原靜靜，孫曉琛，栗錦鵬，陳彥宏，張博洋，王惠珍

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州730000

代謝物是細(xì)胞調(diào)節(jié)過程的最終產(chǎn)物，其水平可被視為生物系統(tǒng)對(duì)遺傳或環(huán)境變化的最終反應(yīng)。生物系統(tǒng)合成的一組代謝物構(gòu)成其“代謝組”，主要是指細(xì)胞中所有低分子量代謝物（M<1 000）的集合，這些分子屬一般代謝反應(yīng)的參與者，是細(xì)胞維持生長(zhǎng)和正常功能所必需[1]。代謝組學(xué)是以高通量、高靈敏度、高分辨率等現(xiàn)代儀器分析為手段，結(jié)合生物統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理及模式識(shí)別等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，目標(biāo)是分析生物體（細(xì)胞、組織或器官）受刺激或擾動(dòng)（如藥物、基因改變或環(huán)境變化）后代謝組的變化，并探索其代謝網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)。繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后發(fā)展起來的代謝組學(xué)，可提供特定環(huán)境條件下植物表型的明確信息，上游基因、蛋白質(zhì)層面的變化能在下游諸多代謝產(chǎn)物中得到放大，并使這些變化更易被觀察到，因此能更好地解釋生物系統(tǒng)與其環(huán)境之間的相互作用及所有相關(guān)擾動(dòng)[2]，且實(shí)驗(yàn)成本較蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)低2～3倍[1]。

自然界普遍存在非生物脅迫因素，已成為制約植物生長(zhǎng)發(fā)育、影響植物產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素。代謝組學(xué)的興起為研究植物非生物脅迫下的代謝途徑變化和耐受機(jī)理提供可靠手段，已在小麥[3]、番茄[4]、玉米[5]、水稻[6]及大豆[7]等作物中得到廣泛應(yīng)用，并在一些藥用植物相關(guān)研究中逐步展開。筆者結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，梳理代謝組學(xué)在藥用植物非生物脅迫研究中進(jìn)展，為更深入探尋藥用植物非生物脅迫耐受性相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)提供參考。

1 分析技術(shù)

代謝組學(xué)能更好地了解代謝網(wǎng)絡(luò)及植物和其他生物有機(jī)體的后續(xù)生化組成，代表了生物系統(tǒng)中所有代謝物的無偏見識(shí)別和定量，因此分析技術(shù)的選擇性和靈敏度要求很高[8]。核磁共振技術(shù)（NMR）由于靈敏度和信號(hào)分辨率低，通常僅限于代謝指紋圖譜。鑒于植物代謝組中預(yù)期的物質(zhì)（如植物激素、氨基酸、低聚糖等）物理化學(xué)性質(zhì)，液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）是植物代謝組學(xué)中最常用的技術(shù)[9-12]。毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）是分離植物高極性、帶電荷的低分子量代謝物（如輔酶、胺、嘌呤堿及核苷酸等）的方法[10-11]，但在植物代謝組學(xué)中很少應(yīng)用。相較LC-MS，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）提供了更好的重現(xiàn)性和更多結(jié)構(gòu)信息[10]，但在分析非揮發(fā)性代謝物之前需進(jìn)行衍生化步驟[9，11]。因此，GC-MS 被用于測(cè)定低豐度、半揮發(fā)性植物激素或衍生化（通常是甲氧基胺化后再進(jìn)行甲硅烷基化）后的初級(jí)代謝物[9-10]。但無論何種分離技術(shù)，基于高分辨率質(zhì)譜（HRMS）的技術(shù)都是植物代謝物分析的首選方法[13]。另外，HRMS探測(cè)器（如飛行時(shí)間、傅里葉變換-離子回旋共振和Orbitrap質(zhì)譜儀）的高分辨率/高質(zhì)量精度、精確的質(zhì)量和同位素剖面測(cè)量允許推斷未知化合物的明確分子式[14-15]。

2 在藥用植物非生物脅迫中的應(yīng)用

非生物脅迫主要包括鹽脅迫、水分脅迫、溫度脅迫及輻射脅迫等[16]。這些非生物脅迫均會(huì)導(dǎo)致藥用植物體內(nèi)生理生化特性改變并造成嚴(yán)重影響，如由不同鹽水平引起的滲透脅迫和特定離子效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致水分不足、細(xì)胞毒性和生長(zhǎng)遲緩[17]；干旱情況下土壤中水分利用率降低也會(huì)影響植物的生理和代謝活動(dòng)[18-19]。當(dāng)植物面臨環(huán)境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生多種初級(jí)和次級(jí)代謝物以保護(hù)自身免受傷害。初級(jí)代謝物普遍存在于植物體內(nèi)并參與生長(zhǎng)、發(fā)育或繁殖等重要過程，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、可溶性糖等[20]。次生代謝物如萜類、黃酮、生物堿等并不直接參與上述作用，但在植物生命活動(dòng)中起著重要作用，如機(jī)體防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及抵御逆境等[21-22]。不管植物受何種脅迫，代謝組學(xué)有希望找到逆境下的潛在生物標(biāo)志物。

2.1 水分脅迫

由于全球氣候變暖而導(dǎo)致極端氣候事件增多，干旱和洪澇頻繁發(fā)生，對(duì)全球范圍內(nèi)的植物生長(zhǎng)造成威脅。在水分脅迫研究中，Dai 等[23]利用NMR 和LCDAD-MS研究丹參Salvia miltiorrhizaBunge在干旱脅迫下的代謝組變化，分析出初級(jí)代謝產(chǎn)物29個(gè)，次級(jí)代謝產(chǎn)物44個(gè)，并首次檢測(cè)到5種多酚類化合物、京尼平、傘形花內(nèi)酯等；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，干旱促使丹參酮和脯氨酸的合成加強(qiáng)，碳和氨基酸代謝發(fā)生變化，但因日照而引起的干旱促進(jìn)了莽草酸介導(dǎo)多酚類合成的代謝，而因空氣干燥引起的干旱則抑制此途徑。有報(bào)道，利用LC-MS 研究黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.在干旱脅迫下代謝組變化，與對(duì)照相比，輕度、中度和重度干旱脅迫分別鑒定出274、284和317個(gè)顯著差異代謝物，差異代謝物被注釋到京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫得到82條差異代謝通路，其中鞘脂類代謝為極顯著富集的差異代謝通路（P<0.01），精氨酸和脯氨酸代謝、色氨酸代謝、丙氨酸代謝、半乳糖代謝、煙酸及煙酰胺代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、花生四烯酸代謝、亞麻酸代謝和甘油脂類代謝為顯著富集的差異代謝通路（P<0.05），對(duì)富集前后的差異代謝物進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn)，主要集中在脂肪?；?、羧酸類及其衍生物、有機(jī)氧化物三類[24]。劉洋[25]利用GC-MS 研究膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge 和蒙古黃芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus（Bunge）P.K.Hsiao在干旱脅迫下的代謝組變化，共鑒定約196種代謝物，包含糖、酸、醇及其他化合物等，分析得出蔗糖、果糖和蘋果酸僅在蒙古黃芪葉片中作為顯著差異代謝物出現(xiàn)，蘋果酸和甘露糖僅在膜莢黃芪葉片中顯著增加，僅蒙古黃芪出現(xiàn)明顯增強(qiáng)的蔗糖和肌醇（參與滲透調(diào)節(jié)和能量代謝）積累；又利用UPLC-qTOF-MS分析28種酚類代謝物和2種關(guān)鍵化合物發(fā)現(xiàn)，在干旱進(jìn)程中，異黃酮僅在2個(gè)黃芪品種的根中表現(xiàn)出顯著增加，酚酸類物質(zhì)僅在蒙古黃芪葉片中有顯著增加，而膜莢黃芪黃酮醇類物質(zhì)含量增加。Wei等[26]利用LC-MS研究紅花Carthamus tinctoriusL.在干旱脅迫下的代謝組變化，在品種PI401477和PI560169中分別鑒定出359和209種差異代謝物，發(fā)現(xiàn)3種代謝物（半乳糖醇、新黃嘌呤和熊果苷）與這2個(gè)品種的耐旱性相關(guān)，并受不同調(diào)控。Ueno 等[27]利用GC-MS 研究薇金櫻子Mikania laevigata和薇茅Mikania glomerata在水分不足情況下的變化，薇金櫻子揮發(fā)物中大約一半的化合物增加，水分過量時(shí)與對(duì)照結(jié)果相似。增加的化合物包括：反式-2-己烯醛、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-古巴烯和β-蓽澄茄油烯。香豆素和大根香葉烯D在缺水條件下也增加，但與對(duì)照組無顯著差異。對(duì)于薇茅，反式-2-己烯醛，α-蒎烯、β-蒎烯和檸檬烯在水分虧缺下增加。Ashrafi等[28]利用NMR研究百里香Thymus vulgaris和Thymus Kotschyanus在干旱脅迫下的代謝組變化發(fā)現(xiàn)，蔗糖、葡萄糖、丙氨酸、膽堿及絲氨酸均起到滲透保護(hù)作用，表明干旱脅迫顯著影響糖、氨基酸和能量代謝，其中，三羧酸（TCA）循環(huán)中間產(chǎn)物是提供能量和碳骨架的最重要的循環(huán)，比糖和氨基酸代謝更易受干旱影響，因此，在誘導(dǎo)耐旱性方面可能具有更突出的作用。

2.2 鹽脅迫

土壤鹽堿化已成為限制植物生長(zhǎng)的最具破壞性難題之一，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大威脅。蔡芷辰等[29]利用UFLC-Triple TOF-MS/MS 分析忍冬Lonicera japonicaThunb.在鹽脅迫下的代謝組變化，經(jīng)主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），金銀花鹽脅迫組與對(duì)照組樣品得到明顯區(qū)分，篩選并鑒定出31個(gè)差異成分，對(duì)其中酚酸類、黃酮類及環(huán)烯醚萜類等15個(gè)目標(biāo)差異成分（藥效成分）進(jìn)行分析，呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律；又利用UFLC-QTRAP-MS/MS對(duì)15個(gè)目標(biāo)差異成分進(jìn)行測(cè)定，初步表明適度的鹽脅迫可促進(jìn)金銀花中藥效成分的合成與積累。劉子修[30]利用UPLC-qTOF-MS 分析夏枯草Prunella vulgarisL.在鹽脅迫下的代謝組變化，與對(duì)照組相比，50、100、150 mmol/L鹽脅迫組分別篩選出146、175和159個(gè)差異表達(dá)代謝物，上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的代謝物分別為48/97、76/99 和55/10，其中最顯著的上下調(diào)代謝物分別是3,4-二甲氧基肉桂酸、肌酸、三甲胺N-氧化物/Tyr-Leu、脫氧核糖、2'-脫氧腺苷5'-單磷酸、去甲脒酮、DL-苯丙氨酸、賴氨酸-苯丙氨酸/順-9-棕櫚烯酸、肉豆蔻酸、別嘌呤醇核苷、吡哆胺、氧化三甲胺、N-α-乙酰-L-精氨酸/3,4-亞甲基二氧亞甲基苯丙胺、L-巖藻糖-1-磷酸和酮亮氨酸；進(jìn)一步代謝物鑒定和代謝通路綜合分析表明，在鹽脅迫下，差異代謝物主要富集在丙氨酸、天冬氨酸谷氨酸代謝、苯丙氨酸代謝及嘌呤代謝等生物通路。Wang 等[31]利用LC-TOF-MS 分析蓖麻Ricinus communisL.在鹽脅迫下的代謝組變化，PCA 結(jié)果表明，鹽脅迫下子葉和根中的代謝產(chǎn)物差異很大，子葉有38種差異代謝物，主要包括脂肪酸、核酸和有機(jī)酸，而根中只有19種差異代謝物，主要包括脂肪酸和有機(jī)酸。此外，KEGG通路富集分析表明，黃酮和黃酮醇、泛酸和輔酶A、檸檬酸循環(huán)和類胡蘿卜素生物合成是這2個(gè)器官在鹽脅迫下的共同代謝途徑。鹽脅迫主要通過碳、氮代謝引起代謝過程改變，增加根向子葉的碳分配。此外，氨基酸和核酸譜的變化僅在子葉中發(fā)現(xiàn)，而根可以增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧的活性。

2.3 紫外線-B脅迫

吳可心[32]利用UPLC-MS分析刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms在紫外線-B（UV-B）脅迫下的代謝組變化，UV-B輻射后刺五加皂苷表現(xiàn)較強(qiáng)的組織特異性，主要表現(xiàn)在上位葉中；中度脅迫顯著提升各位葉中齊墩果酸的含量，以及上、下位葉中異嗪皮啶和金絲桃苷的含量；重度脅迫下各位葉中異嗪皮啶和金絲桃苷含量均上升，但齊墩果酸含量下降。又利用UPLC-qTOF-MS測(cè)定葉片中14種酚類化合物，包括酚類化合物合成前體（L-苯丙氨酸）、4種C6C1型化合物（丁香酸、水楊酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸）、6種C6C3型化合物（對(duì)羥基肉桂酸、染料木素、咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸、對(duì)香豆酸）、3種C6C3C6型化合物（槲皮素、山柰酚、蘆丁）。UV-B輻射后上位葉中酚類化合物合成前體物質(zhì)積累量升高，且隨葉位遞增；中度脅迫下，C6C1型化合物在各位葉的積累量均呈上升趨勢(shì)。UV-B脅迫后，C6C3型化合物積累量整體呈下降趨勢(shì)，而黃酮類（C6C3C6型）化合物積累量普遍升高，且山柰酚最為明顯。

劉洋[25]利用GC-MS 研究膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge 和蒙古黃芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus（Bunge）P.K.Hsiao在UV-B脅迫下的代謝組變化，共鑒定出144種代謝物，包括2種黃芪根和葉組織中共79種差異顯著的化合物。其中，蒙古黃芪葉組織中顯著增加的化合物中有2種是糖類化合物，根組織有4種糖及2種糖苷化合物；相似的，在膜莢黃芪葉組織中顯著增加的化合物中沒有糖類，而根組織有5種糖類化合物。作為能量來源的糖，在地上組織中減少，而地下組織中增加。這意味著UV-B脅迫促使2種黃芪的生長(zhǎng)能量均顯示出向地下組織轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)。又利用UPLC-qTOF-MS分析28種酚類代謝物和1種關(guān)鍵化合物。在UV-B輻射增強(qiáng)條件下，蒙古黃芪和膜莢黃芪的根和葉片中大部分C6C1碳骨架的酚類化合物都表現(xiàn)出減少趨勢(shì)。不同的是，蒙古黃芪中C6C3碳骨架的酚類化合物在UV-B輻射脅迫下均有所減少，而C6C3C6碳骨架酚化合物大部分有所增加；與此相反，在膜莢黃芪中，C6C3碳骨架酚化合物在UV-B輻射脅迫下有所增加，而C6C3C6碳骨架酚化合物大部分有所減少。鑒于C6C3C6碳骨架化合物比C6C3碳骨架化合物更優(yōu)秀的UV-B輻射吸收能力，蒙古黃芪這種以C6C3碳骨架化合物為代價(jià)的C6C3C6碳骨架化合物的增加，可能會(huì)帶來更好的UV-B輻射防御能力。

楊丙賢[33]利用GC-MS 分析圓錐鐵線蓮Clematis ternifloraDC.在UV-B脅迫下的代謝組變化，共鑒定113個(gè)代謝物，其中62個(gè)差異響應(yīng)了高強(qiáng)度UV-B輻射和黑暗脅迫；通過對(duì)代謝物的分析，推斷圓錐鐵線蓮在脅迫下氨基酸代謝和有機(jī)酸代謝是增強(qiáng)的，而碳水化合物的代謝顯著堿弱，表明葉片在脅迫逆境下，其光合作用和呼吸作用的減弱及次生代謝增強(qiáng)。又利用UPLC-MS/MS分析鑒定了160個(gè)代謝物，并利用NMR技術(shù)對(duì)其中7個(gè)代謝物進(jìn)行結(jié)果確證，結(jié)果有38個(gè)次生代謝物含量發(fā)生顯著變化，其中19個(gè)次生代謝物響應(yīng)脅迫處理而被特異合成，這些代謝物主要屬于脂肪酸類、內(nèi)酯類、多酚類、苯甲酸類、香豆素類及芪類。而聚類分析顯示，香豆素是顯著變化的次生代謝物的主要成分。

2.4 其他脅迫

除上述脅迫外，植物還常受其他逆境的脅迫，如冷脅迫、凍融脅迫、多重脅迫等。Rastogi 等[34]利用GC-MS研究圣羅勒Ocimum tenuiflorum冷脅迫下代謝組變化發(fā)現(xiàn)，苯丙素類化合物（丁香酚和甲基丁香酚）含量均有下降；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，苯丙素類化合物合成途徑相關(guān)基因PAL、C4H、4CL表達(dá)下調(diào)是導(dǎo)致丁香酚和甲基丁香酚含量降低的主要原因。Shi等[35]利用NMR 和LC-MS 研究決明Senna tora（Linnaeus）Roxburgh在凍融下的代謝組變化，并對(duì)108種代謝物進(jìn)行相對(duì)定量分析。在第3個(gè)循環(huán)后，凍融誘導(dǎo)的影響程度較小。連續(xù)5次凍融循環(huán)后，水蘇糖、蔗糖、去甲紅霉素-6-O-β-d-吡喃葡萄糖苷、槲皮素3-(3''-乙酰半乳糖苷)含量降低，而苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、甘露糖、葡萄糖酸和纈氨酸含量升高。

管仁偉等[36]利用UPLC-QTOF-MS 研究黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi在干旱及鹽脅迫下的代謝組變化，分析鑒定出44個(gè)黃酮類成分，差異代謝物共篩選出18個(gè)黃酮類成分；且主要黃酮類代謝產(chǎn)物相對(duì)定量值隨干旱及鹽脅迫程度增強(qiáng)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。由此得出干旱及鹽脅迫會(huì)引起黃芩黃酮類成分含量和差異成分種類的改變，適度干旱脅迫可促進(jìn)黃芩黃酮類成分的合成積累，但程度有限。

3 展望

代謝組學(xué)拓展了對(duì)植物耐受非生物脅迫分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)，能檢測(cè)大部分脅迫響應(yīng)的代謝物質(zhì)，目前已有通過代謝組學(xué)找出差異代謝物，并通過外源施加方式作用于植物的逆境研究，如丙二酸浸泡小麥種子[37]，紫花苜蓿葉面噴施外源5氨基乙酰丙酸[38]可提高抗旱能力，長(zhǎng)春花外源施加海藻糖[39]可促進(jìn)拮抗低溫脅迫，外源表沒食子兒茶素沒食子酸酯可緩解鹽脅迫對(duì)番茄種子的抑制作用和緩解低溫、高溫和干旱等非生物脅迫對(duì)幼苗造成傷害[40]，外源褪黑素可緩解鹽脅迫對(duì)棉花種子的抑制作用[41]等，這些生物標(biāo)志物可提高植物逆境下的生存能力。而藥用植物方面的研究多數(shù)僅限于差異代謝物的鑒定和篩選等，因此下一步可將篩選的功能代謝物通過外源加入方式進(jìn)行驗(yàn)證，并通過生理生化特性、轉(zhuǎn)錄水平等變化解析外源代謝物的作用機(jī)理，以輔助培育耐旱、耐鹽等藥用植物品種。