何臨梓，張校立，葉春秀，陳勵(lì)坤,，王永鵬,，田 雯

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，烏魯木齊 830000； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝作物研究所，烏魯木齊 830000)

近年來，由梨火疫病菌(又稱為解淀粉歐文氏菌Erwiniaamylovora)引起的梨火疫病已在中國(guó)庫(kù)爾勒等地被證實(shí)[1]。梨火疫病是一種會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)薔薇科植物患病死亡的細(xì)菌性病害[2]。植物一旦侵染梨火疫病菌之后，便會(huì)迅速地通過組織細(xì)胞蔓延到幼嫩的葉片、枝條，形成黑褐色的潰瘍斑，直至枯死。枯死的葉片不落且形成向下的翻卷狀態(tài)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)望去如同像大火焚燒過一樣[3]。該病最先開始于200年前的美國(guó)哈德遜河谷一帶，由于全球經(jīng)濟(jì)一體化，使得該病害已經(jīng)傳播于60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)[4]。梨屬植物早在3000年前就在中國(guó)《詩經(jīng)》當(dāng)中就有所記載，且以悠久的歷史豐富多樣的種質(zhì)資源著稱，現(xiàn)已經(jīng)成為了世界性的栽培果樹之一[5]。為了防控梨火疫病在中國(guó)大面積的流行，不僅要嚴(yán)格防控病原菌的進(jìn)境檢疫，還要了解中國(guó)種植的梨種質(zhì)對(duì)于梨火疫病的抗病性水平及機(jī)制[6]。

在生產(chǎn)實(shí)踐當(dāng)中，幾乎所有的薔薇科的經(jīng)濟(jì)樹種均是通過嫁接生長(zhǎng)的。而在外界環(huán)境條件適宜的情況下，嫁接的傷口會(huì)明顯增加梨火疫病的危害水平[7]。在易感病的栽培品種上，如果氣候條件和樹體的生理?xiàng)l件適宜，病原菌可以在一個(gè)生長(zhǎng)季內(nèi)從一朵感病的花一直向下移動(dòng)擴(kuò)散到砧木，從而致使樹木死亡[7]。2000年，學(xué)者Thomson研究證實(shí)嫁接部位的傷口是梨火疫病菌極易侵染的部位，是該病擴(kuò)散的一個(gè)重要階段[8]。如若接穗與砧木均是高感病的植物，則會(huì)使病害迅速蔓延導(dǎo)致枝條枯死，真菌根部受到侵染[9]。如果能結(jié)合梨抗性砧木的選育，可以很好地預(yù)防梨火疫病的發(fā)生和傳播，使抗病性具有更加持久和廣泛的有效性[10]。

目前，對(duì)于梨火疫病的研究較為深入，其中很重要的一個(gè)防治途徑就是積極尋找到有關(guān)抗性突出的梨資源，并大量培育抗性品種以供市場(chǎng)的需求[11]。但關(guān)于梨砧木資源對(duì)梨火疫病的抗性研究及鑒定的方面的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在通過結(jié)合離體和活體的梨火疫病菌人工接種方式，評(píng)價(jià)不同梨砧木類型對(duì)梨火疫病的抗病性強(qiáng)弱，分析梨砧木資源對(duì)于梨火疫病的抗病水平，以期為抗火疫病梨砧木品種選育及梨火疫病的合理防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試種質(zhì)

供試種質(zhì)為秋子梨、豆梨、杜梨、川梨(表1)，于巴州農(nóng)科所資源圃選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的4種梨砧木類型各5株，采集當(dāng)年生幼嫩的葉片及枝條(保證葉片健康完整，枝條長(zhǎng)短和莖粗基本一致)，放入冰盒中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存，備用。

表1 抗病鑒定用的梨種質(zhì)材料Table 1 Pear germplasm materials for identification of disease resistance

1.2 供試菌株

供試菌株Erwiniaamylovora病菌由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)胡白石教授惠贈(zèng)。

1.3 細(xì)菌菌株培養(yǎng)

參照劉華威等[12]的細(xì)菌培養(yǎng)方法。首先將供試菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA+5%蔗糖)中，用封口膜密封后28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)菌活化，再挑取單菌落利用平板劃線法接于NA培養(yǎng)皿上28 ℃培養(yǎng)，然后將單菌落接入NB培養(yǎng)液中，放置于立式恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃，150 r·min-1培養(yǎng)24 h，選取OD600=1.2左右的菌液作為接種液。

1.4 接種及取樣方法

1.4.1 離體葉片接菌 離體葉片接種方法參照王宏等[13]的離體葉片接菌方法，略有改進(jìn)。在4種梨砧木上選取長(zhǎng)勢(shì)一致，大小均勻、完全展開的新生葉片，用無菌水進(jìn)行沖洗后再用濾紙輕輕地蘸取葉片表面的水分，此過程中避免葉片受損。用微量注射器在距離葉柄基部5 mm處接種梨火疫病菌(統(tǒng)一制造傷口為0.2 cm)，注意接種過程中不要穿透葉柄基部。每種砧木類型接種10片，以無菌水替代菌液，其他條件一致。將接種后的葉片懸放在三角形互為疊放的3根針頭上方(防止葉片被水浸濕，導(dǎo)致葉片褐化)于密封好的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中噴灑少量無菌水，注意不要噴灑于葉片表面。接菌后記錄初始病斑的長(zhǎng)度，1～7 d測(cè)定病斑長(zhǎng)度、病斑長(zhǎng)度與嫩梢總長(zhǎng)的比例及發(fā)病的級(jí)別數(shù)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算葉片的發(fā)病率和病情指數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 離體枝條接菌 參照李洪濤等[14]的離體枝條接種方法。截取4種梨砧木1 a生枝條各5根，保證每根長(zhǎng)度在25 cm左右，然后帶回實(shí)驗(yàn)室。用無菌水沖洗，下切口斜切后將其插入裝有30%蔗糖溶液中三角瓶中，注意三角瓶中的溶液不超過枝條總長(zhǎng)的1/3，然后用微量注射器在第2片完全展開葉處的莖銜接處接種2 μL的菌液(制造傷口統(tǒng)一為0.2 cm)，每種砧木類型接種5根枝條，對(duì)照用無菌水代替菌液，重復(fù)3次。接種后放置于27 ℃、相對(duì)濕度75%及光照3級(jí)的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。接菌后記錄枝條長(zhǎng)度及病斑總長(zhǎng)，1～7 d持續(xù)觀察記錄病斑蔓延長(zhǎng)度、病斑長(zhǎng)度占枝條總長(zhǎng)的比例，計(jì)算發(fā)病率及病情指數(shù)。

1.4.3 活體嫩梢接菌 參照“1.4.2”離體枝條接種的方法，略有改進(jìn)。選取樹齡相同、健康生長(zhǎng)和長(zhǎng)勢(shì)相似的秋子梨、杜梨、豆梨、川梨植株各5株，用無菌牙簽在嫩梢的第2片完全展開葉處與莖銜接處劃一個(gè)約0.2 cm的傷口，用微量注射器在傷口中注射2 μL的菌液(注意接種過程中不要穿透嫩梢的莖)，以無菌水替代菌液做對(duì)照，重復(fù)3次。接種梨火疫病菌后，觀察記錄1～7 d病斑長(zhǎng)度、病斑長(zhǎng)度與嫩梢總長(zhǎng)的比例及發(fā)病的級(jí)別數(shù)。并計(jì)算嫩梢的發(fā)病率和病情指數(shù)。

表2為梨火疫病原菌接種離體葉片和枝條的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，均參考李洪濤等[14]的方法并略有改進(jìn)：

病情指數(shù)(DI)= ∑(各級(jí)發(fā)病枝條數(shù)×病級(jí)代表值)/(接種總枝條數(shù)×最高病級(jí)代表值)×100

弱致病力：DI為1～15；中度致病力：DI為 16～35；較強(qiáng)致病力：DI 為 36～69；強(qiáng)致病力：DI≥70。

參考 Kor-ba[15]的抗病性分級(jí)指標(biāo)，制定品種抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)(表3)。

表2 梨火疫病原菌接種離體葉片、枝條的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Grading standard for disease of isolated branches inoculated with pathogen of pear fire blight

表3 梨火疫病抗病性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Classification standard of resistance to pear fire blight

2 結(jié)果與分析

2.1 感病特征及抗病性比較

2.1.1 4種梨離體葉片接種梨火疫病的抗性差異 接種梨火疫病菌后，葉片均呈現(xiàn)出不同程度的感病特征(圖1)，較為典型的癥狀為接種點(diǎn)附近及其周邊都呈現(xiàn)出黑褐色色斑。接種后2～3 d后可觀察到接種點(diǎn)周邊微微發(fā)黑，4 d后接種點(diǎn)上下的葉脈組織逐漸蔓延開始變黑，部分還流出具有光澤的細(xì)菌溢，初期為白色，之后變?yōu)殓晟?，粘稠狀?～7 d葉片病斑變黑壞死。不同梨砧木類型離體葉片的病斑蔓延情況，發(fā)病枝條數(shù)、測(cè)量葉片病斑長(zhǎng)度，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)，結(jié)果見表4。

圖1 離體葉片接種梨火疫病菌的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of isolated leaves inoculated with pear fire blight

表4 不同梨種質(zhì)離體葉片接種梨火疫病菌的病斑蔓延情況及接種結(jié)果Table 4 Disease spot spread and inoculation results of pear fire blight inoculated on isolated leaves of different pear germplasm

結(jié)果表明，4種梨砧木葉片均對(duì)梨火疫病菌侵染有顯著差異(P< 0.05)，平均發(fā)病率為 68.6%～88.6%，平均病情指數(shù)為27.20～ 62.86。其中秋子梨對(duì)梨火疫病菌具有一定的耐病性，屬于耐病(T)；豆梨對(duì)梨火疫病菌病情指數(shù)為42.238，屬于中感(MS)；杜梨病情指數(shù)最高為62.862，屬于感病(S)，川梨也屬于感病(S)。從離體葉片接菌結(jié)果來看，秋子梨砧木類型對(duì)梨火疫病的抗病性較好，其次是豆梨類型。而杜梨和川梨抗病性表現(xiàn)較差。

2.1.2 4種梨砧木的離體枝條接種梨火疫病的抗性差異 在接種梨火疫病菌后，枝條均呈現(xiàn)出不同的感病特征(圖2)，比較典型的特征就是在接種點(diǎn)附近出現(xiàn)了明顯的色斑。在接種2～3 d后，接種點(diǎn)出現(xiàn)粘稠狀的白色菌膿，會(huì)隨著時(shí)間大量流出，并且白色菌膿會(huì)隨著時(shí)間慢慢變成琥珀色。接種4～7 d之后，病情迅速發(fā)展，導(dǎo)致接種點(diǎn)上下的植物枝條組織變黑壞死，枝條上葉片也會(huì)變黑焦枯，但不會(huì)掉落。與病株Erwiniaamylovora的空白對(duì)照(無菌水)接種后，接種點(diǎn)及周邊黑斑幾乎無蔓延，無菌膿。不同梨砧木類型離體枝條的病斑蔓延情況、發(fā)病枝條數(shù)、枝條病斑長(zhǎng)度及發(fā)病率、病情指數(shù)結(jié)果見表5。

圖2 離體枝條接種梨火疫病菌的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of isolated branches inoculated with pear fire blight

表5 不同梨種質(zhì)離體枝條接種梨火疫病菌的病斑蔓延情況及接種結(jié)果Table 5 Disease spot spread and inoculation results of pear fire blight inoculated on isolated branches of different pear germplasm

結(jié)果表明，接種病原菌前后有顯著差異(P< 0.05)，平均病情指數(shù)為16.402～33.862。秋子梨對(duì)梨火疫病菌屬于耐病(T)，其病情指數(shù)為 16.402；豆梨對(duì)梨火疫病菌病情指數(shù)為18.942，屬于中感(MS)；杜梨和川梨的病情指數(shù)分別為 33.862和31.005，屬于感病(S)。根據(jù)離體枝條數(shù)據(jù)分析得出4種梨砧木抗病性大小依次為秋子梨>豆梨>川梨>杜梨。

2.1.3 4種梨砧木的活體嫩梢接種梨火疫病的抗性差異 在接種梨火疫病菌后，嫩梢均呈現(xiàn)出不同的感病特征(圖3)，在接種2～3 d之后，接種點(diǎn)周圍的組織發(fā)黑且有少量的蔓延。接種3～4 d之后，發(fā)黑有潰瘍斑的部位流出白色菌膿，且發(fā)病速度變快。在接種4～5 d之后，發(fā)病部位又出現(xiàn)大量的白色菌膿，且有些變成琥珀色，嫩梢的頂端呈現(xiàn)萎蔫狀。在接種5～7 d之后，嫩梢上的病斑可達(dá)數(shù)十厘米，周邊的葉片萎蔫發(fā)黑，但不掉落。與病株Erwiniaamylovora對(duì)照的空白(無菌水)接種后，接種點(diǎn)及周邊黑斑幾乎無蔓延，無菌膿。不同梨砧木類型活體嫩梢的病斑蔓延情況、發(fā)病枝條數(shù)、枝條病斑長(zhǎng)度及發(fā)病率、病情指數(shù)結(jié)果見表6。

圖3 活體嫩梢接種梨火疫病菌的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of isolated branches inoculated with pear fire blight

表6 不同梨種質(zhì)活體嫩梢接種梨火疫病菌的病斑蔓延情況及接種結(jié)果Table 6 Disease spot spread and inoculation results of pear fire blight inoculated on young shoots of different pear germplasms

結(jié)果表明，4種梨砧木枝條均對(duì)梨火疫病菌有感病性，且有顯著差異(P< 0.05)。其中秋子梨病斑蔓延速度最緩慢，而杜梨3～4 d病斑蔓延百分比上升20.08%。說明秋子梨對(duì)于梨火疫病具有一定的抗病性，而該病原菌對(duì)杜梨有著很強(qiáng)的致病力。按照抗性分級(jí)可將秋子梨、豆梨、杜梨和川梨分為抗病(R)、耐病(T)、感病(S)和中感(MS)類型。4種梨砧木活體嫩梢類型的抗病性大小依次為秋子梨>豆梨>川梨>杜梨。

2.2 4種梨砧木接種梨火疫病菌相關(guān)性分析

由表7～8結(jié)果來看，秋子梨、豆梨的離體葉片發(fā)病率及病情指數(shù)略高于活體接種值，估計(jì)有可能是因?yàn)槭覂?nèi)試驗(yàn)的接種環(huán)境濕度大更有利于梨火疫病菌的生長(zhǎng)繁殖所致。且可以看出：離體葉片和離體枝條接種病原菌后得到抗病性分級(jí)一致率達(dá)到87.5%，對(duì)這3種接種方式進(jìn)行相關(guān)性分析，其離體葉片與離體枝條相關(guān)系數(shù)為0.440，呈極顯著相關(guān)性水平(P<0.01)；離體葉片與活體嫩梢相關(guān)系數(shù)為0.674，呈極顯著相關(guān)性水平(P< 0.01)；離體枝條和活體嫩梢接種病原菌后得到抗病性分級(jí)一致率達(dá)到62.5%，相關(guān)性為 0.711，呈極顯著相關(guān)性水平(P< 0.01)；說明在人工接種的情況下可以采用這3種方式進(jìn)行病原菌接種，離體與活體接種方法均可以鑒定梨火疫病抗性，且鑒定結(jié)果具有一定的準(zhǔn)確性。

表7 不同梨砧木離體葉片、離體枝條接種及活體嫩梢接種抗病性結(jié)果Table 7 Disease resistance in vitro leaves,in vitro branches and in vivo young shoots of different pear rootstocks

表8 4種梨砧木離體葉片、離體枝條接種及活體嫩梢相關(guān)性分析Table 8 Correlation analysis of inoculation of leaves and branches in vitro and young shoots in vivo of four pear rootstocks

3 討 論

大量的國(guó)內(nèi)外研究表明，如若能培育出抗病品種或篩選出對(duì)梨火疫病具有較好的抗性的砧木，就能起到很好地防控病情的作用[12]。2000年，李穎章等[16]對(duì)蘋果的組培苗及溫室栽培苗進(jìn)行火疫病菌接種來研究它們之間的感病性，結(jié)果表明易感品種體內(nèi)的病原菌數(shù)量大于較抗品種。2008年，劉華威等[12]對(duì)現(xiàn)保存的54份梨種質(zhì)資源進(jìn)行抗病性研究，結(jié)果表明中國(guó)有80.4%的梨資源對(duì)梨火疫病具有較好的抗性，東方梨品種比西方梨的抗病性更強(qiáng)。2019年，李洪濤等[14]采用來自國(guó)外3種不同的致病菌株對(duì)離體枝條和幼果進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果表明3種菌株均對(duì)供試?yán)娣N質(zhì)有較強(qiáng)的致病力，其中2種表現(xiàn)為抗病性，4種耐病性，其他均為感病品種。其中的杜梨屬于高感類型，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。國(guó)外在抗梨火疫病方面做了不少研究，美國(guó)科學(xué)家Paprstein等[17]已培育出高抗品種——‘Bohemica’，該品種在供試的14個(gè)品種中展現(xiàn)出良好的抗性，并且測(cè)試了OHxF 69、87、230和333等砧木類型，結(jié)果表明，OHxF-87砧木在梨樹生長(zhǎng)和產(chǎn)量方面表現(xiàn)優(yōu)異。德國(guó)學(xué)者Reininger 等[18]培育出‘雪蘭多梨’新品種，具有貯藏壽命長(zhǎng)、產(chǎn)量穩(wěn)定、抗火疫病的生理特性。根據(jù)本研究結(jié)果可知，庫(kù)爾勒近年來培育的香梨品種多是嫁接在高感砧木杜梨上，導(dǎo)致庫(kù)爾勒地區(qū)的特色林果產(chǎn)量急劇下降，嚴(yán)重影響地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[19]。所以，在防治梨火疫病方面，還需要繼續(xù)篩選出更好的抗病資源用于抗病品種的選育，以在關(guān)鍵時(shí)刻起到很好地控制病情的作用，確保林果產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)[20]。

4 結(jié) 論

梨火疫病擴(kuò)散蔓延速度極快，如果一旦流行起來，將會(huì)對(duì)新疆乃至全國(guó)的蘋果、梨等水果產(chǎn)業(yè)構(gòu)成威脅，同時(shí)也必將會(huì)影響中國(guó)其他水果等優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易。故本試驗(yàn)采用離體葉片、離體枝條和活體嫩梢結(jié)合的方式人工鑒定不同砧木類型對(duì)梨火疫病的抗病性強(qiáng)弱，為開展優(yōu)異梨砧木資源選育及梨火疫病的合理防治奠定理論基礎(chǔ)。2000年，胡白石[21]就進(jìn)行了花器及幼果接種來進(jìn)行火疫病抗性鑒定，但他發(fā)現(xiàn)花器和幼果抗性閾值比較低，無法將致病力相近的菌株加以區(qū)分；并且在花器對(duì)火疫病接種鑒定方面沒有形成一定權(quán)威性的抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，而果實(shí)接種病原菌無法很好地量化其發(fā)病程度，故本試驗(yàn)中沒有采用花器及幼果接種方式。

本試驗(yàn)采用的是離體與活體相結(jié)合的方式鑒定其抗病性，方便快捷的同時(shí)也能夠很直觀的初步得出抗病性的大小，但有學(xué)者認(rèn)為植物是不存在絕對(duì)的抗性，只是對(duì)外來病原菌具有不同的反應(yīng)速度[22]；植物反應(yīng)取決于生長(zhǎng)的階段和環(huán)境條件，并且它們的對(duì)病原菌的反應(yīng)速度對(duì)表型的表現(xiàn)也有很大的影響；離體葉片、枝條的存活時(shí)間有限，可能存在病害沒有完全蔓延，而離體的組織已不能正常地生長(zhǎng)的情況；每種梨砧木活體嫩梢之間也存在個(gè)體的差異性，也受到日照、濕度、溫度等多方面的影響，可能會(huì)造成病情發(fā)展的遲緩或加劇[23]?；谏鲜龅那闆r，后續(xù)的試驗(yàn)中將會(huì)在更加封閉隔離的狀態(tài)下進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。采用更好離體的葉片、枝條的保存方法，讓病情發(fā)展更加真實(shí)可靠。本研究通過梨火疫病菌人工接種鑒定，分析梨砧木資源對(duì)于梨火疫病的抗病水平，以期為梨火疫病的抗病選育提供參考。