楊光輝，梁明雪，吳禮高，承澤農(nóng)，龔曉萌，胡俊鋒

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，目前在全球范圍內(nèi)其致死率是各類癌癥之首。肺癌死亡率在我國男性、女性惡性腫瘤中均為第1位，僅有19%的肺癌病人在確診后存活5年或更長時(shí)間[1]。根據(jù)組織學(xué)不同，肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC高達(dá)所確診肺癌的85%左右[2]。目前臨床上針對(duì)肺癌的治療手段主要以手術(shù)、化療及放療為主，但大部分肺癌病人確診時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)[3]。因此,探討與NSCLC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的可能機(jī)制對(duì)肺癌的預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)、診斷、干預(yù)及預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床價(jià)值。

腫瘤相關(guān)性炎癥已成為腫瘤的主要生物學(xué)特征之一。炎性小體被稱為炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，是由模式識(shí)別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合物，可識(shí)別病原體相關(guān)分子模式或宿主來源的損傷相關(guān)分子模式，在細(xì)胞受到外界信號(hào)刺激或感染時(shí)，特定炎性小體招募激活caspase-1，并促進(jìn)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18的分泌，引起DNA損傷，最終使細(xì)胞發(fā)生滲透性崩解，誘發(fā)細(xì)胞焦亡，加劇炎性疾病的發(fā)展。慢性炎癥可改變肺和支氣管的微環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致肺癌的發(fā)生。有報(bào)道[4]稱，肺癌微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了高水平的炎性細(xì)胞，提示肺癌的危險(xiǎn)因素與氧化應(yīng)激標(biāo)志物、免疫細(xì)胞組成的改變和炎癥細(xì)胞因子水平有著密切關(guān)系。以上研究提示，炎性小體參與肺癌的發(fā)生，對(duì)其機(jī)制的探討可能有利于肺癌的早期診斷及預(yù)后判斷。黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)最早于1997年在人黑素瘤中被發(fā)現(xiàn)，是炎性小體家族成員中較為重要的一員，因能被多種信號(hào)激活而被廣泛研究。AIM2炎性小體是一種細(xì)胞內(nèi)的DNA感受器，當(dāng)機(jī)體受到DNA病毒或細(xì)菌感染時(shí)，可以識(shí)別釋放到細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈DNA，進(jìn)而激活下游相關(guān)的多種效應(yīng)蛋白[5-6]。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)AIM2炎性小體及其下游IL-1β、IL-18蛋白在早期NSCLC和癌旁組織中的表達(dá)，分析其在早期NSCLC發(fā)病中的可能機(jī)制，并探討NSCLC癌組織中各蛋白表達(dá)水平間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年1月至2020年10月就診我院行手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的57例早期NSCLC癌組織及癌旁組織石蠟標(biāo)本。其中腺癌(adenocarcinoma，ADC)33例，鱗癌(squamous cell carcinoma，SCC)24例；男29例，女28例；>60歲31例，≤60歲26例；腫瘤直徑>3～5 cm 27例，≤3 cm 30例；腫瘤高中分化23例，低分化34例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病人經(jīng)病理學(xué)診斷明確為肺腺癌或肺鱗癌且臨床資料完整；(2)TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期病人；(3)確診前均未接受過任何形式治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)組織學(xué)類型為肺腺癌及鱗癌以外的肺癌病人；(2)自身免疫性疾病病人；(3)感染性疾病病人。

1.2 試劑 AIM2多克隆抗體(貨號(hào)20590-1-AP)購至美國Proteintech公司；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)(貨號(hào)DF6304)、caspase-1(貨號(hào)AF5418)、IL-1β(貨號(hào)AF5103)和IL-18多克隆抗體(貨號(hào)DF6252)均為美國Affinity Biosciences公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學(xué)法 將組織標(biāo)本連續(xù)切片烘烤干燥，脫蠟后放入不同濃度梯度乙醇中。用PBS沖洗使切片水化，將切片完全浸入修復(fù)液中，加熱至沸騰，停止加熱冷卻至室溫，使用PBS洗滌3次。將3%過氧化氫加入切片中，避光孵育后使用PBS沖洗。將切片放置于濕化孵育盒中，封閉游離結(jié)合位點(diǎn)。倒去封閉液，每張切片加入待檢測(cè)抗原對(duì)應(yīng)的一抗[稀釋比例：AIM2(1∶200)、ASC(1∶50)、caspase-1(1∶100)、IL-18(1∶200)、IL-1β(1∶200),均在4 ℃避光過夜孵育12 h]，次日滴加酶標(biāo)二抗封閉。PBS沖洗，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染后蒸餾水沖洗終止染色。將玻片脫水，取出后風(fēng)干，中性樹脂封片膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

本研究判定標(biāo)準(zhǔn)參考FENG等[7]采用的計(jì)分法，由陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)共同決定，將兩項(xiàng)得分相乘得出染色強(qiáng)度得分，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：-(0分)，+(1～3分)，2+(4～8分)，3+(9～12分)。染色強(qiáng)度得分<4分計(jì)陰性，≥4分計(jì)陽性。用%表示各種蛋白在不同肺癌組織及癌旁組織中的陽性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和Spearman秩和相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 AIM2炎性小體組分及下游IL-1β、IL-18蛋白在NSCLC癌組織和癌旁組織的表達(dá) AIM2、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中(見圖1)。NSCLC癌組織中AIM2、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18的陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織(P<0.01)(見表1)。

表1 AIM2炎性小體組分及下游IL-1β、IL-18蛋白在NSCLC癌組織和癌旁組織的表達(dá)[n；百分率(%)]

2.2 AIM2炎性小體組分、IL-1β及IL-18與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 AIM2、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18在ADC中的陽性表達(dá)率均高于SCC(P<0.05～P<0.01)；在低分化、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC中的陽性表達(dá)率均分別高于高中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC(P<0.05～P<0.01)；不同性別、年齡、腫瘤直徑NSCLC中AIM2、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2.3 AIM2炎性小體組分、IL-1β、IL-18在NSCLC癌組織中表達(dá)水平的相關(guān)性 在NSCLC癌組織中，AIM2的表達(dá)水平與ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05～P<0.01)；ASC的表達(dá)水平與caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05～P<0.01)；caspase-1的表達(dá)水平與IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01和P<0.05)(見表3)。

表2 AIM2炎性小體組分、IL-1β及IL-18與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n；百分率(%)]

續(xù)表2

表3 NSCLC癌組織中AIM2炎性小體組分、IL-1β、IL-18的表達(dá)相關(guān)性(r)

3 討論

隨著診斷方法進(jìn)步、新化療藥物以及靶向藥物出現(xiàn)，肺癌病人生存率有所提高。然而要大幅度提高生存率，仍有賴于癌癥的早期診斷和規(guī)范治療，這是取得良好預(yù)后非常重要的前提。深入探討肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋求肺癌發(fā)生關(guān)鍵因素，靶向關(guān)鍵指標(biāo)開展藥物研發(fā)具有重要的意義。

炎性小體是由模式識(shí)別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合物，主要存在于髓樣細(xì)胞中，可識(shí)別宿主來源的損傷相關(guān)分子模式或病原體相關(guān)分子模式。目前已發(fā)現(xiàn)的炎性小體可分為AIM2樣受體家族的AIM2、IFI16、pyrin炎性小體和NOD樣受體家族的NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、NLRP12炎性小體等。AIM2炎性小體是炎性小體家族中較為重要成員之一，同時(shí)也是干擾素誘導(dǎo)的HIN-200蛋白家族中唯一能識(shí)別DNA并形成炎性小體從而激活caspase-1的一員，對(duì)外來細(xì)菌和病毒均有防御殺傷作用，具有免疫功能。當(dāng)細(xì)菌、DNA病毒入侵細(xì)胞或細(xì)胞受到創(chuàng)傷引起核DNA泄漏到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，雙鏈DNA可以進(jìn)入胞質(zhì)[8]；同時(shí)AIM2炎性小體通過其羧基端帶正電荷的HIN-200結(jié)構(gòu)域以非序列特異性的方式通過靜電相互作用，與雙鏈DNA的糖-磷酸骨架作用并識(shí)別雙鏈DNA后，AIM2發(fā)生構(gòu)象變化，與ASC結(jié)合并誘導(dǎo)ASC二聚體化，ASC的CARD結(jié)構(gòu)域會(huì)與pro-caspase-l的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成AIM2炎性小體(AIM2-ASC-pro-caspase-1)。隨后促進(jìn)caspase-1的活化，caspase-1將pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟，觸發(fā)細(xì)胞焦亡，IL-1β和pro-IL-18分泌到細(xì)胞外，促進(jìn)炎癥反應(yīng)加劇發(fā)生。文獻(xiàn)[9]報(bào)道，IL-1β被認(rèn)為是NSCLC中的一種致癌細(xì)胞因子，與健康對(duì)照者相比，NSCLC病人血清中的IL-1β水平明顯升高，IL-1β處理后可顯著增強(qiáng)H460和H1299細(xì)胞增殖和遷移，并猜測(cè)IL-1β可通過COX2-HIF 1ɑ途徑促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移。并且有研究[10]表明，NSCLC病人血清中IL-18的水平較健康對(duì)照者血清中IL-18的水平顯著增加。研究[11]表明，AIM2炎性小體參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，在腫瘤的發(fā)展中有著雙重作用。AIM2炎性小體表達(dá)在結(jié)直腸癌[12]、乳腺癌[13]、肝癌[14]等癌癥中均有不同程度的下降，因此AIM2炎性小體被認(rèn)為是一種抑癌基因；但AIM2炎性小體在皮膚鱗癌[15]、口腔鱗癌[16]發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮致癌作用。AIM2在肺癌中的表達(dá)報(bào)道較少，其可能作用機(jī)制目前尚不清楚。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ期NSCLC癌組織及癌旁組織中AIM2炎性小體組分及其下游細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果顯示，AIM2炎性小體組分及下游細(xì)胞因子在早期NSCLC癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，與ZHANG等[11]研究相一致。通過對(duì)臨床病理參數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，ADC組織中AIM2、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平高于SCC，提示NSCLC組織中AIM2炎性小體的表達(dá)可能與肺癌組織學(xué)類型密切相關(guān)，這可能是因?yàn)椴煌愋偷姆伟┘?xì)胞起源不一致，并且在不同的肺癌細(xì)胞中由于組織受體的分布不相同，導(dǎo)致AIM2炎性小體的表達(dá)可能會(huì)存在著差異。

同時(shí)本研究結(jié)果表明，AIM2炎性小體及下游細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的表達(dá)與早期肺癌分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。低分化及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，其表達(dá)水平上調(diào)。ZHANG等[11]報(bào)道，AIM2是以炎癥依賴的方式作為致癌基因發(fā)揮作用的，并可能提供一種治療NSCLC的潛在靶點(diǎn)，并且還推測(cè)AIM2通過AIM2炎性小體/IL-1β/STAT 3信號(hào)通路，建立連接AIM2炎性小體和NSCLC的反饋機(jī)制。但QI等[17]研究提示AIM2炎性小體通過調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)促進(jìn)NSCLC發(fā)展，并非通過炎癥依賴性途徑進(jìn)行。本研究進(jìn)一步分析各蛋白之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，AIM2炎性小體組分AIM2、ASC、caspase-1及IL-1β、IL-18蛋白之間的表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)出一致性，并存在正相關(guān)關(guān)系，這表明AIM2炎性小體可能是以AIM2/ASC/caspase-1/IL-1β及IL-18通路參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。KONG等[18]研究發(fā)現(xiàn)AIM2在兩個(gè)不同的NSCLC細(xì)胞系中的蛋白和mRNA表達(dá)水平均高于正常肺支氣管上皮細(xì)胞系，并且AIM2蛋白在A549細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于H460細(xì)胞；進(jìn)一步分析顯示包含ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18在內(nèi)的炎癥組分的表達(dá)水平在NSCLC中較正常肺支氣管上皮細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。

綜上所述，早期NSCLC癌組織中AIM2炎性小體組分AIM2、ASC、caspase-1及IL-1β、IL-18表達(dá)均上調(diào)，且腺癌中AIM2炎性小體的表達(dá)高于鱗癌，其表達(dá)水平與其腫瘤分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。AIM2炎性小體可能成為預(yù)測(cè)早期NSCLC進(jìn)展和預(yù)后判斷的一個(gè)潛在分子標(biāo)志物，并且為調(diào)控NSCLC相關(guān)性炎癥的免疫調(diào)節(jié)治療提供新的靶點(diǎn)。本研究僅采用免疫組織化學(xué)法從組織學(xué)角度分析了AIM2炎性小體和NSCLC的可能聯(lián)系，下一步還需要采用干預(yù)手段減少AIM2炎癥小體在相關(guān)肺癌細(xì)胞株或裸鼠模型上的表達(dá)，進(jìn)行相關(guān)機(jī)制探討，以明確AIM2炎癥小體在NSCLC發(fā)生和發(fā)展中的作用。