胎兒早期小鼠無疤痕愈合的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

王振 ， YAO Mawulikplimi Adzavon ， 劉梓嘉 ， 劉夢昱 ， 謝飛 ，馬雪梅 ， 趙鵬翔

1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124；

2.北京氫分子研究中心， 北京 100124；

3.抗病毒藥物北京市國際科技合作基地，北京 100124

作為人體最大的器官，皮膚具有多種功能，包括抵御微生物、調(diào)節(jié)體溫、分泌、排泄和參與內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定等［1］。皮膚損傷不可避免，但其修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜且受到嚴(yán)格調(diào)控的過程，需要多種類型細(xì)胞［2］的協(xié)同作用以及相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）［3］來促進(jìn)愈合。皮膚損傷后，凝血級聯(lián)反應(yīng)引發(fā)炎癥，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞遷移到傷口部位；隨后在細(xì)胞因子和趨化因子的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞以及上皮細(xì)胞共同負(fù)責(zé)血管生成和上皮化；與此同時(shí)，成纖維細(xì)胞遷移到受損區(qū)域，產(chǎn)生大量膠原蛋白，肉芽組織和ECM重新形成以填充傷口［4］。此外，上皮細(xì)胞經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與真皮修復(fù)［5］。受傷組織的重塑時(shí)間取決于皮膚受損程度以及創(chuàng)傷局部微環(huán)境，而自然的皮膚修復(fù)通常會(huì)形成疤痕。疤痕形成以膠原的過度合成與沉積為特點(diǎn)，從主要的Ⅲ型膠原過渡到Ⅰ型膠原。這不僅給患者造成巨大痛苦，也給醫(yī)療工作帶來巨大負(fù)擔(dān)。盡管疤痕形成途徑和過程已有較多研究，但迄今為止還沒有發(fā)展出切實(shí)有效的疤痕防治方法［6］。

與成年小鼠愈合模式不同，哈里森描述了胎兒傷口的完美修復(fù)模式，即有效修復(fù)皮膚傷口而不形成疤痕 ，隨后的研究逐漸確立了這一無疤痕愈合概念［7］。一般來說，無疤痕愈合只出現(xiàn)在早期胎兒中，人類胎兒在妊娠24周左右［8］，小鼠在妊娠18 d左右［9］（E18），愈合方式將從無疤傷口愈合轉(zhuǎn)變?yōu)榘毯塾夏Ｊ?。研究表明，快速上皮化是無疤痕傷口愈合的特征［10］，無疤痕/疤痕愈合模式之間的主要區(qū)別在于血管生成速率、炎癥水平、皮膚結(jié)構(gòu)狀態(tài)和組織重塑快慢的不同，但目前缺乏對無疤痕愈合分子機(jī)制的系統(tǒng)研究。為了探索無疤痕愈合的分子機(jī)制并確定涉及無疤痕愈合的重要通路、基因，本研究分析了基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）中的GSE71619數(shù)據(jù)集，比較了小鼠胎兒（E14和E18）和成年（6周齡）皮膚組織中的基因表達(dá)。相關(guān)研究結(jié)果希望有助于發(fā)現(xiàn)新的疤痕治療靶點(diǎn)，并為臨床創(chuàng)傷治療提供更有效的策略。

1 材料和方法

1.1 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)

不同胎齡皮膚愈合的相關(guān)芯片數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。篩選得到數(shù)據(jù)集GSE71619［11］，平臺(tái)注釋文件為GPL19179。GSE71619數(shù)據(jù)集包含C57BL/6J不同胎齡/鼠齡的皮膚組織樣本，納入胎齡14 d（E14無疤痕愈合模式組）、胎齡18 d（E18）和6周齡成年鼠（W6）（疤痕愈合模式組）各6例，共18例皮膚樣本。

1.2 數(shù)據(jù)處理和DEGs的選取

利用edgeR包（版本：3.32.1）和TMM（trimmed mean of M-values）方法對上述芯片進(jìn)行預(yù)處理和 標(biāo)準(zhǔn) 化［12-13］。應(yīng) 用Limma 包［14］（版本：4.0.3；https：//www.R-project.org/）進(jìn)行DEGs篩選。篩選條件設(shè)置為|log2FC|≥1以及P＜0.05。在E14vsE18、E14vsB6和E18vsB6 3個(gè)比較組之間采用維恩圖縮小尋找調(diào)控?zé)o疤痕愈合相關(guān)差異基因的范圍［15］。

1.3 功能富集分析

通過Metascape［16］對2個(gè)比較組（E14vsE18，E14vsW6）中的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（gene onotology，GO）功能和通路（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.2中得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String［17］數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中，置信度分?jǐn)?shù)設(shè)置為highest confidence（0.9），隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)保持默認(rèn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Xˉ±S）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 無疤痕愈合皮膚（E14）和疤痕愈合皮膚（E18+W6）之間的DEGs篩選

為了確保數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，首先使用主成分分析（principal component analysis，PCA）度量集群的相似性［18］。3組樣本（E14、E18、W6）之間的相似性如圖1所示。為了保持不同組之間的相對獨(dú)立性，我們在每組中保留了4個(gè)樣本，共12個(gè)樣本用于進(jìn)一步分析。在E14、E18和W6皮膚組織活檢中，共對19 784個(gè)基因進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析，共鑒定出4 654個(gè)DEGs（|log2FC|＞2，P＜0.05）。比較E14和E18的基因表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)E14中有1 523個(gè)基因上調(diào)，3 131個(gè)基因下調(diào)（圖2A，C）。與W6相比，E14中有1 160個(gè)DEGs，包括791個(gè)上調(diào)基因和732個(gè)下調(diào)基因（圖2B，D）。

圖1 PCA分析Fig. 1 PCA analysis of raw data

圖2 不同胎齡和成熟小鼠皮膚組織的差異基因Fig. 2 DEGs in mice embryonic and adult skin

2.2 無疤痕皮膚和疤痕皮膚之間DEGs的功能表征

分別對E14vsE18以及E14vsW6上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行富集分析。E14vsE18上調(diào)DEGs主要的生物學(xué)功能和途徑包括組織形成、上皮發(fā)育、細(xì)胞黏附；E14vsW6中富集功能包括組織發(fā)育以及細(xì)胞增殖（表1）。下調(diào)DEGs（表2）在炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞分化（E14vsE18）和代謝過程、氧化還原反應(yīng)（E14vsW6）功能中富集。

表2 E14 vs E18 和E14 vs W6中下調(diào)差異基因富集的前20個(gè)生物學(xué)功能Table 2 Top 20 biological function of related differential genes to the E14 Down-DEGs in E14 vs E18 and E14 vs W6

2.3 潛在無疤痕愈合相關(guān)基因的識(shí)別分析

包含不同發(fā)育階段的皮膚組織的數(shù)據(jù)集結(jié)合功能注釋表明，篩選出的DEGs也包括調(diào)控胎兒皮膚向成人皮膚發(fā)育過渡的基因（表1～2）。我們對E14、E18和W6小鼠皮膚組織樣本的基因群進(jìn)行了維恩圖分析和功能注釋（圖3A）。E14vsE18和E14vsW6重疊但排除在E18vsW6之外的228個(gè)基因在很大程度上與發(fā)育過程無關(guān)，其功能注釋主要集中在傷口愈合方面。對這228個(gè)候選基因進(jìn)行分析，并從中鑒定出4個(gè)Cluster（圖3B），其中Cluster 2由于E14組中個(gè)體平行性較差，且總體基因數(shù)量較少，因此暫不做細(xì)化分析。通過分析Cluster 1和Cluster 4發(fā)現(xiàn)，E14基因表達(dá)水平相似，E18和W6組在這2個(gè)Cluster中的表達(dá)水平特點(diǎn)呈現(xiàn)相似性，因此將這2個(gè)Cluster整合進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 E14 vs E18 和E14 vs W6中上調(diào)差異基因富集的前20個(gè)生物學(xué)功能Table 1 Top 20 biological function of differential genes related to the E14 Up-DEGs in E14 vs E18 and E14 vs W6

Cluster 1和Cluster 4中的基因（在E14中大多數(shù)表達(dá)下調(diào)）主要富集于代謝相關(guān)功能（圖3C），如有機(jī)化合物氧化、次級代謝過程、羧酸生物合成過程和AMPK信號(hào)通路。PPI網(wǎng)絡(luò)分析揭示了兩個(gè)簇中的關(guān)鍵基因，涉及PPP2CB、PPP2R5B、PIM3、PPM1L、AKT2、COX4I1、UBE2G2、MGST3、GSTM1和CYP1B1等（圖3D）。

Cluster 3中的基因（在E14中大部分上調(diào)）主要富集于肌肉活動(dòng)和ECM合成相關(guān)功能（圖3C），GO富集前5個(gè)生物學(xué)功能為橫紋肌收縮、骨骼肌收縮、ECM形成、橫紋肌細(xì)胞發(fā)育和肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育。該聚類的PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，多為富含膠原和肌肉結(jié)構(gòu)家族的hub基因，如COL5A2、COL4A2、COL1A2、MYH8、MYH3、TNNT2和TNNI1（圖3D）。

圖3 胎兒無疤愈合相關(guān)基因的鑒定Fig. 3 Identification of fetal scarless healing related genes.

2.4 關(guān)鍵基因的PPI分析

在ECM成分基因中，我們發(fā)現(xiàn)了更多與膠原家族有關(guān)的基因，包括COL1A2、COL4A2、COL5A2和COL8A1，它們可能是促進(jìn)更好的組織重塑的關(guān)鍵基因（圖4A）。成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞（也稱為活化成纖維細(xì)胞）是ECM合成的主要來源。這些細(xì)胞位于富含ECM的結(jié)締組織中，合成、維持和重組ECM成分。在E14中上調(diào)的差異基因富集功能可能與成纖維細(xì)胞遷移、增殖和活化有關(guān)（圖4B）。因此，我們認(rèn)為E14組的成纖維細(xì)胞活化可能是觸發(fā)無疤痕愈合的另一個(gè)關(guān)鍵因素。

圖4 Cluster 1&4和Cluster 3中通過PPI分析獲得的具有代表性的關(guān)鍵基因Fig. 4 Representative hub genes expression data out from the PPI network analysis for the genes in Cluster 1&4 and Cluster 3.

胎兒早期炎癥反應(yīng)水平較低，與本研究中得到的結(jié)果基本一致（圖4C），即E14下調(diào)的差異基因功能富集于炎癥相關(guān)功能。此外，炎癥加劇會(huì)激活基質(zhì)金屬蛋白酶，不利于ECM的進(jìn)一步堆積。但我們發(fā)現(xiàn)線粒體功能相關(guān)基因的下調(diào)，如CYPB1、COX5B、CYC1（圖4E）與兔胎兒傷口愈合過程中的發(fā)現(xiàn)不一致［19］。此外，E14組的脂質(zhì)代謝和抗氧化功能降低（圖4D），這可能與胎兒發(fā)育的微環(huán)境有關(guān)。

3 討論

隨著創(chuàng)傷修復(fù)研究的深入，研究者已在哺乳動(dòng)物的胎兒中發(fā)現(xiàn)了無疤痕傷口愈合現(xiàn)象，且無疤痕愈合的能力隨著年齡的增長逐漸消失。這意味著胎兒皮膚在一定胎齡之前可以實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷后無疤痕愈合。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫，比較了孕早期（E14）、孕晚期（E18）和產(chǎn)后成年（W6）皮膚組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，最終篩選出了包含25個(gè)下調(diào)基因和17個(gè)上調(diào)基因的核心基因模塊。

ECM重塑是傷口愈合的一個(gè)重要階段。研究表明，隆起的真皮疤痕組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白的水平均升高，因此ECM的過度形成導(dǎo)致疤痕的形成［20］。此外，ECM在愈合過程的每個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用。一方面，ECM被視為修復(fù)過程的支架［12］，為愈合過程的每個(gè)階段（如血管形成、上皮化等）提供基質(zhì)；另一方面，ECM在動(dòng)態(tài)愈合過程中發(fā)揮轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。如ECM通過調(diào)節(jié)生長因子和細(xì)胞因子，對中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞（角質(zhì)形成細(xì)胞）發(fā)揮趨化作用［21］。通過本數(shù)據(jù)集的分析，我們發(fā)現(xiàn)Cluster3（E14上調(diào)）中基因富集的前3個(gè)生物學(xué)功能是橫紋肌收縮、骨骼肌收縮和ECM形成，表明ECM積累在無疤痕傷口愈合中的重要性。

炎癥始終是傷口愈合的一把雙刃劍。輕度炎癥對組織啟動(dòng)細(xì)胞遷移和趨化以及分泌生長因子至關(guān)重要，而慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致傷口難以愈合或愈合后出現(xiàn)異常疤痕［22］。糖酵解方式是多種干細(xì)胞群體的共同代謝特征，與氧化磷酸化過程相比，細(xì)胞一般通過糖酵解產(chǎn)生較低水平的能量［23］。結(jié)合在本研究中觀察到E14組的低能量生成水平，糖酵解可能在E14妊娠期占主導(dǎo)地位。因此，干細(xì)胞特性的維持可能與無疤痕愈合有關(guān)。

另一方面，本研究也存在一定的局限性。由于本文主要是采用生物信息學(xué)的方法，大量的數(shù)據(jù)結(jié)果是基于計(jì)算機(jī)與數(shù)學(xué)的統(tǒng)計(jì)功能進(jìn)行的預(yù)測分析。結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展以及科研工作者對于該技術(shù)的理解，因此需要大量的實(shí)驗(yàn)對本文結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，本研究通過數(shù)據(jù)集關(guān)鍵基因的篩選，揭示了ECM形成和纖維細(xì)胞活化在早期胎兒無疤痕愈合模式中的重要性，相關(guān)研究對未來的疤痕醫(yī)學(xué)護(hù)理具有一定參考價(jià)值。