所示，與空白組比較，模型組T-b e t、Gata3、RoRγt、Foxp3mRNA相對表達量均極顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組T-betmRNA相對表達量極顯著升高（P＜0.01），332 mg/kgmb人參果汁濃縮液組Foxp3mRNA相對表達量顯著升高（P＜0.05）。上述結(jié)果表明人參果汁濃縮液可使免疫低下小鼠部分免疫細胞核轉(zhuǎn)錄因子表達水平得以改善。

圖1 人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠脾臟中免疫細胞核轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對表達水平的影響Fig.1 Effects of Panax ginseng fruit juice concentrate on relative mRNA expression levels of nuclear transcription factors in spleen of immunocompromised mice

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，已經(jīng)被廣泛用作于化療藥物，可產(chǎn)生免疫抑制、骨髓抑制、白細胞減少癥和氧化應激等多種不良反應[8-11]。本研究參照高敏等[12]的研究，給予小鼠連續(xù)10 d腹腔注射40 mg/kgmb環(huán)磷酰胺，以建立免疫低下小鼠模型。本研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺降低了小鼠體質(zhì)量、免疫器官質(zhì)量和外周血免疫細胞數(shù)量，這與Qi Qiuchen等[13]報道的環(huán)磷酰胺能夠引起小鼠體質(zhì)量降低、免疫器官受損和外周血血細胞失衡結(jié)果一致，提示小鼠免疫低下模型建立成功。

本研究結(jié)果顯示，人參果汁濃縮液干預組小鼠終末體質(zhì)量與模型組比較無顯著變化且均低于空白組（P＞0.05），一方面提示環(huán)磷酰胺明顯的毒性作用使得體質(zhì)量恢復過程緩慢；另一方面提示在該研究方案中人參果汁濃縮液改善免疫低下小鼠體質(zhì)量的能力可能較弱或者欠缺。

脾臟與胸腺是機體重要的免疫器官，胸腺是T細胞分化與成熟的重要場所，脾臟含有多種免疫細胞，參與多項免疫應答[14]。脾臟質(zhì)量與胸腺質(zhì)量在一定程度上可以反映機體的免疫功能[15]。在本研究中，模型組脾臟質(zhì)量與脾臟指數(shù)均極顯著高于空白組（P＜0.01），這與前期造模時出現(xiàn)的環(huán)磷酰胺引起脾臟質(zhì)量與脾臟指數(shù)降低表現(xiàn)不一，表明脾臟隨時間延長出現(xiàn)了代償性變化，提示脾臟可能存在水腫和增生[16]；與模型組比較，人參果汁濃縮液干預組脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)均呈現(xiàn)降低趨勢，其中249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05）；上述研究結(jié)果提示人參果汁濃縮液對環(huán)磷酰胺引起的小鼠脾臟損害有緩解作用。模型組與人參果汁濃縮液干預組胸腺質(zhì)量均極顯著低于空白組（P＜0.01），提示在本研究方案中人參果汁濃縮液對環(huán)磷酰胺引起的小鼠胸腺損傷無改善作用。

外周血WBC是免疫系統(tǒng)重要組成成分，通過與體內(nèi)其他系統(tǒng)協(xié)同工作，以定位和殺死入侵的病原體等[17]。因此，若WBC數(shù)量降低，機體感染的風險則會增加，故WBC的數(shù)量可反映機體免疫功能情況。在本研究中，模型組WBC數(shù)量與空白組比較呈現(xiàn)下降趨勢；83 mg/kgmb人參果汁濃縮液組白細胞數(shù)增加，提示人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠WBC數(shù)量有一定的改善作用。外周血LYM數(shù)量可反映機體免疫狀態(tài)[18]。與模型組比較，249 mg/kgmb人參果汁濃縮液LYM數(shù)量和比例升高，提示人參果汁濃縮液可以改善環(huán)磷酰胺引起的小鼠外周血LYM的失衡。

LYM分布于人體不同的器官中，如中樞淋巴器官（骨髓和胸腺）和外周淋巴器官（脾臟和淋巴結(jié)等）等[18]。胸腺是T細胞免疫功能發(fā)育的初始部位，對T細胞發(fā)育和成熟至關重要[19-21]。本研究探討了胸腺和脾臟中主要免疫細胞的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組胸腺中CD4＋T細胞比例和CD8＋T細胞比例均極顯著低于空白組（P＜0.01），提示環(huán)磷酰胺對胸腺免疫細胞的損害作用。經(jīng)人參果汁濃縮液干預后，CD4＋T細胞和CD8＋T細胞不同程度地恢復，其中249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組CD4＋T細胞恢復至與空白組相當水平，提示人參果汁濃縮液可恢復免疫低下小鼠胸腺中免疫細胞的水平。脾臟在免疫防御過程中發(fā)揮重要作用[22]。脾臟中免疫細胞數(shù)量在一定程度上反映出機體免疫狀態(tài)。本研究中模型組脾臟T細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞比例和B細胞比例均極顯著低于空白組（P＜0.01）；人參果汁濃縮液干預后，僅249 mg/kgmb人參果汁濃縮液組呈現(xiàn)出改善作用，提示此劑量對恢復脾臟中免疫細胞數(shù)量具有良好的效果。

細胞因子是免疫反應的重要介質(zhì)[23-24]。本研究探討了IL-2、IL-4、IL-17A質(zhì)量濃度和TGF-β質(zhì)量濃度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該免疫抑制模型中，環(huán)磷酰胺對上述細胞因子的水平無明顯影響；但經(jīng)人參果汁濃縮液干預后，細胞因子的水平均呈現(xiàn)出變化。IL-2在早期T淋巴細胞克隆擴增和分化中起重要作用[25-26]；人參果汁濃縮液對的IL-2影響呈現(xiàn)出雙向性；在人參果汁濃縮液劑量相對較高水平下，可促進IL-2生成，提示人參果汁濃縮液在一定劑量水平下可能會促進T細胞增殖[27]。IL-4可促進促炎性巨噬細胞向抑炎性巨噬細胞轉(zhuǎn)變[28]；IL-4質(zhì)量濃度隨人參果汁濃縮液劑量升高而升高，提示人參果汁濃縮液可能具有一定的抑制炎癥功效。IL-17是組織信號細胞因子，有利于保護皮膚、肺和胃腸道等屏障器官[29]；人參果汁濃縮液可促使IL-17的生成，提示其對屏障器官可能有一定的保護作用。TGF-β是負向調(diào)控因子，可抑制免疫應答[30]；模型組TGF-β質(zhì)量濃度較空白組呈升高趨勢；人參果汁濃縮液干預后，隨其劑量升高TGF-β質(zhì)量濃度降低，提示人參果汁濃縮液可能對免疫抑制作用具有緩解功效。

T-bet、Gata3、RoRγt和Foxp3分別為輔助性T細胞（helper T cell，Th）1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory cells，Treg）特異性核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控Th細胞分化，而不同的Th細胞群具有不同的免疫功能[23]。模型組T-bet、Gata3、RoRγt、Foxp3mRNA相對表達量均極顯著低于空白組（P＜0.01），提示環(huán)磷酰胺對Th1、Th2、Th17和Treg特異性核轉(zhuǎn)錄因子均抑制作用。人參果汁濃縮液干預后，上述基因水平不同程度地恢復，其中249 mg/kgmb人參果汁濃縮液可使T-betmRNA相對表達量水平恢復至與空白組相當水平；332 mg/kgmb人參果汁濃縮液使Foxp3mRNA相對表達量顯著高于模型組（P＜0.05）。上述研究結(jié)果提示人參果汁濃縮液可改善免疫低下小鼠的免疫細胞特異性核轉(zhuǎn)錄因子表達。

本實驗通過使用環(huán)磷酰胺建立免疫低下小鼠模型，研究人參果汁濃縮液是否可以改善免疫低下小鼠的免疫功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參果汁濃縮液可以減輕環(huán)磷酰胺對脾臟的損傷、增加外周血及免疫器官中免疫細胞的數(shù)量、升高血清中IL-2、IL-4、IL-17A細胞因子的水平和抑制負調(diào)控因子TGF-β的表達以及部分恢復免疫細胞中核轉(zhuǎn)錄因子水平，提示人參果汁濃縮液對免疫低下小鼠免疫器官、免疫細胞以及免疫活性分子等均有改善作用，其中以249 mg/kgmb人參果汁濃縮液效果最為顯著，未存在明顯的劑量效應關系，不同劑量的人參果汁濃縮液可改善免疫低下小鼠不同的免疫指標，表明人參果汁濃縮液在一定劑量水平下可以增強免疫低下小鼠的免疫功能。本研究初步探討出人參果汁濃縮液可以改善免疫功能，但關于其通過何種機制來調(diào)控免疫功能需要在后續(xù)的研究中進一步探索。