梁婷，梁沁，周翠娟，盧靜蘭

(廣西醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院 貴港市人民醫(yī)院，貴港 537100)

胚胎質(zhì)量和內(nèi)膜容受性是影響輔助生殖技術(shù)(ART)助孕成功的兩個(gè)關(guān)鍵因素。近年來，隨著促排卵方案的優(yōu)化、受精方式的改進(jìn)和胚胎培養(yǎng)及篩選技術(shù)的提高，胚胎質(zhì)量已得到較為充分的保障。因此，改善子宮內(nèi)膜容受性成為提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)臨床妊娠率、降低胚胎反復(fù)種植失敗的關(guān)鍵[1]。

輸卵管積液是育齡期婦女常見的疾病，是慢性盆腔炎性疾病后遺癥的主要表現(xiàn)。盡管IVF-ET最初就是主要針對(duì)輸卵管因素性不孕癥進(jìn)行治療，但令人費(fèi)解的是，與其他不孕原因患者相比，重度輸卵管積液不孕患者往往臨床助孕結(jié)局較差[2]。一些回顧性研究表明，輸卵管積液患者的胚胎著床率和妊娠率較低[3-4]，輸卵管積液與IVF的不良結(jié)局之間存在明確的聯(lián)系[4-5]。輸卵管積液患者的自然流產(chǎn)率也有所增加[6-7]。另一方面，在IVF之前接受輸卵管切除術(shù)的輸卵管積液患者，臨床妊娠率和活產(chǎn)率增加[8]。其他回顧性研究也報(bào)告了輸卵管積液患者行輸卵管切除術(shù)后的預(yù)后得到改善[4-5]。

輸卵管積液對(duì)生育結(jié)局的損害不僅與輸卵管積液的胚胎毒性有關(guān)，而且與其所致內(nèi)膜炎性環(huán)境有密切聯(lián)系。研究認(rèn)為輸卵管積液主要包含炎癥性因子、免疫細(xì)胞和壞死組織，積液倒流引起宮腔積液，影響子宮內(nèi)膜的形態(tài)[9]。炎癥環(huán)境使內(nèi)膜免疫微環(huán)境受到破壞，有可能會(huì)引起慢性子宮內(nèi)膜炎(chronic endometritis，CE)，并損害子宮內(nèi)膜容受性[10]。

對(duì)于輸卵管積液的患者，準(zhǔn)確評(píng)估其子宮內(nèi)膜容受性是改善助孕結(jié)局的關(guān)鍵。然而，目前臨床上評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性的方法較簡(jiǎn)單，僅從激素水平和超聲影像學(xué)評(píng)估某一時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)膜狀態(tài)，其準(zhǔn)確性和可重復(fù)性均存疑，缺乏動(dòng)態(tài)的、綜合的內(nèi)膜容受性監(jiān)測(cè)手段。本文將綜合超聲學(xué)指標(biāo)、子宮內(nèi)膜容受性分子標(biāo)志物，如同源框基因A10(homeobox gene A10，HOXA10)、整合素αvβ3等，連續(xù)、動(dòng)態(tài)地評(píng)估輸卵管積液患者的子宮內(nèi)膜容受性，以期為輸卵管積液導(dǎo)致不孕的患者提供治療依據(jù)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

以2020年7月至2022年6月在貴港市人民醫(yī)院生殖中心助孕的不孕癥患者作為招募對(duì)象。

輸卵管積液組(積液組)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20～40歲，卵巢儲(chǔ)備功能正常；(2)因輸卵管因素、男方因素等進(jìn)行IVF/ICSI-ET或凍融胚胎移植(FET)；(3)子宮輸卵管造影(HSG)提示至少一側(cè)存在輸卵管積液；(4)近3個(gè)月未使用抗生素；(5)近3個(gè)月未使用口服避孕藥和雌孕激素類藥物。無輸卵管積液組(對(duì)照組)納入標(biāo)準(zhǔn)除(3)外，其余與積液組相同，(3)改為HSG排除雙側(cè)輸卵管積液。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在嚴(yán)重心肺功能不全等全身性疾病，不能耐受宮腔鏡手術(shù)或內(nèi)膜活檢和不能耐受妊娠；(2)卵巢功能不全或內(nèi)分泌紊亂；(3)雙方或一方染色體異常。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)相同。

經(jīng)過招募，最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)的患者197例。其中，積液組(至少一側(cè)輸卵管積液)91例，對(duì)照組(無輸卵管積液)106例。所有入組患者均簽署知情同意書。本課題經(jīng)貴港市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批。

二、研究方法

1.記錄患者基本資料：年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、宮腔操作史、基礎(chǔ)激素水平(E2、FSH、LH)、抗苗勒管激素(AMH)水平等。

2.超聲監(jiān)測(cè)：入組患者胚胎移植前1～2個(gè)自然月經(jīng)周期的早卵泡期、晚卵泡期、排卵期以及黃體期的子宮內(nèi)膜厚度、子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)(PI)和阻力指數(shù)(RI)。

3.內(nèi)膜活檢：積液組和對(duì)照組分別有27人和31人自愿進(jìn)行內(nèi)膜活檢。內(nèi)膜活檢于排卵后第7天(LH+7)進(jìn)行，檢查無禁忌證后，取截石位，消毒鋪巾后，使用一次性S型宮腔組織吸引管(立可靈TY-C3.1/30-1S型，上海家寶)進(jìn)行子宮內(nèi)膜組織取樣?；顧z組織置于中性福爾馬林中固定。

4.免疫組化染色：對(duì)固定24 h的組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。用SP三步法檢測(cè)子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)整合素αvβ3(16-0519-81，Invitrogen，美國；稀釋1∶100)、HOXA10(sc-271428，Santa Cruz，美國；稀釋1∶100)以及CE分子標(biāo)志物CD138(ab128936，Abcam，美國；稀釋1∶5 000)的表達(dá)。將切片60℃烤片2 h后，進(jìn)行脫蠟和水化，放入檸檬酸鈉緩沖液(C1032，北京索萊寶)中進(jìn)行高壓抗原修復(fù)10 min，自然冷卻后用雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物15 min，山羊血清封閉20 min，隨后加入一抗，置于4℃過夜。復(fù)溫后加入相應(yīng)二抗(PV-9001，北京中杉金橋)孵育30 min，DAB(ZLI-9018，北京中杉金橋)顯色1 min，蘇木素染核30 s，隨后進(jìn)行返藍(lán)，脫水，風(fēng)干，透明，封片后鏡下觀察。

CE的診斷以每高倍鏡視野下出現(xiàn)大于5個(gè)CD138陽性的漿細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)。整合素αvβ3及HOXA10的相對(duì)表達(dá)量采用H-score方法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)分：隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別對(duì)每個(gè)視野的陽性信號(hào)強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行評(píng)分。陽性信號(hào)強(qiáng)度分為強(qiáng)、中、弱三類，分別記3、2、1分；陽性細(xì)胞數(shù)比例為視野中陽性細(xì)胞的數(shù)量占所有細(xì)胞數(shù)的比值，以百分?jǐn)?shù)表示。單個(gè)視野H-score評(píng)分為信號(hào)強(qiáng)度的得分×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，計(jì)算5個(gè)視野的平均值為該切片的最終評(píng)分。

5.CE的治療：對(duì)于確診為CE的患者，每日口服多西環(huán)素100 mg，治療14 d。治療完成后的下一個(gè)周期再行內(nèi)膜活檢復(fù)查(方法同前)，評(píng)價(jià)治療效果以及子宮內(nèi)膜容受性變化。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、入組患者基線資料

本研究共納入197例病例，其中積液組(至少一側(cè)輸卵管積液)91例，對(duì)照組(無輸卵管積液)106例。兩組患者在年齡、不孕年限、BMI、宮腔操作史、基礎(chǔ)性激素水平、AMH水平等方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基線資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者不同時(shí)期內(nèi)膜厚度/類型及內(nèi)膜血流參數(shù)

兩組患者間子宮內(nèi)膜厚度在早卵泡期和晚卵泡期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，在排卵期和黃體期，積液組子宮內(nèi)膜厚度均顯著薄于對(duì)照組(P<0.001)(表2，圖1)。兩組患者的子宮內(nèi)膜類型構(gòu)成比在早卵泡期、晚卵泡期和黃體期均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.468)；在排卵期，對(duì)照組有9.43%(10/106)的患者內(nèi)膜未轉(zhuǎn)化(仍為A型)，而積液組仍有21.98%(20/91)患者的內(nèi)膜未轉(zhuǎn)化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)(表2，圖2)。兩組間內(nèi)膜血流參數(shù)比較，積液組的RI在排卵期和黃體期顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而PI在各期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者各時(shí)期內(nèi)膜厚度、類型及內(nèi)膜血流參數(shù)比較[(-±s)，n(%)]

與積液組比較，*P<0.001。圖1 兩組患者月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜發(fā)育情況

排卵期兩組患者A型內(nèi)膜率比較，*P<0.05。圖2 兩組患者月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜類型比較

三、兩組患者HOXA10及整合素αvβ3評(píng)分

積液組和對(duì)照組分別有27名和31名患者進(jìn)行內(nèi)膜活檢，活檢時(shí)間為LH+7。通過免疫組化方法觀察兩組患者內(nèi)膜組織中HOXA10及整合素αvβ3在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)情況(圖3和圖4)，并將結(jié)果進(jìn)行H-score量化，發(fā)現(xiàn)積液組兩個(gè)指標(biāo)的H-score評(píng)分均顯著低于對(duì)照組(P<0.001)(表3)。

A：積液組；B：對(duì)照組；右側(cè)系相應(yīng)左圖(×100)方框區(qū)放大圖像(×400)。圖3 兩組患者子宮內(nèi)膜組織中的HOXA10表達(dá)(免疫組化染色)

A：積液組；B：對(duì)照組；右側(cè)系相應(yīng)左圖(×100)方框區(qū)放大圖像(×400)。圖4 兩組患者子宮內(nèi)膜組織中的整合素αvβ3表達(dá)(免疫組化染色)

表3 兩組患者子宮內(nèi)膜組織HOXA10和整合素αvβ3免疫組化結(jié)果量化(-±s)

四、兩組患者CE發(fā)病率

在進(jìn)行內(nèi)膜活檢的患者中，積液組一共有13名患者存在CE，CE發(fā)生率為48.14%(13/27)。對(duì)照組一共有6名患者存在CE，發(fā)生率為19.35%(6/31)；積液組CE發(fā)生率顯著升高(P=0.02)(表4)。

表4 內(nèi)膜活檢患者中CE發(fā)生率(%)

五、CE治療前后HOXA10及整合素αvβ3評(píng)分比較

所有19例CE患者均進(jìn)行了抗生素治療，治療后均再次進(jìn)行了內(nèi)膜活檢。再次活檢證實(shí)積液組仍有2名患者存在CE，對(duì)照組有1名患者存在CE，整體治愈率為84.21%(16/19)。與治療前相比，所有患者治療后的HOXA10表達(dá)量有升高趨勢(shì)(圖5)，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表5)；整合素αvβ3的表達(dá)量在治療后明顯升高(圖6)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表5)。

A：治療前；B：治療后；右側(cè)系相應(yīng)左圖(×100)方框區(qū)放大圖像(×400)。圖5 CE患者治療前后子宮內(nèi)膜組織中的HOXA10表達(dá)(免疫組化染色)

A：治療前；B：治療后；右側(cè)系相應(yīng)左圖(×100)方框區(qū)放大圖像(×400)。圖6 CE患者治療前后子宮內(nèi)膜組織中的整合素αvβ3表達(dá)(免疫組化染色)

表5 CE治療前后內(nèi)膜組織HOXA10和整合素αvβ3免疫組化結(jié)果量化(-±s)

討 論

本研究中，我們通過檢測(cè)月經(jīng)周期各時(shí)期子宮內(nèi)膜類型、厚度、內(nèi)膜血流參數(shù)PI和RI，以及容受期子宮內(nèi)膜容受性分子標(biāo)志HOXA10和整合素αvβ3，探究了輸卵管積液對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與無輸卵管積液的患者相比，存在輸卵管積液的患者子宮內(nèi)膜受到一定程度的損害，表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜生長緩慢，RI增大，排卵期內(nèi)膜轉(zhuǎn)換延緩，CE發(fā)生率升高，以及子宮內(nèi)膜容受性分子的表達(dá)下降。

目前，超聲檢查仍是臨床上最常用于評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性的方法[11]。通過分子手段如基因芯片、免疫組化等方法評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性分子的表達(dá)多用于實(shí)驗(yàn)研究[12]。子宮內(nèi)膜容受性微陣列(Endometrial receptivity array，ERA)是較為全面地評(píng)價(jià)容受性的方法，但由于該方法效果未明確且價(jià)格昂貴，在國內(nèi)仍少有使用[13]。

超聲檢查一般以子宮內(nèi)膜類型、子宮內(nèi)膜厚度以及內(nèi)膜血流參數(shù)PI、RI等指標(biāo)對(duì)子宮內(nèi)膜容受性進(jìn)行評(píng)估。良好的子宮內(nèi)膜表現(xiàn)為排卵期發(fā)生內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，內(nèi)膜厚度達(dá)到10 mm以上，PI、RI在正常范圍內(nèi)[14]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)從排卵期開始，積液組的子宮內(nèi)膜厚度就低于對(duì)照組，一直持續(xù)到黃體期。積液組在排卵期仍有21.98%(20/91)的患者內(nèi)膜未轉(zhuǎn)化，顯著高于對(duì)照組的9.43%(10/106)。血流動(dòng)力學(xué)上，我們觀察到積液組的RI在排卵期和黃體期高于對(duì)照組，但PI沒有明顯差異。吳洪波等[15]研究發(fā)現(xiàn)輸卵管積液會(huì)降低患者HCG注射日A型血流及三線型內(nèi)膜的比例，但對(duì)血流參數(shù)PI、RI及子宮內(nèi)膜厚度無明顯影響。產(chǎn)生這種差異的原因可能是我們與該研究的設(shè)計(jì)類型、納入/排除標(biāo)準(zhǔn)等存在差異。且本研究選取了月經(jīng)周期中具有代表性的4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，從而可以動(dòng)態(tài)地了解內(nèi)膜容受性的變化。

HOXA10和整合素αvβ3是常用于評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的指標(biāo)。HOXA10是同源框基因家族的一員，該基因敲除后會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜蛻膜化障礙，引起不孕[16]。整合素αvβ3在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞以及胚胎的滋養(yǎng)層細(xì)胞中均有表達(dá)，在母胎識(shí)別和黏附過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HOXA10和整合素αvβ3在輸卵管積液患者子宮內(nèi)膜的表達(dá)均較無輸卵管積液的對(duì)照組低，這一結(jié)果與李艷萍[18]的研究相似。此外，周云[19]研究發(fā)現(xiàn)，輸卵管積液患者在接受硬化治療后，子宮內(nèi)膜組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、整合素αvβ3、HOXA10等分子表達(dá)升高。這些結(jié)果表明，輸卵管積液最終可能會(huì)通過損害子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局，而對(duì)輸卵管積液加以糾正可能改善妊娠結(jié)局。

輸卵管積液對(duì)胚胎的毒性作用被認(rèn)為是造成女性生育率下降的主要原因。但后來發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行胚胎移植的患者中，存在輸卵管積液的患者妊娠率仍較不存在輸卵管積液的患者低，因此輸卵管積液對(duì)內(nèi)膜的損害作用也開始受到重視[20]。當(dāng)輸卵管積液反流至宮腔時(shí)，積液中的炎癥因子、細(xì)胞因子、病原體可能會(huì)對(duì)子宮內(nèi)膜產(chǎn)生損害作用。有研究發(fā)現(xiàn)，存在輸卵管積液的患者CE檢出率升高，表明積液對(duì)內(nèi)膜造成了損害[10，21]。本研究中我們檢測(cè)了一部分患者子宮內(nèi)膜CD138的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)積液組CE的檢出率是48.14%(13/27)，顯著高于對(duì)照組的19.35%(6/31)，這個(gè)結(jié)果與前述研究結(jié)果一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，輸卵管積液伴有CE的患者，CE治愈后HOXA10的表達(dá)沒有顯著變化，但整合素αvβ3的表達(dá)顯著上調(diào)，提示CE的治療可能在一定程度上改善患者的子宮內(nèi)膜容受性。這也提示我們，CE的檢測(cè)和治療可能是輸卵管因素不孕患者診療的一個(gè)重要部分。

本研究的優(yōu)勢(shì)在于，我們連續(xù)觀察了輸卵管積液患者一個(gè)完整月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜超聲參數(shù)。月經(jīng)是一個(gè)周而復(fù)始的過程，既往的研究往往只關(guān)注種植窗口期子宮內(nèi)膜容受性的狀態(tài)，連續(xù)的評(píng)估則可以發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜在哪個(gè)時(shí)期就開始出現(xiàn)異常。本研究的不足在于樣本量小，仍需要更多的臨床數(shù)據(jù)加以支持；此外，本研究中沒有繼續(xù)隨訪患者后續(xù)的妊娠結(jié)局，無法將患者的超聲學(xué)參數(shù)和免疫組化結(jié)果與妊娠結(jié)局相聯(lián)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)輸卵管積液會(huì)增加子宮內(nèi)膜血流阻力，使內(nèi)膜生長和轉(zhuǎn)化延緩。并且，輸卵管積液降低子宮內(nèi)膜容受性分子標(biāo)志物HOXA10和整合素αvβ3的表達(dá)，增加CE發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；而CE的治療可能在一定程度上改善子宮內(nèi)膜容受性。