王龍斌， 泮淼軍， 王明陽(yáng)， 王潤(rùn)澤， 李 麗，2， 董雙林，2， 李衛(wèi)東， 田相利 ，2??

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))， 山東 青島 266003； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237； 3. 唐山海都水產(chǎn)食品有限公司， 河北 唐山 063000)

新疆是中國(guó)鹽堿化土壤分布面積較廣、土壤積鹽較重的地區(qū)，其中南疆鹽堿水具有堿度高、離子比例不平衡、水質(zhì)變動(dòng)大等特點(diǎn)，合理有效地開發(fā)利用鹽堿地已成為該地區(qū)緊迫而艱巨的任務(wù)[1]。堿性水通常具有較高的堿度和pH，嚴(yán)重影響水生動(dòng)物的正常生理過程，例如直接抑制魚類的氨排泄并增加CO2排泄[2]。盡管如此，仍有一些魚類可以在高堿的環(huán)境中生存[3]，如肯尼亞馬加迪湖的馬加迪羅非魚(Alcolapiagrahami)[4]、美國(guó)金字塔湖的美洲鮭(Oncorhynchusclarkihenshawi)[5]、我國(guó)達(dá)里湖的瓦氏雅羅魚(Leuciscuswaleckii)[6]以及青海湖的裸鯉(Gymnocyprisprzewa-lskii)[7]等。這些魚類已經(jīng)進(jìn)化出特殊的生理機(jī)制以適應(yīng)堿性環(huán)境[7-9]。

轉(zhuǎn)錄組分析是解釋功能基因組學(xué)元素和揭示細(xì)胞與組織分子機(jī)制的有力工具之一[10]。近年來，RNA測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)譜的研究，包括水生動(dòng)物響應(yīng)鹽堿脅迫的通路研究。如馬加迪羅非魚[11]、瓦氏雅羅魚[6,12]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[13]、奧尼羅非魚(Oreochromismossambicusfemale×O.urolepishornorummale)[14]等，這些研究提供了大量與堿度脅迫相關(guān)的候選通路和基因。

花鱸(Lateolabraxmaculatus)屬鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)花鱸屬(Latelabrax)，具有生長(zhǎng)快、病害少、對(duì)鹽度適應(yīng)廣等特點(diǎn)。近年來，關(guān)于花鱸對(duì)鹽度的適應(yīng)能力[15-16]以及耐受機(jī)制[17-18]已得到了很好的研究。花鱸對(duì)堿度有較高的耐受性，在鹽度為10 時(shí)，堿度96 h半致死濃度為98.51 mmol/L[19]。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于花鱸耐堿機(jī)制的研究很少，僅見于堿度脅迫下Slc4基因家族[20]和熱休克蛋白 (Hsp)超家族[21]的相關(guān)研究。

在本研究中，我們利用RNA-seq技術(shù)探究了不同堿度下花鱸腎組織的基因表達(dá)情況，對(duì)其響應(yīng)堿度脅迫相關(guān)的通路及基因進(jìn)行了綜合分析，為了解花鱸適應(yīng)堿性環(huán)境的分子生物學(xué)機(jī)制提供有價(jià)值的信息。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)所用花鱸是由唐山由海都水產(chǎn)食品有限公司(河北，唐山)提供的人工繁育苗種。暫養(yǎng)一周后隨機(jī)選取135尾健康、個(gè)體大小均勻的花鱸進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。

本研究參照南疆阿拉爾地區(qū)鹽堿水的鹽度水平(10左右)，通過添加NaHCO3，設(shè)計(jì)了不同的堿度梯度。將天然海水與淡水混合成鹽度為10的海水，再添加NaHCO3(分析純)，全部溶解并穩(wěn)定24 h后使用。根據(jù)前期急性脅迫的結(jié)果，設(shè)置了0 mmol/L(con組)、15 mmol/L(AW15組)和30 mmol/L(AW30組)的堿度梯度，具體實(shí)測(cè)堿度如表1所示。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾魚，實(shí)驗(yàn)魚體長(zhǎng)(15.21±1.56) cm，體質(zhì)量(60.23±5.54) g，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2020年9月15日至10月15日，實(shí)驗(yàn)周期為 30 d。

表1 碳酸鹽堿度設(shè)置

實(shí)驗(yàn)所用水體的體積為200 L，鹽度為10，水溫控制在(20±2) ℃，溶氧(8.4±0.1) mg/L，pH=8.5±0.3。實(shí)驗(yàn)期間，每天8:00和18:00各投喂花鱸專用顆粒飼料1次，投喂量約為魚體質(zhì)量3%左右，每天換水50%，并檢測(cè)碳酸鹽堿度和pH。pH以DELTA320 型精密pH計(jì)測(cè)定，碳酸鹽堿度以酸堿滴定法(GB/T 9736—2008)測(cè)定[22]。

1.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)測(cè)量花鱸的體質(zhì)量，按以下公式計(jì)算體質(zhì)量特定生長(zhǎng)率(SGR)：

SGR=(lnW2-lnW1)/t×100%。

式中：W1為初始體質(zhì)量(g)；W2為終末體質(zhì)量；t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間(30 d)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。先對(duì)數(shù)據(jù)做單因素方差分析，組間若有顯著性差異，再用Duncan’s多重比較分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為有顯著差異。

1.3 RNA提取、建庫(kù)和測(cè)序

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)取3尾魚(共9尾)使用MS-222麻醉，解剖以獲得腎組織，在液氮中速凍并儲(chǔ)存在-80 ℃用于RNA分離。使用Invitrogen公司的TRIzol?Reagent試劑盒提取組織RNA，然后使用Roche公司的DNaseI去除基因組DNA污染，采用Nanodrop 2000、Qubit 2.0和Aglient 2100方法檢測(cè)RNA樣品純度、濃度和完整性，檢驗(yàn)合格的樣品送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，基于Illumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)以Paired-end 150 bp雙末端測(cè)序模式分別對(duì)9個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 序列比對(duì)

利用fastp對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，然后用SeqPrep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https://github.com/najoshi/sickle)去除測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量讀段、N率較高序列及長(zhǎng)度過短序列。通過TopHat2[23]將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)與花鱸參考基因組(http://gigadb.org/dataset/100458)進(jìn)行比對(duì)，獲得用于后續(xù)分析的mapped data。

1.5 表達(dá)量差異分析

使用RSEM V1.2.15[24]對(duì)mapped data進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后通過FPKM進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。利用DESeq2 R包[25]篩選差異表達(dá)基因，將P-adjust<0.05且|log2FC|≥1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。將花鱸腎組織在三個(gè)處理下兩兩對(duì)比得到的基因集(con_vs_AW15，con_vs_AW30，AW15_vs_AW30)中進(jìn)行比較分析。

1.6 GO富集和KEGG通路富集分析

使用軟件Goatools(https: //github.com/tanghaibao/GOatools)對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析，采用Bonferroni方法對(duì)P值進(jìn)行校正，當(dāng)經(jīng)過校正的P值(FDR)小于0.05 時(shí)，認(rèn)為此GO功能存在顯著富集。利用KOBAS軟件(v2.0.12)對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能和通路。

1.7 qRT-PCR驗(yàn)證

選擇9個(gè)差異表達(dá)基因，使用Primer Premier 6.0軟件[26]設(shè)計(jì)引物(見表2)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。使用諾唯贊公司HiScript?III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板、以18S ribosomal RNA為內(nèi)參基因，使用諾唯贊公司的ChamQTMSYBR?Color qPCR Master Mix試劑盒，在ABI PRISM 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行表達(dá)量分析?？傮w系20 μL的反應(yīng)體系如下：稀釋10倍的cDNA模板2.0 μL，2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，RNase-Free ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。最后在60～95 ℃制作熔解曲線。每組樣品的每個(gè)基因均重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法[27]分析基因的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 19.0軟件計(jì)算RNA-seq結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果之間的相關(guān)性系數(shù)。

表2 RT-qPCR引物信息

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可以看出，堿度嚴(yán)重影響花鱸生長(zhǎng)，隨著堿度升高，花鱸的終末體質(zhì)量、特定生長(zhǎng)率顯著降低。在15 mmol/L的中堿度下，花鱸的生長(zhǎng)速率顯著降低。而在30 mmol/L的高堿度下，花鱸的終末體質(zhì)量顯著低于初始體質(zhì)量。

表3 不同堿度對(duì)花鱸生長(zhǎng)性能的影響

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與參考序列比對(duì)分析

所有樣品的RNA濃度均高于200 ng/μL，RNA總量8 μg，均符合建庫(kù)要求。對(duì)9個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析可知，所有樣品獲得的Clean reads數(shù)量在46 266 138～55 723 922之間，利用SeqPrep軟件過濾掉不合格的序列后，所有樣品得到的有效讀數(shù)均占原始讀數(shù)總數(shù)量的97%以上(見表4)。表4中，Q20、Q30分別指測(cè)序質(zhì)量在99%和99.9%以上的堿基占總堿基的百分比，在得到的9個(gè)轉(zhuǎn)錄組中，Q20均在96%以上，Q30均在91%以上。利用HISAT2軟件將有效讀數(shù)比對(duì)到參考基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有79.71%～82.12%讀數(shù)成功映射到參考基因組。這些結(jié)果表明，花鱸腎組織各處理組測(cè)序量大，獲得的有效讀數(shù)數(shù)量多，轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量高，符合進(jìn)一步生物信息學(xué)分析的要求。

表4 花鱸腎組織轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 表達(dá)量差異分析

使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2軟件對(duì)raw counts進(jìn)行分析，基于一定的標(biāo)準(zhǔn)化處理和篩選條件獲得比較組間表達(dá)差異的基因，參數(shù)如下：P-adjust<0.05 & |log2FC| ≥1。分析得到的差異表達(dá)基因結(jié)果表明，在不同的堿度環(huán)境下，花鱸發(fā)生顯著差異表達(dá)基因的數(shù)量也不同(見表5)。與con組相比，AW15組有142個(gè)基因上調(diào)，104個(gè)基因下調(diào)；AW30組有2 037個(gè)基因上調(diào)，1 882個(gè)基因下調(diào)；與AW15相比，AW30組有1 318個(gè)基因上調(diào)，964個(gè)基因下調(diào)。對(duì)不同堿度下差異表達(dá)基因進(jìn)行綜合分析，結(jié)果如圖1所示，與con組相比，AW15組與AW30組分別有68和2 189個(gè)特有的差異表達(dá)基因；與AW15組相比，AW30組有577個(gè)特有的差異表達(dá)基因；3個(gè)基因集共有的差異表達(dá)基因?yàn)?9個(gè)。

表5 花鱸腎組織差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖1 花鱸腎組織con_vs_AW15組、con_vs_AW30組和AW15_vs_AW30組顯著差異表達(dá)基因的維恩圖

2.4 GO和KEGG富集分析

為確定可能參與堿度脅迫的生物過程或通路，分別對(duì)3個(gè)基因集(con_vs_AW15，con_vs_AW30，AW15_vs_AW30)中的顯著差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

GO富集結(jié)果顯示，差異基因被富集到生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)類別體系中。其中最豐富的類別是生物過程，其次是分子功能和細(xì)胞組分。圖2顯示了腎中3個(gè)基因集前20個(gè)顯著GO術(shù)語(yǔ)?？梢钥闯觯琧on_vs_AW15中氣體運(yùn)輸、氧結(jié)合、血紅蛋白復(fù)合物富集程度最高，con_vs_AW30中水解酶活性的正調(diào)控、GTPase活性的正調(diào)控、GTPase活性的調(diào)節(jié)富集程度最高，而AW15_vs_AW30中DNA復(fù)制啟動(dòng)、蛋白質(zhì)磷酸化、絲氨酸家族氨基酸代謝過程富集程度最高。其中，GTPase活性的正調(diào)控、水解酶活性的正調(diào)控、水解酶活性的調(diào)節(jié)、GTPase活性的調(diào)節(jié)、絲氨酸家族氨基酸代謝過程、α-氨基酸代謝過程、細(xì)胞氨基酸代謝過程等在con_vs_AW30和AW15_vs_AW30中均顯著富集。

圖2 花鱸腎組織con_cs_AW15(A)、con_vs_AW30(B)和AW15_vs_AW30(C)組差異表達(dá)基因的GO富集分析

KEGG分析表明，在3個(gè)基因集中，分別有254、344、343條通路與堿度脅迫有關(guān)。圖3顯示了腎con_vs_AW30和AW15_vs_AW30兩個(gè)基因集前20個(gè)顯著KEGG通路?？梢钥闯?，con_vs_AW30中細(xì)胞周期、葉酸一碳庫(kù)、過氧化物酶體顯著富集，AW15_vs_AW30中DNA復(fù)制、癌癥中的蛋白多糖、軸突導(dǎo)向顯著富集。其中，細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、葉酸一碳庫(kù)、上皮細(xì)胞的細(xì)菌侵襲、趨化因子信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、錯(cuò)配修復(fù)、PPAR信號(hào)通路和癌癥中的蛋白多糖在con_vs_AW30和AW15_vs_AW30均顯著富集。

圖3 花鱸腎組織con_vs_AW30(A)組和AW15_vs_AW30(B)組差異基因KEGG散點(diǎn)圖

2.5 花鱸腎組織堿度脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因分析

圖1表明con_vs_AW15、con_vs_AW30、AW15_vs_AW30這3個(gè)基因集中有49個(gè)共有差異基因，這些基因是花鱸腎組織堿度脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因，其中大多隨著堿度升高而降低(見表6)。

表6 花鱸腎組織堿度脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因

2.6 qRT-PCR驗(yàn)證

為了確認(rèn)Illumina RNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，選擇9個(gè)代表性基因，通過實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證不同處理組基因的表達(dá)水平。進(jìn)一步將所選基因的相對(duì)表達(dá)量與RNA-seq測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性分析(見圖4)?？梢钥闯?，雖然所選基因在表達(dá)變化幅度上存在一定差異，但qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與RNA-seq測(cè)序結(jié)果中基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致(R2=0.959 4)，這表明了Illumina 測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及生物信息學(xué)分析的可靠性。

圖4 花鱸腎組織RNA-seq產(chǎn)生的9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證

3 討論

作為水生動(dòng)物的重要器官，魚類腎臟主要具有維持滲透壓和離子平衡的功能，在魚類的滲透調(diào)節(jié)過程中起著重要作用[28]。研究發(fā)現(xiàn)，高堿度會(huì)使魚類腎組織發(fā)生不同程度的退化，而堿度越高腎萎縮程度越大[29]，腎功能被明顯抑制[30]。在本研究中，我們首次研究了不同堿度脅迫下花鱸腎組織的有參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探討了堿度對(duì)花鱸腎組織的影響，獲得了9 602個(gè)差異基因，富集分析后得到大量堿度脅迫相關(guān)通路以及對(duì)堿度敏感的基因，為花鱸耐堿機(jī)制研究提供了新視角。

3.1 GO富集分析

GO數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)國(guó)際化的基因功能標(biāo)準(zhǔn)分類體系，通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能[31]。本研究對(duì)花鱸腎臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GO富集分析表明，相較于對(duì)照組，堿度15 mmol/L處理組差異基因GO術(shù)語(yǔ)顯著富集于氧氣和血紅蛋白相關(guān)術(shù)語(yǔ)，說明中堿度可能主要影響腎組織氧氣的運(yùn)輸。相類似，何強(qiáng)等[32]發(fā)現(xiàn)，隨著堿度上升，瓦氏雅羅魚的耗氧率呈先下降后上升的趨勢(shì)，Lykkeboe等[33]發(fā)現(xiàn)，羅非魚(Tilapiagrahami)血紅蛋白的氧親和力隨著pH升高而降低，這些研究結(jié)果與本研究基本相一致。但高堿度對(duì)魚類的影響機(jī)制與中堿度可能有所差異。例如，Xu等[6]發(fā)現(xiàn)高堿度下瓦氏羅雅魚腎組織GO術(shù)語(yǔ)顯著富集于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和酶調(diào)節(jié)活性，高堿度導(dǎo)致腎組織跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性明顯增加。在本研究中，高堿度(30 mmol/L)對(duì)花鱸腎的影響主要集中在蛋白質(zhì)水解(水解酶活性的正調(diào)控、催化活性的正調(diào)控)和氨基酸代謝過程(絲氨酸家族氨基酸代謝過程、α-氨基酸代謝過程、細(xì)胞氨基酸代謝過程等)中，這可能表明腎組織在高堿度下能量消耗巨大，能量需求的增加導(dǎo)致腎臟蛋白質(zhì)水解和氨基酸代謝過程活躍。

3.2 KEGG富集分析

KEGG是一個(gè)集成了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的生物系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)，KEGG提供了一個(gè)參考知識(shí)庫(kù)，通過通路映射過程將基因組與生命聯(lián)系起來[34]。在本研究中，不同堿度下花鱸腎臟KEGG富集分析表明，相較于對(duì)照組，中堿度的15 mmol/L處理組對(duì)花鱸腎組織的影響主要集中在氨基酸合成與代謝相關(guān)通路(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、氨基酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等)，而高堿度(30 mmol/L)對(duì)花鱸的影響則更加廣泛，主要包括細(xì)胞有絲分裂(細(xì)胞周期、DNA復(fù)制)、免疫與疾病相關(guān)通路(例如上皮細(xì)胞的細(xì)菌侵襲、癌癥中的通路)以及代謝(葉酸一碳庫(kù))。從現(xiàn)有的研究看，Cheng等[35]發(fā)現(xiàn)，高堿度會(huì)使尼羅羅非魚肌肉中不飽和脂肪酸含量升高，Zhao等[36]發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸的生物合成通路在尼羅羅非魚肝組織AW40_vs_AW60中顯著富集。除了脂肪酸，氨基酸代謝在滲透調(diào)節(jié)中也起著關(guān)鍵作用[37]，例如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝[38-40]以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝等[41]。這些研究結(jié)果表明，脂肪酸與氨基酸的合成與代謝可能是堿度脅迫影響的關(guān)鍵通路之一。而在堿度脅迫下，奧尼羅非魚鰓組織富集通路與免疫、錯(cuò)配修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、DNA復(fù)制以及細(xì)胞周期顯著相關(guān)[14]，這與本研究結(jié)果基本一致。因此，推測(cè)高堿度可能損傷花鱸腎細(xì)胞，抑制細(xì)胞有絲分裂。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)花鱸腎中軸突導(dǎo)向和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)基因在高堿度下顯著富集，這在其他魚類相關(guān)研究中從未發(fā)現(xiàn)。已有研究表明，在腎病中腎小球軸突導(dǎo)向通路顯著富集，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架失調(diào)隨著足突消失和粘連喪失而從基底膜脫離而動(dòng)態(tài)重組[42]，說明這兩條通路的富集可能與腎組織疾病相關(guān)。相類似，Chen等[41]發(fā)現(xiàn)癌癥中的通路在鹽度和堿度脅迫下葉爾羌高原鰍(Triplophysayarkandensis)鰓中均富集，這也與本研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)花鱸腎臟癌癥中的蛋白多糖在con_vs_AW30和AW15_vs_AW30兩個(gè)基因集中均顯著富集，而該通路的富集被認(rèn)為是腎細(xì)胞癌的標(biāo)志[43]。上述結(jié)果表明，中、高堿度均會(huì)不同程度地影響花鱸免疫能力，增加了花鱸患病風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 花鱸腎組織堿度脅迫響應(yīng)關(guān)鍵基因分析

環(huán)境脅迫會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)損傷、DNA雙鏈斷裂和氧化堿修飾[44-45]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨堿度升高花鱸腎組織生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)，例如fyn、ccna2、cks1、arhgap19、melk、cenpo、pbk、map3k15、rrm1等。fyn是Src家族的成員，fyn的抑制與細(xì)胞生長(zhǎng)減少有關(guān)[46]。ccna2基因編碼細(xì)胞周期蛋白，有細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑的作用[47]。cks1在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中發(fā)揮作用，Cks1蛋白的缺失可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2期，有絲分裂受阻[48]。arhgap19的低表達(dá)水平則會(huì)影響早期有絲分裂期間的細(xì)胞形狀，導(dǎo)致嚴(yán)重的染色體分離缺陷[49]。而melk基因在細(xì)胞周期控制方面發(fā)揮著重要作用，melk的表達(dá)水平與影響細(xì)胞周期進(jìn)程[50]。cenpo基因編碼間期著絲粒復(fù)合體，其編碼的蛋白質(zhì)在整個(gè)細(xì)胞周期中定位于著絲粒，是有絲分裂期間雙極紡錘體組裝、染色體分離和檢查點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)所必需的[51]。pbk基因編碼的絲氨酸-蘇氨酸激酶在有絲分裂中活躍[52]。map3k15基因編碼MAP3K蛋白，在細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和各種疾病中起重要作用，從魚類相關(guān)研究看，三刺魚(Gasterosteusaculeatus)腎臟中MAP3K15的表達(dá)與鹽度呈顯著負(fù)相關(guān)[53]。rrm1基因編碼核糖核苷酸還原酶的大型催化亞基，對(duì)細(xì)胞周期S期的DNA復(fù)制以及多個(gè)DNA修復(fù)過程非常重要[54]。本研究發(fā)現(xiàn)上述相關(guān)基因在中高堿度下顯著下調(diào)，表明堿度嚴(yán)重抑制了腎細(xì)胞的有絲分裂。因此，堿度作為一種應(yīng)激源，可能抑制了花鱸腎細(xì)胞的有絲分裂，影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂，甚至可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

一般認(rèn)為，在鹽度脅迫下水生生物為了維持體內(nèi)平衡和滲透平衡，需要合成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶，這一過程會(huì)消耗大量能量[55]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著堿度升高，花鱸腎組織能量代謝通路相關(guān)基因(acsl、gaphd)表達(dá)顯著上調(diào)。?；o酶A合成酶(ACSL)是負(fù)責(zé)脂質(zhì)代謝初始步驟的關(guān)鍵酶[56]，gapdh基因編碼的3-磷酸甘油醛脫氫酶是能量代謝中的一種重要酶，在脊椎動(dòng)物中具有多種細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)糖酵解對(duì)于提供升高水平的 ROS 清除劑丙酮酸可能很重要[57]。我們推測(cè)隨著堿度升高，花鱸腎組織離子轉(zhuǎn)運(yùn)與免疫調(diào)節(jié)會(huì)消耗大量能量，因此導(dǎo)致能量代謝相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。

不同類型的應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致魚類免疫和抗病能力發(fā)生變化，但具體應(yīng)激反應(yīng)取決于應(yīng)激源的強(qiáng)度及其持續(xù)時(shí)間。如果應(yīng)激源是慢性和長(zhǎng)期的，免疫反應(yīng)顯示出抑制作用，魚類患病的幾率就可能增加[58]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著堿度升高，花鱸腎組織免疫相關(guān)通路基因(ceacam1、clec4m和b4galt5等)表達(dá)顯著下調(diào)。ceacam1基因編碼免疫球蛋白相關(guān)糖蛋白，在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[59]。clec4m基因編碼的C型凝集素是固有免疫系統(tǒng)中的重要模式識(shí)別受體[60]。b4galt5基因編碼β-1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，參與多種免疫細(xì)胞表型修飾、募集和遷移[61]。白細(xì)胞介素 4 誘導(dǎo)1(il4i1)編碼的分泌型 L-苯丙氨酸氧化酶是一種免疫調(diào)節(jié)劑，主要與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)[62]。crp基因編碼C-反應(yīng)蛋白，參與膽固醇結(jié)合過程，功能與宿主防御相關(guān)[63]。已有研究報(bào)道顯示，堿度會(huì)導(dǎo)致尼羅羅非魚免疫基因表達(dá)下調(diào)[36]和大鱗鲃(Luciobarbuscapito)免疫抑制[64]。本研究結(jié)果表明，中高堿度導(dǎo)致花鱸腎組織免疫能力明顯下降，可能導(dǎo)致患病風(fēng)險(xiǎn)增加。當(dāng)然，堿度下調(diào)花鱸免疫反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制尚不清晰，需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究通過高通量測(cè)序探討了花鱸腎組織轉(zhuǎn)錄組對(duì)堿度脅迫的應(yīng)答，獲得了大量堿度脅迫相關(guān)通路，并在花鱸腎組織中鑒定出49個(gè)持續(xù)變化基因。研究發(fā)現(xiàn)，中、高堿度對(duì)花鱸腎組織影響有所不同，其中，中堿度主要影響花鱸脂肪酸與氨基酸的合成與代謝，高堿度主要影響其有絲分裂過程及免疫能力。隨堿度升高，花鱸生長(zhǎng)受到抑制，能量代謝顯著增強(qiáng)，機(jī)體免疫能力下降。本研究獲得了大量花鱸腎組織與堿度脅迫相關(guān)的通路和基因，為理解水生動(dòng)物堿度適應(yīng)的分子機(jī)制提供了新見解，同時(shí)也為花鱸在南疆鹽堿水域漁業(yè)中的潛在應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。