姜艷鵬， 胡振華， 張翠靜， 隋業(yè)偉， 陸洪省

(山東科技大學(xué)安全與環(huán)境工程學(xué)院，山東青島 266590)

姜是一種普遍種植的香辛類保健蔬菜，具有廣泛的醫(yī)用效果[1]和較高的經(jīng)濟價值[2]。但隨著連年種植，種植區(qū)姜瘟病的發(fā)病率逐年升高[3]，姜瘟病的發(fā)生通常認為是由青枯勞爾氏菌[4]引起的，該病原體可以在土壤中存活很久。其發(fā)病地塊一般減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時導(dǎo)致絕產(chǎn)[5-6]，對生姜的種植生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。

在我國通常采用化學(xué)法防治姜瘟病的發(fā)生[7]，目前廣泛使用土壤熏蒸劑如甲基溴、棉隆及氯化苦進行土壤消毒，能有效控制土傳病蟲害，但對環(huán)境和人體健康都造成了負面影響，因此化學(xué)防治姜瘟病的方法正逐步被淘汰[8]。生物防治是化學(xué)殺菌劑的一種潛在替代方法[9-10]，篩選對姜瘟病病原菌的拮抗菌株，對生姜的種植具有重要意義[11-12]?？莶菅挎邨U菌被認為是應(yīng)用最廣泛、研究最充分的生防菌之一[13-14]，具有很強的競爭活力，如與鐮刀菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)或分泌抗菌物質(zhì)來抑制鐮刀菌[15]，且對葡萄灰霉病、稻瘟病等具有良好的抑菌效果，其基因組的4%～5%負責(zé)合成抗生素，如環(huán)脂肽(LPs)、豐霉素[16]等。

本研究于2020年9月采集山東省安丘市凌河鎮(zhèn)生姜種植基地患病地塊的土樣，并進行病原菌分離，根據(jù)16S rDNA與致病性試驗，鑒定其為陰溝腸桿菌。陰溝腸桿菌作為內(nèi)生菌，在有利于細菌生存或者宿主敏感的條件下，會影響姜根莖的質(zhì)量，造成其腐爛[17-18]，然而研究枯草芽孢桿菌對陰溝腸桿菌的抑制效果尚未見報道。本研究的主要目的是在實驗室條件下評估枯草芽孢桿菌對陰溝腸桿菌的抑制效果，為后期生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 試驗土樣采自山東省安丘市凌河鎮(zhèn)生姜種植基地(119.07°E、36.36°N)，拮抗菌枯草芽孢桿菌J22為筆者所在實驗室之前分離得到的菌株。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 致病菌篩選培養(yǎng)基(LB)：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉5 g，瓊脂20 g，水補充至1 000 mL，pH值7.2。蛋白酶培養(yǎng)基：脫脂奶粉100 g，瓊脂15～20 g，水補充至1 000 mL[19]。

1.2 試驗方法

1.2.1 致病菌的分離和鑒定 取發(fā)病地塊姜土樣品，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量測序，擴增區(qū)域為V3～V4(細菌)[20]。配制土壤梯度浸出液，并在LB固體培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng) 48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，經(jīng)多次純化培養(yǎng)，共分離到12個菌株，對分離到的菌株進行16S rDNA測序，PCR擴增引物為27F(5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3′)和1492R(5′-T A C G G C T A C C T T G T T A C G A C T T-3′)[21]。利用美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)數(shù)據(jù)庫對測得的 16S rDNA 進行同源性比對，并通過MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，鑒定種屬[22]。

1.2.2 細菌菌株的致病性分析 姜根莖清洗后，用0.5%次氯酸鈉消毒，再用無菌水洗凈。切成 3 mm 厚的薄片，用頂端涂有致病菌菌液的牙簽對薄片進行接種，未涂有菌液的薄片為對照[23-24]，30 ℃ 下靜置培養(yǎng)，觀察其致病性。

1.2.3 枯草芽孢桿菌J22的抑菌能力測定 (1)液體培養(yǎng)抑菌法：將陰溝腸桿菌和枯草芽孢桿菌J22分別在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)速為 120 r/min，培養(yǎng)溫度為30 ℃，得到富集液。取 15 mL 陰溝腸桿菌和枯草芽孢桿菌J22富集液分別加入270 mL LB 液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，每隔6 h在520 nm處測定吸光度，單獨培養(yǎng)陰溝腸桿菌測得的吸光度為對照。利用公式(1)計算抑菌率：抑菌率=(D對照-D處理)/D對照×100%[25]。(2)平板培養(yǎng)抑菌法：分別取 10 μL 枯草芽孢桿菌J22與陰溝腸桿菌富集液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h得到菌落，再用0.6 cm的打孔器取陰溝腸桿菌菌餅置于LB固體培養(yǎng)基中央，同時取枯草芽孢桿菌J22菌餅與陰溝腸桿菌菌餅置于LB固體培養(yǎng)基兩側(cè)，每處理重復(fù)3皿，30 ℃培養(yǎng)3 d，測量菌斑直徑。利用公式(2)計算抑菌率：抑菌率=[菌落直徑(CK)-菌落直徑(處理) ]/[菌落直徑(CK)-菌絲塊直徑]×100%[26]。

1.2.4 枯草芽孢桿菌J22代謝物測定 蛋白酶檢測：在每張6 mm的滅菌濾紙片上滴枯草芽孢桿菌J22發(fā)酵液5 μL，放置在蛋白平板中央，每處理重復(fù)3皿，30 ℃培養(yǎng)，觀察有無透明圈產(chǎn)生[27]。紅外光譜測定：分別對陰溝腸桿菌、枯草芽孢桿菌及陰溝腸桿菌和枯草芽孢桿菌(陰溝-枯草)富集液 4 000 r/min、離心5 min，得到沉淀物，60 ℃條件下烘干沉淀物10 h，研磨成粉末并與溴化鉀以質(zhì)量比1 ∶100的比例混合均勻，壓片制樣，采用Nicoiet 380傅立葉紅外光譜儀在4 000～500 cm-1下進行掃描[25]。

1.2.5 抑菌物質(zhì)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)測定 分別對陰溝腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及陰溝-枯草的共培養(yǎng)液8 000 r/min離心 15 min，收集上清液，用HCl調(diào)節(jié)pH值為2.0，在 4 ℃ 下過夜，對處理液8 000 r/min離心15 min，得到沉淀物，并用甲醇對沉淀物進行溶解，用NaOH將pH值調(diào)至7.0后，8 000 r/min離心15 min，收集上清液，在50 ℃條件下對上清液旋轉(zhuǎn)濃縮，用甲醇給濃縮液定容至50 mL，采用 LC-MS進行分析[28]。

1.2.6 高通量測序分析 在10 g姜瘟發(fā)病土壤中加入20 mL枯草芽孢桿菌 J22培養(yǎng)液，30 ℃培養(yǎng) 7 d，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量分析，擴增區(qū)域為 V3～V4(細菌)，對測序結(jié)果進行物種分類分析和菌群差異分析，以未加入枯草芽孢桿菌J22培養(yǎng)液的土壤樣品為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰溝腸桿菌的鑒定

對分離得到的致病菌進行16S rDNA測序，用NCBI數(shù)據(jù)庫對測得的序列進行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)樹(圖1)。從圖1可以看出，分離菌株與陰溝腸桿菌SN19(JQ904624.1)堿基序列相似度為98%，暫鑒定該分離致病菌為陰溝腸桿菌-SKD(Enterobactercloacae-SKD)。

2.2 陰溝腸桿菌的致病性分析

涂有陰溝腸桿菌-SKD的姜切片以及未涂菌液的切片(對照)，在30 ℃條件下培養(yǎng)14 d，結(jié)果如圖2所示。涂有陰溝腸桿菌-SKD的姜片組織內(nèi)部明顯出現(xiàn)發(fā)黃、質(zhì)地變軟、腐爛病狀(圖2-a)。以無菌水為對照的姜片上未出現(xiàn)變色腐爛等癥狀(圖2-b)。

2.3 枯草芽孢桿菌的抑菌能力測定

2.3.1 液體培養(yǎng)的抑菌效果 對陰溝腸桿菌-SKD單獨培養(yǎng)液以及陰溝-SKD+枯草J22共培養(yǎng)液進行吸光度(D520 nm)測定，繪制生長曲線(圖3)。結(jié)果表明，陰溝腸桿菌-SKD最大吸光度為1.173，陰溝-SKD+枯草J22共培養(yǎng)時最大吸光度為0.961，降低了0.212，根據(jù)公式(1)計算得到抑菌率為18.07%。

2.3.2 平板對峙 在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，陰溝腸桿菌-SKD單獨培養(yǎng)時的菌餅直徑為10 cm(圖 4-a)，共培養(yǎng)時菌餅直徑為6 cm(圖4-b)，根據(jù)公式(2)得到J22對陰溝腸桿菌-SKD的抑菌率為42.55%。

2.4 枯草芽孢桿菌J22產(chǎn)酶與代謝物質(zhì)的分析

2.4.1 產(chǎn)酶能力分析 如圖5所示枯草芽孢桿菌J22在蛋白酶平板中培養(yǎng)3 d后，平板中出現(xiàn)明顯透明圈，表明枯草芽孢桿菌J22能分泌蛋白酶，可將奶粉蛋白質(zhì)降解成小分子可溶性物質(zhì)。

2.4.2 代謝產(chǎn)物的紅外吸收光譜測定 對枯草芽孢桿菌J22富集液(a)、陰溝腸桿菌-SKD富集液(b)、陰溝-SKD+枯草J22共培養(yǎng)液(c)進行離心，采用紅外光譜測定離心后的沉淀物，測定結(jié)果如圖6所示。(a)在1 656.79 cm-1出現(xiàn)吸收峰。(b)在1 654.79 cm-1出現(xiàn)吸收峰，其吸收峰均落在1 700～1 600 cm-1范圍內(nèi)，為酰胺譜帶Ι，表明樣品中含有肽鍵[29]。(c)的吸收峰移出現(xiàn)在1 651.59 cm-1，表明共培養(yǎng)時分子內(nèi)氫鍵被破壞，使峰位向低波數(shù)移動[29]。相較于(a)和(b)，(c) 代表酰胺基(—CONH—)的吸收峰明顯增強，在1 560.16 cm-1出現(xiàn)明顯吸收峰。(a)在1 231.51 cm-1、(b)在 1 234.51 cm-1出現(xiàn)特征吸收峰，證明樣品中含有脂肽類物質(zhì)[30]。從(a)的吸收峰1 065.33 cm-1和(b)的吸收峰1 086.53 cm-1移至(c)的吸收峰 1 117.37 cm-1，證明了(c)中谷氨酸/天冬氨酸的羧基側(cè)鏈(O—H伸縮)和酰胺基的—NH鍵的存在[31]。從圖6可以看出，(c)在 700～500 cm-1處的寬峰相比于(a)和(b)的紅外光譜圖發(fā)生了較明顯的變化，這可能是枯草芽孢桿菌J22產(chǎn)生的脂肽物質(zhì)給陰溝腸桿菌-SKD帶來了影響[31]。觀察到的峰值與Das等報道的脂肽生物表面活性素的峰值[32-33]相似。脂肽生物表面活性素也產(chǎn)生了類似的紅外吸收模式，并在大致相同的波數(shù)位置被吸收[32]。

2.5 抑菌活性物質(zhì)的LC-MS測定

2.5.1 枯草芽孢桿菌J22單獨培養(yǎng)條件下 對培養(yǎng)5 d后的J22菌液進行離心，收集上清液，利用 LC-MS 對上清液中的抑菌活性物質(zhì)進行測定，結(jié)果如圖7、圖8所示。從圖7可以看出，色譜峰主要出現(xiàn)在13.39、14.32、14.91、16.77 min，結(jié)合圖8質(zhì)譜圖，得到其分子質(zhì)荷比(m/z)分別為1 008.658 8、1 022.673 9、1 036.689 8、1 036.690 7，根據(jù)高學(xué)文等的研究[34]推測均為表面活性素。

2.5.2 陰溝腸桿菌-SKD單獨培養(yǎng)條件下 對培養(yǎng)5 d后的陰溝腸桿菌-SKD菌液進行離心，收集上清液，利用LC-MS對上清液的物質(zhì)進行測定，結(jié)果如圖9、圖10所示。在9.52 min處峰主要分子質(zhì)荷比為946.399 5，在10.14 min處峰主要分子質(zhì)荷比為727.392 5，通過Xcalibur軟件進行元素組成分析，元素組成為C27H55O13N10，根據(jù)劉郵洲等的研究[35]推測質(zhì)荷比 1 029.533 4為桿菌霉素，質(zhì)荷比 1 447.714 8為泛革素；10.61 min處峰主要分子質(zhì)荷比為1 036.689 8，推測其為表面活性素；11.04、12.43 min處主要分子質(zhì)荷比分別為739.411 3、463.320 7，元素組成分別為 C25H59O15N10、C29H41O2N3，結(jié)構(gòu)有待進一步鑒定。13.51、13.88、14.86 min 處主要分子質(zhì)荷比分別為994.643 4、1 008.658 6、1 022.674 9，均為表面活性素。

2.5.3 陰溝-SKD+枯草J22共培養(yǎng)條件下 陰溝-SKD+枯草J22共培養(yǎng)5 d后進行離心，收集上清液，利用LC-MS對上清液中的抑菌活性物質(zhì)進行測定，結(jié)果如圖11、圖12所示。10.09、10.67、11.87 min處峰主要分子質(zhì)荷比為579.341 9、563.346 5、463.320 1，通過Xcalibur軟件進行元素組成分析，元素組成分別為C18H47O11N10、C28H51O11N2、C29H41O2N3，12.28 min處峰主要分子質(zhì)荷比為463.320 5、503.313 0，元素組成分別為C29H41O2N3、C29H39O3N6；結(jié)構(gòu)有待進一步鑒定。13.57 min處峰主要分子質(zhì)荷比為683.543 4，元素組成為C27H59O10N10；13.88、14.78、15.36 min處峰主要分子質(zhì)荷比為 1 008.659 4、1 022.674 5、1 036.690 4，推測其均為表面活性素。

綜上所述，3種培養(yǎng)條件下，均出現(xiàn)表面活性素的離子峰，分子質(zhì)荷比值相差14，分別為1 008.7、1 022.7 和1 036.7， 證明這3種活性肽均為脂肪酸鏈同系物，且相差1個亞甲基(—CH2)。同時，陰溝-SKD+枯草J22共培養(yǎng)時產(chǎn)生了較多新物質(zhì)，如 C18H47O11N10、C28H51O11N2、C29H41O2N3、C29H39O3N6、C27H59O10N10，具體結(jié)構(gòu)有待進一步鑒定。

2.6 高通量測序分析

對加入枯草芽孢桿菌J22和未加入枯草芽孢桿菌J22的土壤分別進行高通量分析，結(jié)果如圖13所示。加入枯草芽孢桿菌J22的土壤樣品中，在目水平上，假單胞菌目相對豐度升高了14.17百分點，莖桿菌目相對豐度升高了13.97百分點，腸桿菌目相對豐度降低了10.71百分點；在科水平上，假單胞菌科相對豐度升高了23.47百分點，成為優(yōu)勢菌，莖桿菌科相對豐度升高了13.86百分點，腸桿菌科相對豐度減少了10.71百分點，莫拉菌科相對豐度減少了9.31百分點；在屬水平上，假單胞菌屬相對豐度增加了23.48百分點，成為優(yōu)勢菌，短鏈單胞菌相對豐度增加了14.28百分點，腸桿菌屬相對豐度減少10.39百分點，不動桿菌相對豐度減少9.31百分點；在種水平上，惡臭假單胞桿菌相對豐度增加了23.06百分點，成為優(yōu)勢菌，鞘氨醇桿菌相對豐度增加了4.44百分點，陰溝腸桿菌相對豐度減少了10.39百分點。

高通量分析結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌J22在目、科、屬、種水平上對土壤菌落結(jié)構(gòu)的影響一致，其中假單胞菌、鞘氨醇單胞菌、莖桿菌相對豐度均變大，姜瘟病致病菌(陰溝腸桿菌-SKD)相對豐度出現(xiàn)明顯降低，證明枯草芽孢桿菌J22對土壤中腸桿菌具有抑制作用，具有一定的姜瘟病防治潛力。

3 討論

本研究通過對發(fā)病地塊進行病原菌的分離、培養(yǎng)、純化，篩選出1株能夠使姜切片患病的菌株，根據(jù)16S rDNA確定姜瘟致病菌為陰溝腸桿菌-SKD。陰溝腸桿菌可在患病玉米、洋蔥[36]、水稻植株等植物中分離出來[37]，同時，陰溝腸桿菌可以作為生姜內(nèi)生菌，在有利于細菌生存或者宿主敏感的條件下，會影響根莖的質(zhì)量，造成其腐爛[18]。目前，暫未見對由陰溝腸桿菌引起的姜瘟病進行生物防治的報道?？莶菅挎邨U菌抑菌能力強，應(yīng)用范圍廣。因此，本試驗研究了枯草芽孢桿菌J22對陰溝腸桿菌-SKD的抑制效果，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌J22在液體培養(yǎng)、平板對峙試驗中均顯示對陰溝腸桿菌-SKD有一定的抑制作用，同時，蛋白酶作為抑菌物質(zhì)也在本試驗中通過透明圈得到證明[38]。

表面活性素是已知最有效的抑菌物質(zhì)之一，可顯著抑制細菌、病毒、真菌、支原體的生長[39]。本試驗通過紅外光譜與LC-MS分析枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)，主要分子質(zhì)量在460～1 500 u 區(qū)間，其中含量最多的為表面活性素。桑建偉等的研究結(jié)果顯示，解淀粉芽孢桿菌 BEB17也可以產(chǎn)生表面活性素[40]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌FZB42 產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)可抑制病原真菌的生長，對由歐文氏菌引起的梨火疫病具有防治效果[41]。目前國內(nèi)外對表面活性素的研究越來越廣泛，多數(shù)研究者認為表面活性素具有很強的抗菌活性，能夠改變細菌的表面疏水性，破壞膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致代謝物質(zhì)外泄[42]。本試驗中通過傅立葉紅外光譜和LC-MS檢測到枯草芽孢桿菌粗提物中也存在表面活性素，從而從機理上證明了枯草芽孢桿菌對陰溝腸桿菌-SKD具有抑制作用。

通過高通量測序分析土壤中的細菌群落構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)加入枯草芽孢桿菌后，陰溝腸桿菌在目、科、屬、種的水平上均有所降低，在土壤中主要的優(yōu)勢菌為假單胞菌、鞘氨醇單胞菌和莖桿菌，為下一步進行田間試驗提供了理論依據(jù)。

試驗表明枯草芽孢桿菌對陰溝腸桿菌-SKD有顯著的抑制作用， 為開發(fā)具有環(huán)境安全的生物農(nóng)藥[43]以及姜瘟病防治的實際應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本試驗從山東省安丘市分離純化出姜瘟病的致病菌，經(jīng)16S rDNA和致病性試驗鑒定致病菌為陰溝腸桿菌-SKD，可作為生姜內(nèi)生菌，引起姜根莖腐爛。通過液體培養(yǎng)和平板對峙試驗，枯草芽孢桿菌J22對陰溝腸桿菌均有抑制效果，抑制率分別為18.07%、42.55%，通過蛋白酶平板的透明圈驗證了枯草芽孢桿菌J22能夠分泌蛋白酶類抑菌物質(zhì)?？莶菅挎邨U菌J22發(fā)酵液經(jīng)離心提取的抑菌物質(zhì)，經(jīng)紅外光譜測定為內(nèi)酯類的環(huán)狀脂肽，再經(jīng)酸沉降，高效液相色譜和質(zhì)譜鑒定其分子質(zhì)量范圍為460～1 500 u，有效成分為枯草芽孢桿菌表面活性素。高通量分析枯草芽孢桿菌J22對姜瘟病土壤中的細菌菌群影響，表明加入枯草芽孢桿菌后枯草芽孢桿菌對腸桿菌-SKD在目、科、屬、種水平上的相對豐度分別降低了10.71、10.71、10.39、10.39百分點，且前后優(yōu)勢菌群沒有發(fā)生變化。為后續(xù)進行田間試驗提供了理論依據(jù)。