熟黨參中5-羥甲基糠醛提取工藝優(yōu)選

呂立銘，高 娟，李大煒，侯秋苑

（1.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術學院，廣東 惠州 516025；2.惠州市藥用植物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 惠州 516025）

黨參又稱上黨人參，是臨床常用的一味補益類中藥，也是藥食同源性食材。來源于桔?？浦参稂h參、素花黨參或川黨參的干燥根，其味性甘平，主入足太陰脾經、手太陰肺經，功效為補中益氣，養(yǎng)血生津，臨床用于治療脾肺虛弱，食少便溏，咳嗽氣喘，氣血兩虧，氣短心悸，津傷口渴，內熱消渴等癥狀[1]。黨參含有多種化學成分，諸如糖類[2-4]、炔類[2，3，5]、黃酮類[2，3，6]、生物堿類[2，3，7]、萜類[2，3，8]和木質素類[2，3，9，10]等。傳統(tǒng)習慣認為黨參以味甜者為佳，究其原因主要是黨參含有大量單糖、低聚糖等小分子糖，如蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖等[2，3，11]。上述小分子糖類成分，在炮制加工和儲存等過程中，都不可避免地發(fā)生美拉德反應和糖的熱降解反應（還原糖的分解及蔗糖的焦化）而產生5-羥甲基糠醛[12-13]。

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，簡稱5-HMF），是由小分子糖在高溫或弱酸等特殊環(huán)境下脫水產生的一種具有呋喃環(huán)結構的糠醛類小分子化合物，是中藥常見的成分之一，也廣泛存在于水果、面包、蛋糕及乳制品等食品中[12-13]。根據文獻報道[13-15]，5-HMF對人體具有多種藥理作用?？寡趸钚訹16-17]、抗心肌缺血作用[18-19]、改善血液流變學[20-21]，同時，5-羥甲基糠醛對人體具有一定的毒副作用，當含量超過一定限度時，就會對人體產生危害，過量的5-羥甲基糠醛會損害人體橫紋肌、內臟、基因和神經等，對眼睛、皮膚、上呼吸道及黏膜有刺激作用[11，13，22，23]，是一種具有潛在安全隱患的內源性污染物，常被作為注射液中的有害物質加以含量控制[24]。因此，控制中藥中5-羥甲基糠醛的含量至關重要。黨參經過清蒸加工成熟黨參后，口感更加香甜，顏色加深，5-羥甲基糠醛含量急劇增加。然而，關于熟黨參中5-羥甲基糠醛的提取工藝研究尚未見報道。本文以5-羥甲基糠醛含量為評價指標，采用高效液相色譜法，優(yōu)選熟黨參中5-羥甲基糠醛的提取工藝，為今后黨參藥材的質量控制和安全性研究奠定理論基礎。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，美國），資生堂反相色譜柱Capcell pak C18色譜柱（資生堂公司，日本，型號4.6 mm×250 mm，5 μm），HH-8數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠，中國），BPG-9204A電熱式鼓風干燥箱（上海市百典儀器設備有限公司，中國），超聲清洗機PS-40A（廣東省深圳市科潔超聲科技有限公司，中國），電子天平FA2004N（上海市菁海儀器有限公司，中國）。

1.2 藥材與試劑

黨參藥材（采購于山西省晉城市陵川縣六泉鄉(xiāng)，藥材經廣東省惠州衛(wèi)生職業(yè)技術學院中藥教研室祁銀德教授鑒定為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosμla（Franch.）Nannf.的干燥根，其性狀符合《中華人民共和國藥典（2020年版）》一部的規(guī)定，5-羥甲基糠醛對照品（GC≥98%，批號：20170519，上海市金穗生物科技有限公司，中國），甲醇（分析純，廣東省汕頭市西隴科學股份有限公司，中國），乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，中國）。

2 方法

2.1 熟黨參樣品的制備

取生黨參飲片，置蒸制容器內，隔水蒸至有香甜味時取出，干燥，得到熟黨參樣品[25]。

2.2 高效液相色譜法測定5-羥甲基糠醛的含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱：資生堂反相色譜柱Capcell pak C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：V乙腈∶V水=5∶95；流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：常溫25℃。

2.2.2 5-羥甲基糠醛對照品溶液的制備

準確稱取對照品2.8 mg，精密吸取100 mL甲醇，溶解，搖勻，備用。

2.2.3 5-羥甲基糠醛標準曲線的繪制

按“2.2.1”項色譜條件，分別精密吸取對照品溶液0.5、1、2、4、8、10 μL注入AgiLent 1260高效液相色譜儀進樣檢測。以5-羥甲基糠醛的進樣量（x，mg）為橫坐標，峰面積的積分值（y）為縱坐標進行回歸，計算回歸方程并繪制標準曲線。

2.3 單因素試驗法

2.3.1 提取方法的優(yōu)選

參考文獻[26-28]，5-羥甲基糠醛的提取方法主要有超聲波提取法、加熱回流提取法和浸漬法。以5-羥甲基糠醛的含量為指標，對超聲波提取法、加熱回流提取法和冷浸法進行考察，優(yōu)選提取方法。

超聲波提取法：準確稱取熟黨參粉末（過二號篩）0.50 g，精密吸取甲醇50.0 mL，準確稱定重量，常溫25℃浸泡0.5 h后，超聲0.5 h；待冷卻后，再次稱定重量，用甲醇補足減失溶劑的重量，濾過。濾渣精密加入甲醇50.0 mL，準確稱定重量，常溫25℃浸泡0.5 h后，超聲0.5 h，待冷卻后，再次稱定重量，用甲醇補足減失溶劑的重量，濾過，合并2次濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取中間續(xù)濾液備用。

加熱回流提取法：準確稱取熟黨參粉末（過二號篩）0.50 g，精密吸取甲醇50.0 mL，準確稱定重量，70℃條件下加熱回流0.5 h后，待冷卻，再次稱定重量；用甲醇補足減失溶劑的重量，濾過，濾渣再精密加入甲醇50.0 mL，準確稱定重量，70℃條件下加熱回流0.5 h后，待冷卻，再次稱定重量；用甲醇補足減失溶劑的重量，濾過，合并2次濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取中間續(xù)濾液備用。

浸漬法：準確稱取熟黨參粉末（過二號篩）0.50 g，精密吸取甲醇100.0 mL，密塞，準確稱定重量，常溫25℃浸泡24 h后，再次稱定重量，用甲醇補足減失溶劑的重量，濾過，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取中間續(xù)濾液備用。

不同提取方法5-羥甲基糠醛含量的比較。取上述3種供試品提取液，按“2.1.1”項色譜條件，精密吸取10 μL注入AgiLent 1 260高效液相色譜儀測定，計算各樣品中5-羥甲基糠醛含量。

2.3.2 提取溶劑的優(yōu)選

準確稱取熟黨參粉末（過二號篩）0.50 g，分別以甲醇、無水乙醇、水為提取溶劑，按照液固比100∶1（mL∶g），常溫25℃超聲波提取2次，每次提取時間為0.5 h進行試驗。準確稱定提取前后重量，用提取溶劑補足減失的重量，濾過，合并2次濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過。取上述3種提取液的中間續(xù)濾液，按“2.1.1”項色譜條件，精密吸取10 μL注入AgiLent 1260高效液相色譜儀測定，計算不同提取溶劑中5-羥甲基糠醛含量。

2.4 多因素正交試驗

參考文獻[8-10]，選擇對5-羥甲基糠醛提取影響較大的3個因素，即液固比（A）、提取次數（B）及提取時間（C）作為考察對象，每個因素選擇3個水平，以5-羥甲基糠醛的含量為指標，按3因素3水平設計L9（34）正交試驗，各因素水平見表1。

表1 L9（34）因素水平表

3 結果

3.1 高效液相色譜法測定5-羥甲基糠醛的含量

5-羥甲基糠醛對照品的高效液相色譜圖如圖1所示。經計算得知，5-羥甲基糠醛的進樣量（x，mg）和峰面積積分值（y）呈線性關系。其回歸方程為y=5 323.8x-6.648 6，R2=0.999 9，其中x為5-羥甲基糠醛進樣量，y為峰面積積分值，R為相關因子。結果表明5-羥甲基糠醛進樣量在0.014～0.28 μg，其進樣量（x，mg）和峰面積積分值（y）呈良好線性關系。

圖1 5-羥甲基糠醛對照品高效液相色譜圖

3.2 單因素試驗

3.2.1 提取方法的確定

對比5-羥甲基糠醛標準曲線，根據回歸方程計算各樣品中5-羥甲基糠醛的含量。結果表明采用超聲波提取法，測得5-羥甲基糠醛含量最高，提取效果最好，且該方法簡單方便，安全性高，因此選擇超聲波提取法作為5-羥甲基糠醛的提取方法。不同提取方法5-羥甲基糠醛含量見表2。

表2 不同提取方法5-羥甲基糠醛含量（n=3）

3.2.2 提取溶劑的確定

對比5-羥甲基糠醛標準曲線，根據回歸方程計算各樣品中5-羥甲基糠醛的含量。結果表明，采用甲醇作為提取溶劑，測得5-羥甲基糠醛含量最高，提取效果最好，因此選擇甲醇作為5-羥甲基糠醛的提取溶劑。不同提取溶劑5-羥甲基糠醛含量見表3。

表3 不同提取溶劑5-羥甲基糠醛含量（n=3）

3.3 多因素正交試驗

由表4可見，因素A（液固比）對5-羥甲基糠醛提取效果影響最大，以后依次為因素B（提取次數）、因素C（提取時間）。提取條件的最優(yōu)組合為A2B1C2。但是考慮5-羥甲基糠醛自身性質，兼顧試驗效率，選擇提取工藝條件為A2B1C1，即液固比100∶1（mL∶g），提取1次，每次提取0.5 h。

表4 正交試驗結果與分析

3.4 驗證實驗

取同一批次熟黨參樣品3份，根據上述所選工藝，即采用超聲波提取法，以甲醇為提取溶劑，液固比100∶1（mL∶g），提取2次，每次0.5 h進行提取，提取液按“2.2.1”色譜條件，分別精密吸取10 μL注入Ag－iLent 1260高效液相色譜儀測定，測得5-羥甲基糠醛含量分別為4.92、4.98、4.86，平均值為4.92，證實提取效果好，并且具有良好的重復性和較高的準確率，表明所篩選的提取工藝條件基本穩(wěn)定，可作為熟黨參中5-羥甲基糠醛的提取方法。熟黨參樣品中5-羥甲基糠醛高效液相色譜圖如圖2所示。

圖2 熟黨參樣品中5-羥甲基糠醛高效液相色譜圖

4 討論

由于5-羥甲基糠醛自身的光、熱等穩(wěn)定性差，需低溫避光保存，同時，5-羥甲基糠醛在與空氣接觸的過程中，醛基不穩(wěn)定，易被氧化，且其吸濕性極強，暴露在空氣中1 min內即會吸水變成溶液。而5-羥甲基糠醛的水溶液穩(wěn)定性也很差，會進一步反應生成乙酰丙酸和甲酸，故5-羥甲基糠醛提取溫度不宜過高，時間不宜過長，提取次數不宜過多。

本實驗通過單因素試驗和多因素正交試驗優(yōu)選熟黨參中5-羥甲基糠醛的提取工藝，確定最佳提取工藝。即采用超聲提取法，以甲醇為提取溶劑，液固比100∶1（mL∶g），提取1次，每次0.5 h，優(yōu)選得到的5-羥甲基糠醛提取工藝簡便易行，穩(wěn)定性好，結果準確可靠，為后期熟黨參中5-羥甲基糠醛的進一步研究奠定基礎。