藥用植物黃芩的生物學(xué)研究進(jìn)展及展望

鄭敏敏 柳潔 趙清

（1.上海辰山植物園 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心辰山科學(xué)研究中心 上海市資源植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201602；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）為唇形科黃芩屬多年生草本植物，具披針或線性披針形葉，根莖肉質(zhì)，花紫色或藍(lán)色（圖1），原產(chǎn)于中國(guó)、俄羅斯東部、蒙古、朝鮮、日本等地［1-2］。植物黃芩的干燥根即是傳統(tǒng)中藥里的“黃芩”，在中國(guó)具有悠久的藥用歷史，最早記載“黃芩”藥用的書(shū)籍是漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》，主治肺和肝臟的疾?。?］。東漢時(shí)期，張仲景的《傷寒雜病論》中也記載了含有“黃芩”的多個(gè)復(fù)方湯劑（表1），用于治療風(fēng)寒、頭疼、發(fā)熱、腹瀉等疾?。?］。明代的醫(yī)學(xué)著作《本草綱目》中也記載“黃芩”具有清熱燥濕、瀉火解毒、消炎、止血安胎以及健脾胃等作用，可用于治療腹瀉、腹痛、出血、炎癥和呼吸道感染等疾病［5-6］。

圖1 黃芩植株、黃芩的根和黃芩藥材Fig. 1 S. baicalensis plant, S. baicalensis root and S. baicalensis as medicinal material

表1 《傷寒雜病論》里含有黃芩的復(fù)方湯劑Table 1 Compound decoctions in “Treatise on Febrile and Miscellaneous Diseases” containing S. baicalensis

1 黃芩的化學(xué)成分

隨著提取和分離技術(shù)的發(fā)展，迄今為止，已從黃芩植物中分離出132 種化合物，這些化合物大多從根中分離得到。根據(jù)結(jié)構(gòu)劃分，化合物主要類(lèi)型包括類(lèi)黃酮化合物、苯乙醇苷、固醇類(lèi)、萜類(lèi)、酰胺以及酚類(lèi)化合物，其中黃酮及其苷類(lèi)化合物占絕大部分。132 種化合物中游離的類(lèi)黃酮化合物有56種，包括42 種黃酮、3 種黃酮醇、9 種黃烷酮、1種查耳酮和1 種雙黃酮，其中黃芩素、漢黃芩素的含量最高（圖2-a，2-c）；黃酮苷類(lèi)有44 種，其中黃芩苷的含量最高，其次為漢黃芩苷（圖2-b，2-d）；此外，還含有8 種苯乙醇苷、3 種固醇、1 種二萜、5 種酰胺、9 種酚類(lèi)化合物以及6 種多糖［7-8］。

圖2 黃芩中主要活性黃酮的結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structures of main active flavones in S. baicalensis

黃芩中的黃酮化合物結(jié)構(gòu)特殊，除常見(jiàn)的C-5和C-7 位被取代基取代以外，C-6 和C-8 位上也會(huì)被羥基取代，或C-8 位被甲氧基取代，這在其他植物中是很少見(jiàn)的。此外，黃芩植物中黃酮苷化合物的糖苷類(lèi)型可分為O-葡萄糖苷、O-葡萄糖醛酸苷以及C-葡萄糖苷，大部分O-葡萄糖苷在7-OH 或2′-OH 上糖基化，作為糖基，葡萄糖醛酸苷不像葡萄糖苷普遍，但在黃芩中，至少存在17 種葡萄糖醛酸苷，且普遍在7-OH 上糖基化，少數(shù)在8-OH 和2′-OH 上［8］。

近幾十年來(lái)，大量臨床和藥理研究表明，黃酮化合物是黃芩的主要生物活性物質(zhì)，尤其是根部的

2 黃芩中的藥用活性物質(zhì)及藥理研究

黃芩素、漢黃芩素及其苷類(lèi)，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、護(hù)肝及神經(jīng)保護(hù)等藥理活性［6］。

2.1 抗腫瘤活性

黃芩素、漢黃芩素及其苷類(lèi)具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌等多種癌癥都具有抑制效果，其主要機(jī)制是通過(guò)阻斷癌細(xì)胞的增殖，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、激活癌細(xì)胞衰老凋亡或者誘導(dǎo)機(jī)體自噬［9-12］。腫瘤的發(fā)生、擴(kuò)散和對(duì)治療產(chǎn)生的抗性與抗凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-x（L）、Bcl-w和 Mcl-1 的過(guò)度表達(dá)密切相關(guān)。Polier 等［13］將可抑制Bcl-2、Bcl-x（L）和 Bcl-w 的抑制劑ABT-263 與漢黃芩素、黃芩素、白楊素等活性黃酮共同處理 T細(xì)胞白血病異種移植小鼠，發(fā)現(xiàn)這些活性黃酮可以通過(guò)下調(diào) Mcl-1 來(lái)增強(qiáng)ABT-263 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡表達(dá)，并且漢黃芩素對(duì)正常增殖的T 細(xì)胞和血小板沒(méi)有毒性。黃芩素能通過(guò)劑量依賴(lài)性調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞的NF-kB 信號(hào)改變Bax/Bcl-2 比率，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白濃度增加導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生自噬，還可以降低有絲分裂蛋白Cyclin B1 的濃度抑制甲狀腺癌細(xì)胞的有絲分裂細(xì)胞周期，從而抑制癌細(xì)胞增殖［14］。漢黃芩素主要通過(guò)信號(hào)通路如絲氨酸-蘇氨酸激酶 Akt 和AMP活化蛋白激酶（AMPK）通路、p53 依賴(lài)性/非依賴(lài)性細(xì)胞凋亡、端粒酶活性的抑制、轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB和AP）的抑制、活性氧（ROS）以及ER 應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡和抑制癌細(xì)胞增殖［15-16］。此外，黃芩素和漢黃芩素與成熟的化療藥物如水飛薊素、順鉑、10-羥基喜樹(shù)堿（HCPT）、多西他賽（多烯紫杉醇）聯(lián)合使用，可以明顯提高抗癌效果，還能降低癌細(xì)胞的耐藥性以及對(duì)正常細(xì)胞的毒性［17-22］。黃芩素還可以與靶向治療乳腺癌的溶瘤麻疹病毒（oncolytic measles virus, MV）聯(lián)用，先利用MV 感染乳腺癌細(xì)胞，再聯(lián)合黃芩素治療，可以提高誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡的比率［23］。

2.2 抗病毒活性

黃芩素、漢黃芩素及其苷類(lèi)能夠有效地抑制病毒的復(fù)制，具有抗病毒活性。新型冠狀病毒（SARSCoV-2）于2019年末開(kāi)始在全球肆虐，在尋找有效藥物治療新型冠狀病毒病的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥中的“三藥三方”，即金花清感顆粒、連花清瘟顆粒和膠囊、血必凈注射液、清肺排毒湯、化濕敗毒方、宣肺敗毒方在此次疫情中控制COVID-19 的臨床療效顯著［24-25］。吉米麗汗·司馬依等［26］研究表明，金花清感顆粒的山柰酚、黃芩素和千層紙黃素A 等活性成分可能通過(guò)與ACE2 結(jié)合作用于PTGS2、BCL2和CASP3 等靶點(diǎn)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)COVID-19 的治療作用。Xia 等［27］分析了連花清瘟膠囊中10 種活性成分，構(gòu)建了由65 個(gè)靶基因組成的與COVID -19 相關(guān)的靶基因集，篩選出了9 個(gè)中心基因，將參與肺損傷、肺纖維化和病毒感染的最重要基因Akt1與連花清瘟膠囊6 種活性成分（β-胡蘿卜素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、槲皮素和漢黃芩素）進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)6 種活性成分均可進(jìn)入Akt1 的活性口袋，連花清瘟膠囊主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和抵御病毒感染等機(jī)制發(fā)揮作用。孫遜等［28］和劉暢等［29］基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接法，對(duì)化濕敗毒方的主要活性成分進(jìn)行篩選，構(gòu)建成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并與新型冠狀病毒的3CL 水解酶（3CLpro, Mpro）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ（ACE2）進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果表明與Mpro 結(jié)合最好的是黃芩素。Zhao 等［30］研究表明清肺排毒湯中4 種活性物質(zhì)（黃芩苷、甘草酸、橙皮苷和金絲桃苷）和細(xì)胞的7 個(gè)靶點(diǎn)（AKT1、TNF-α、IL6、PTGS2、HMOX1、IL10 和 TP53）是與清肺排毒湯療效相關(guān)的關(guān)鍵分子。此外，對(duì)于其他一些病毒如艾滋病病毒（HIV）［31］、呼吸道合胞病毒（RSV）［32］、能引起新生兒畸形的寨卡病毒（ZIKV）［33］、登革熱病毒［34-35］、導(dǎo)致失能性關(guān)節(jié)炎的基孔肯雅病毒（CHIKV）［36］等病毒，黃芩素和黃芩苷也表現(xiàn)出了良好的抗病毒活性。

2.3 抗炎

炎癥可能引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致器官的損傷和衰竭［37］。研究表明，黃芩主要活性成分黃芩素、漢黃芩素及其苷類(lèi)具有抗氧化和抗炎的功效，已經(jīng)在多種疾病中得到驗(yàn)證，包括肝炎［38］、心血管疾病［39］、肺部疾?。?0］、過(guò)敏性氣道炎［41］、神經(jīng)炎癥及神經(jīng)退行性疾病［42-43］以及腸道疾?。?4］。黃芩素、漢黃芩素及其苷類(lèi)能夠直接作用于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，抑制其產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α，以及其他炎癥介質(zhì)，如一氧化氮（NO）、前列腺素（PGs）、白三烯（LTs）和活性氧（ROS）作用于免疫細(xì)胞，抑制其產(chǎn)生炎癥因子及其他炎癥介質(zhì)。分子機(jī)制主要是通過(guò)toll 樣受體的下調(diào)、Nrf2 和 PPAR 信號(hào)通路的激活以及核硫氧還蛋白系統(tǒng)和炎癥相關(guān)通路（如 MAPK、Akt、NFκB 和 JAK-STAT）的抑制［37,45］。Huang 等［38］研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能通過(guò)上調(diào) TUG1 的表達(dá)，從而抑制p38MAPK 和 JNK 通路，減輕由脂多糖（LPS）刺激的正常肝臟L-02 和THLE2 細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

3 黃芩的生物技術(shù)研究

黃芩中的黃酮化合物藥用價(jià)值高，因此解析這些活性黃酮的生物合成途徑并闡明其調(diào)控機(jī)制，將為黃芩的育種或用合成生物學(xué)技術(shù)異源生產(chǎn)這些活性物質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

3.1 黃芩的組織培養(yǎng)

目前，黃芩的組織培養(yǎng)研究主要集中在愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的分化與再生、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以及多倍體誘導(dǎo)［46］。如劉建霞等［47］以黃芩幼苗的莖段為材料,研究了不同的激素濃度配比對(duì)黃芩外植體誘導(dǎo)愈傷組織、再生芽和根的影響，發(fā)現(xiàn)黃芩莖段在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 的培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)效果最佳；在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L 的培養(yǎng)基中黃芩莖段的再生芽的分化效果最好；在1/2 MS+NAA 0.4 mg/L 的培養(yǎng)基中,黃芩莖段再生根的分化效果最好［47］。由于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞具有次生代謝產(chǎn)物含量高和抗氧化活性較強(qiáng)的特點(diǎn)，韓淑蘭［48］建立了黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，并對(duì)黃芩苷等次生代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)黃芩苷等次生代謝產(chǎn)物在懸浮培養(yǎng)20 d 時(shí)獲得了最高的產(chǎn)量78.31 mg/g 干重。李富雄等［49］利用秋水仙素誘導(dǎo)了黃芩的同源四倍體。于輝等［50］測(cè)定了四倍體黃芩和二倍體黃芩中的黃芩苷和漢黃芩苷的含量，結(jié)果表明四倍體黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷含量顯著高于二倍體，由二倍體的12.83%、3.35%增為20.69%、6.23%,分別提高了61.26%和85.97%。

作者研究團(tuán)隊(duì)也成功建立了黃芩再生體系，將新鮮健康葉片滅菌后置于配比為MS + 3% sucrose+ 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IAA 的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5 周，可觀察到有愈傷組織長(zhǎng)出；將得到的愈傷組織置于配比為MS + 3% sucrose + 0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L PP333 的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照時(shí)間為16 h/24 h，光培養(yǎng)60 d 后，可以得到不定芽；將不定芽從愈傷組織上切下，置于配比為MS + 2%sucrose + 0.17 g/L K2HPO4+ 0.5 mg/L PP333 的生根培養(yǎng)基中，光照時(shí)間16 h/24 h，光培養(yǎng)30 d 后，可以長(zhǎng)出白色的根，得到完整的黃芩再生植株（圖3）。

圖3 黃芩的再生植株Fig. 3 Regenerated plants of S. baicalensis

3.2 黃芩的毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)

由于發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri 質(zhì)粒誘導(dǎo)的毛狀根具有生長(zhǎng)迅速、激素自養(yǎng)、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單、次生代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定、分化程度高和不易變異等特點(diǎn)，毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)在藥用植物代謝途徑的解析、生產(chǎn)高價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物以及生產(chǎn)重組蛋白等方面得到廣泛應(yīng)用［51-52］。黃芩中，利用毛狀根系統(tǒng)進(jìn)行代謝工程的相關(guān)研究已有許多報(bào)道，如通過(guò)利用毛狀根系統(tǒng)進(jìn)行基因工程改造，將次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因或調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子引入毛狀根來(lái)調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。Kim 等［53］使用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根系統(tǒng)分別過(guò)表達(dá)肉桂酸4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase,C4H）和4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaroyl: CoA-ligase,4CL）基因,通過(guò)HPLC 檢測(cè)黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)SbC4H的毛狀根中，黃芩苷的含量從39.9 mg/g 增加到44.1 mg/g 干重，增加了1.2-1.4 倍，黃芩素和漢黃芩素分別從27.1 mg/g 增加到62.2 mg/g，4.7 mg/g 增加到10.8 mg/g 干重，分別增加了1.4-3.2 倍和1.6-3.4 倍；在過(guò)表達(dá)Sb4CL的毛狀根中黃芩素是對(duì)照組的2.4 倍，漢黃芩素是對(duì)照組1.5-2.5 倍。Park 等［54］通過(guò)毛狀根體系建立了黃芩的查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase,CHI）基因過(guò)表達(dá)和SbCHIRNAi 沉默的轉(zhuǎn)基因毛狀根系，通過(guò)HPLC 對(duì)黃芩素、黃芩苷和漢黃芩素的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，SbCHI過(guò)表達(dá)毛狀根的黃芩素、黃芩苷和漢黃芩素分別是對(duì)照組的1.8-2.5 倍、2.4-3.4倍和1.2-3 倍，SbCHIRNAi 毛狀根系的黃芩素、黃芩苷和漢黃芩素相比對(duì)照組分別減少了13%-80%、4.6%-50%和22%-85%。Park 等［55］通過(guò)在毛狀根培養(yǎng)物中過(guò)表達(dá)玉米的轉(zhuǎn)錄因子Lc（ZmLc）和擬南芥的轉(zhuǎn)錄因子PAP1（AtPAP1）可以增強(qiáng)黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量。

毛狀根系統(tǒng)還可以用于表征新基因、新轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能以及解析未知的代謝途徑。2016、2018 和2019年，Zhao 等［56-58］找到了可能參與根特異黃酮（黃芩素、漢黃芩素）合成途徑中相關(guān)酶的候選基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化分別得到這些基因的RNAi 沉默的轉(zhuǎn)基因毛狀根，結(jié)果表明根特異黃酮的含量會(huì)隨著這些基因表達(dá)量的減少而下降，驗(yàn)證了II 型黃酮合成酶（flavone synthase II, FNSII-2）、肉桂酰輔酶A 連接酶（cinnamate CoA ligase, CLL-7）、黃酮6 位羥化酶（flavone 6-hydroxylase,F6H）、黃酮8位羥化酶（flavone 8-hydroxylase,F8H）和8 位甲氧基轉(zhuǎn)移酶（8-O-methyl transferase,PFOMT5）的確參與根特異黃酮合成途徑中4′-脫氧黃酮的合成，解析了黃芩素、漢黃芩素的合成途徑。

作者研究團(tuán)隊(duì)曾比較過(guò)不同組織來(lái)源的外植體對(duì)發(fā)根誘導(dǎo)效率的影響。用發(fā)根農(nóng)桿菌A4 去侵染黃芩不同的外植體（子葉、葉片和下胚軸）（圖4-a-c），結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有子葉和葉片能夠產(chǎn)生毛狀根（圖4-d 和e），且葉片誘導(dǎo)而來(lái)的毛狀根比子葉誘導(dǎo)而來(lái)的毛狀根粗壯，更適合后續(xù)毛狀根研究。此外，作者研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)將紅色熒光蛋白基因（red fluorescent protein gene,dsRed）轉(zhuǎn)入黃芩毛狀根，用激發(fā)光照射后，紅色熒光十分明顯（圖4-f 和g），非常適合作為黃芩發(fā)狀根中的報(bào)告基因，用于篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性毛狀根。

圖4 不同黃芩外植體誘導(dǎo)的毛狀根及轉(zhuǎn)入紅色熒光蛋白的毛狀根Fig. 4 Hairy roots induced by different S. baicalensis explants and hairy roots transferred with dsRed（red fluorescent protein gene）

4 黃芩的組學(xué)研究

黃芩是一種非常重要的藥用植物，然而與其相關(guān)的基因組、轉(zhuǎn)錄組信息較少，限制了對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)研究。2016年，黃芩的花和毛狀根的轉(zhuǎn)錄組已有發(fā)表［57］，相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已上傳NCBI 的SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300475）。隨著三代測(cè)序技術(shù)發(fā)展，利用Illumina 和PacBio 測(cè)序策略和HIC 技術(shù)，黃芩染色體水平的高質(zhì)量全基因組序列已有報(bào)道［56］，數(shù)據(jù)已上傳至國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中 心（National Genomics Data Center）（https://bigd.big.ac.cn/gwh/Assembly/10400/show）。這是唇形科中第一個(gè)完成染色體水平全基因組測(cè)序的植物，研究者還從黃芩的花、花蕾、葉、莖、根以及JA 處理的根中提取樣品進(jìn)行了RNA-seq（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX4549232），輔助基因組注釋?zhuān)沧⑨屃?8 930 個(gè)基因，在闡明黃芩的黃芩素和漢黃芩素的合成途徑以及相關(guān)酶基因的發(fā)現(xiàn)及基因組進(jìn)化方面取得了很大的進(jìn)展。此外，還有研究報(bào)道了黃芩和半枝蓮的染色體水平基因組（https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/browse/CRA001730），并證實(shí)了半枝蓮和黃芩的分化時(shí)間為13.28 Mya，通過(guò)比較基因組發(fā)現(xiàn)二者染色體端粒比例相似，半枝蓮的染色體的重排和擴(kuò)張可能是近期長(zhǎng)末端重復(fù)序列的插入導(dǎo)致，為黃芩和半枝蓮的育種、進(jìn)化、化學(xué)多樣性和基因組編輯研究提供重要見(jiàn)解［59］。黃芩的代謝組信息也已有報(bào)道［60］。

5 黃芩代謝生物學(xué)

5.1 黃芩中黃酮合成途徑的解析

研究表明，黃芩中存在地上部分和地下部分兩條黃酮合成途徑。地上部分（莖、葉和花）主要合成野黃芩素和野黃芩苷，為經(jīng)典的黃酮合成途徑，普遍存在于高等植物中；地下部分（根）主要合成黃芩素、漢黃芩素、黃芩苷和漢黃芩苷，地下部分的黃酮合成途徑目前只在黃芩中發(fā)現(xiàn)，是黃芩特有的，也稱(chēng)根特異黃酮（root-specific flavones, RSF）合成途徑［56-58］（圖5）。

圖5 黃芩的地上地下兩條黃酮合成途徑Fig. 5 Two flavonoid biosynthetic synthesis pathways of S. baicalensis in aerial and root parts

經(jīng)典黃酮途徑從莽草酸途徑生成的苯丙氨酸開(kāi)始，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase, PAL）催化下形成肉桂酸（cinnamic acid）［61］；肉桂酸在肉桂酸羥化酶（C4H）作用下生成對(duì)香豆酸（p-coumaric acid）［62］；對(duì)香豆酸經(jīng)過(guò)4-香豆酰輔酶A 連接酶（4CL）催化生成香豆酰輔酶A（p-coumaroyl CoA）［63］；香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶 A 在查耳酮合成酶（chalcone synthase, CHS）作用下生成柚皮素查耳酮（naringenin chalcone）；柚皮素查耳酮在查耳酮異構(gòu)酶（CHI）催化下生成柚皮素（naringenin）［64］；柚皮素在黃酮合成酶（flavone synthase II, SbFNSII-1）的催化下生成芹菜素；芹菜素在黃酮6 位羥化酶（SbF6H）的作用下生成野黃芩素［57-58,65］。

根特異黃酮合成途徑同樣起始于苯丙氨酸，在SbPAL 作用下生成肉桂酸。隨后，肉桂酸在肉桂酸輔酶A 連接酶（SbCLL-7）催化下形成肉桂酰輔酶 A（cinnamoyl CoA）；肉桂酰輔酶A 在松屬素查耳酮合成酶（pinocembrin-chalcone synthase, SbCHS-2）作用下生成松屬素查耳酮（pinocembrin chalcone）；松屬素查耳酮在 CHI 的作用下產(chǎn)生松屬素（pinocembrin）；松屬素在黃酮合成酶（SbFNS II-2）催化下生成白楊素（chrysin）；白楊素在黃酮 6 位羥化酶或黃酮 8 位羥化酶（SbF8H）作用下分別生成黃芩素（baicalein）或去甲漢黃芩素（norwogonin）；去甲漢黃芩素最終在8 位氧甲基轉(zhuǎn)移酶（SbOMT）作用下生成漢黃芩素［56-58］。黃芩素和漢黃芩素在黃酮類(lèi)7-O-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UBGAT）的催化下生成黃芩苷和漢黃芩苷［66］。

5.2 黃芩中黃酮合成途徑的調(diào)控

代謝途徑不僅受內(nèi)部基因的調(diào)控，還受外部因素影響。環(huán)境因子（光質(zhì)、溫度和水分）和誘導(dǎo)子（生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子）同樣能調(diào)控黃芩中活性黃酮的積累［65］。有研究表明，光照和黑暗兩個(gè)條件下對(duì)黃芩懸浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，光照顯著促進(jìn)了黃芩苷和黃芩素的積累，可能是通過(guò)誘導(dǎo)PAL、黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UBGAT）基因的表達(dá)，或通過(guò)內(nèi)源激素進(jìn)行調(diào)控［67-68］。不同光源（紅色、藍(lán)色、白色）對(duì)黃芩幼苗的根、莖和葉進(jìn)行照射后發(fā)現(xiàn)，白光處理的黃芩幼苗根部的黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量最高［69］。另有研究表明，黑暗條件有利于黃芩發(fā)狀根的生長(zhǎng)和黃芩苷的積累［70］。不同溫度培養(yǎng)對(duì)黃芩愈傷組織中黃芩苷含量也有顯著影響，在一定范圍內(nèi)黃芩苷的含量隨著溫度增加而增加，20℃培養(yǎng)時(shí)黃芩苷含量最高，高溫35℃或較低溫度（低于15℃）都對(duì)黃芩苷的合成產(chǎn)生了一定的抑制，可能是影響了黃芩苷合成途徑中關(guān)鍵酶的活性［71］。此外，短期、輕中度干旱脅迫能夠不同程度增強(qiáng)PAL、C4H、4CL 和CHS 酶活性,促進(jìn)黃芩苷積累，長(zhǎng)期、重度干旱脅迫會(huì)抑制這4 種酶的活性,導(dǎo)致黃芩苷的合成受到抑制［72］。

誘導(dǎo)子常被用來(lái)促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累，如曲霉和米曲霉等真菌誘導(dǎo)子能提高黃芩毛狀根中黃芩苷的含量［73］。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）能夠通過(guò)上調(diào)黃酮合成途徑相關(guān)基因從而促進(jìn)黃芩懸浮細(xì)胞、愈傷組織和發(fā)根中黃芩苷的積累［57,62,74-75］。在黃芩愈傷組織培養(yǎng)基中加入一定濃度的水楊酸會(huì)抑制愈傷組織生長(zhǎng)，但能促進(jìn)黃芩苷的積累［76］。添加外源植物激素如6-芐氨基嘌呤（N-（phenylmethyl）-9H-purin-6-amine, 6-BA）和萘乙酸（1-naphthylacetic acid, NAA）培養(yǎng)黃芩愈傷組織，也能夠提高黃芩苷含量。稀土元素如鑭（La），能夠以茉莉酸（jasmonic acid, JA）為信號(hào)分子誘導(dǎo)黃芩幼苗積累黃芩苷［77］。高濃度砷抑制黃芩植物黃芩苷和漢黃芩苷的生成，但促進(jìn)了黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A 的生成［78］。

5.3 黃芩中黃酮合成途徑的進(jìn)化

進(jìn)化分析表明，黃芩的根特異黃酮合成途徑是從地上部分的經(jīng)典黃酮合成途徑進(jìn)化而來(lái)，該途徑進(jìn)化在黃芩屬和鼠尾草屬（Salvia）的分化后形成（<32.7 Mya），該途徑中只有SbCHI基因僅有一個(gè)基因座，且在地上部分和地下部分黃酮合成途徑中功能相同，其他關(guān)鍵酶基因分別經(jīng)歷點(diǎn)突變（SbCLL-7）、串聯(lián)增殖以及新功能化（SbCHS-2、SbFNSII-2、SbF8H和SbPFOMT）、片段復(fù)制（SbFNSII-2）和反轉(zhuǎn)錄復(fù)制（SbF6H）進(jìn)化而來(lái)［79］。

PAL 催化苯丙氨酸脫氨基生成反式肉桂酸和氨，是連接初級(jí)代謝和次級(jí)代謝之間的關(guān)鍵酶之一［61］。Xu 等［62］使用 cDNA 末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)從黃芩中克隆了3 個(gè)編碼苯丙氨酸解氨酶亞型（SbPAL1、SbPAL2和SbPAL3）的全長(zhǎng) cDNA。黃芩和半枝蓮的比較基因組分析顯示，黃芩中的PAL基因數(shù)（5 個(gè)）與半枝蓮的PAL（4 個(gè)）相比要多，說(shuō)明這些基因的特異性擴(kuò)增可能是在黃芩和半枝蓮物種形成后通過(guò)串聯(lián)復(fù)制發(fā)生的（<13.28 Mya）［59］。

CLL 是4CL 的異構(gòu)體?；诟鵕NA-seq 數(shù)據(jù)庫(kù)，Zhao 等［56］從黃芩中鑒定并克隆了5 個(gè)CLL基因的全長(zhǎng)cDNA（SbCLL-1、SbCLL-5、SbCLL-6、SbCLL-7，SbCLL-8）；純化的重組蛋白SbCLL-1 和SbCLL-5 可以催化肉桂酸、4-香豆酸和咖啡酸與CoA 反應(yīng)，而SbCLL-7 只能以肉桂酸為底物添加CoA；比較基因組分析表明，SbCLL-1和SbCLL-7在唇形科其他物種（丹參、一串紅和芝麻）中具有同源性，但丹參、一串紅和芝麻中的CLL-7對(duì)肉桂酸、4-香豆酸或咖啡酸沒(méi)有活性，表明SbCLL-7對(duì)肉桂酸的特異性活性在黃芩近緣種的同源基因中沒(méi)有共享，說(shuō)明黃芩中的CLL基因的點(diǎn)突變可能發(fā)生在黃芩、丹參和一串紅分化后（<32.7 Mya）。

Zhao 等［57］還從黃芩中鑒定并克隆了兩個(gè)CHS基因的全長(zhǎng)cDNA（SbCHS-1和SbCHS-2）。SbCHS-1在花中特異性表達(dá)，可能與經(jīng)典黃酮和花青素的生物合成有關(guān)；SbCHS-2在根中高度表達(dá)，編碼一種催化松屬素查耳酮生成的酶?；诨蚪M分析，SbCHS-2的基因組區(qū)域發(fā)生了串聯(lián)復(fù)制事件，導(dǎo)致SbCHS-2產(chǎn)生了5 個(gè)相鄰的基因拷貝（SbCHS2.1-SbCHS2.6）。SbCHS-1和SbCHS-2的新功能化是隨著鼠尾草屬和黃芩屬（~32.7 Mya）的分化而發(fā)生的，原始CHS基因在黃芩中復(fù)制，一個(gè)拷貝（SbCHS-1）移向假3 號(hào)染色體，另一個(gè)拷貝（SbCHS-2L）保留在假9 號(hào)染色體（約19 Mya）上，并在12 Mya 左右復(fù)制（SbCHS2.3）。然后通過(guò)串聯(lián)復(fù)制擴(kuò)增，產(chǎn)生其他SbCHS-2基因，并且可能在最后一個(gè)Mya內(nèi)新功能化［56］。總之，黃芩的SbCHS-2經(jīng)歷了幾輪擴(kuò)增，在物種分化之前出現(xiàn)的重復(fù)（SbCHS2L和SbCHS2.3），以及在物種水平分化后出現(xiàn)串聯(lián)復(fù)制（CHS-2.1、CHS-2.2、CHS-2.4、CHS-2.5和CHS-2.6）。比較基因組表明，在半枝蓮中，CHS-2的復(fù)制程度沒(méi)有黃芩中那么大［59］，這證實(shí)了CHS-2的大部分復(fù)制是近期內(nèi)發(fā)生的［56］，可能是黃芩作為中藥被人為篩選后引起的。

黃芩中，兩種不同類(lèi)型的FNS 酶（FNSI 和FNSII）通過(guò)引入C2 和C3 位的雙鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)黃烷酮到黃酮的轉(zhuǎn)化。FNSI 屬于酮戊二酸依賴(lài)的雙加氧酶（2-oxoglutarate-dependent dioxygenase, 2OGD）超家族，最早在傘形科植物中發(fā)現(xiàn)［80］，F(xiàn)NSII 是一種廣泛分布于被子植物中的細(xì)胞色素P450（CYP450）單加氧酶［81］。一般來(lái)說(shuō)，F(xiàn)NSI 和FNSII 催化具有4′-OH基團(tuán)黃烷酮類(lèi)，如柚皮素、圣草酚和甘草素轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的黃酮［82］。Zhao 等［57］首次報(bào)道了黃芩中具有新功能的FNSII（SbFNSII-2），該FNSII 是專(zhuān)門(mén)合成4′-脫氧黃酮所必需的，此外，黃芩的地上部分還存在FNSII 亞型（SbFNSII-1），能將柚皮素轉(zhuǎn)化為芹菜素。基因組分析表明，有兩個(gè)SbFNSII-1位點(diǎn)是唇形科分化后（<42.7 Mya）發(fā)生片段復(fù)制的一部分，然而，黃芩基因組中僅存在一個(gè)SbFNSII-2位點(diǎn)，表明SbFNSII-2是由SbFNSII-1串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生，并且是在鼠尾草屬和黃芩屬分化（<32.7 Mya）之后發(fā)生的新功能化［56］。黃芩和半枝蓮比較基因組分析表明，在黃芩與半枝蓮共線區(qū)域可以檢測(cè)到FNSII-2的一個(gè)直系同源基因，以及FNSII-1和FNSII-2的串聯(lián)復(fù)制［59］。這表明黃芩屬中FNS-II復(fù)制早于物種分化，黃芩屬中4 ′-脫氧黃酮化合物的進(jìn)化十分保守［79］。

黃芩中的兩個(gè)CYP450 家族成員負(fù)責(zé)黃酮化合物6 位和8 位的羥基化（分別是SbF6H 和SbF8H），SbF6H（CYP82D1.1）可以利用4′-羥基黃酮化合物和4′-脫氧黃酮化合物（分別為芹菜素和松屬素）在地上部分和根中分別產(chǎn)生野黃芩素和黃芩素［58］。黃芩的5 號(hào)染色體上只有一個(gè)SbF6H位點(diǎn)，該位點(diǎn)可能來(lái)源于1 號(hào)染色體上CYP82D基因的復(fù)制和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座作用，而SbF8H則來(lái)源于1 號(hào)染色體上串聯(lián)復(fù)制和新功能化［56］。

黃 芩 中 兩 類(lèi)OMTs（O-methyltransferases） 參與根特異性4′-脫氧黃酮化合物的生物合成。II 型OMT 依賴(lài)于Mg2+，也被稱(chēng)為苯丙素類(lèi)和類(lèi)黃酮OMT（PFOMTs），據(jù)報(bào)道，它們能將甲基轉(zhuǎn)移到類(lèi)黃酮的芳香環(huán)的羥基上［79］。在黃芩根中，SbPFOMT 2 和5可以有效地O-甲基化黃酮化合物的C6、C8 和C3 位，分別生成單甲氧基黃酮化合物如千層紙素、漢黃芩素、韌黃芩素Ⅱ和金圣草素［56,60］。此外，在黃芩中發(fā)現(xiàn)了3 條有功能的I 型OMTs（flavonoid OMTs,SbFOMTs）可 以 修 飾4′- 脫 氧 黃 酮，SbFOMT3 和SbFOMT6 是7-OMT，前者可將黃芩素轉(zhuǎn)化為7-甲氧基黃芩素；后者可同時(shí)修飾黃芩素和去甲漢黃芩素底物；SbFOMT5 能使黃芩素C5、C6 和C7 上的羥基甲基化；SbPFOMT5 與SbFOMT6 組合或SbPFOMT5加SbFOMT5 組合可在酵母中分別產(chǎn)生黃芩黃酮I 和韌黃芩素I［60］。此外，SbPFOMT5 最近在1 號(hào)染色體上也經(jīng)歷了串聯(lián)復(fù)制和新功能化［56］。

6 黃芩的合成生物學(xué)

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)大腸桿菌、酵母等微生物合成植物天然產(chǎn)物成為一種高效、綠色和經(jīng)濟(jì)的方法［83］。已有研究報(bào)道在大腸桿菌、酵母和煙草中表達(dá)黃酮合成關(guān)鍵基因，重建黃酮生物合成途徑，提高活性黃酮的產(chǎn)量。Zhao 等［58］曾在煙草中瞬時(shí)表達(dá)黃芩中的SbCLL-7、SbCHS-2、SbCHI、SbFNSII-2、SbF6H，得到了黃芩苷和野黃芩素。Li等［84］在大腸桿菌轉(zhuǎn)入來(lái)自不同物種的黃酮合成關(guān)鍵基因，圓紅酵母（Rhodotorula toruloides）的PAL、歐 芹（Petroselinum crispum） 的4CL和FNS I、 矮牽 牛（Petunia hybrida） 的CHS、 苜 蓿（Medicago sativa）的CHI以及黃芩截短的F6H，在大腸桿菌中重構(gòu)了黃芩素和野黃芩素的生物合成途徑，在以0.5 mg/L 的丙苯氨酸和酪氨酸為前體48 h 發(fā)酵后，得到了8.5 mg/L 的黃芩素和47.1 mg/L 的野黃芩素；經(jīng)過(guò)優(yōu)化丙二酰輔酶 A 的利用率后，黃芩素和野黃芩素的搖瓶產(chǎn)量達(dá)到了23.6 mg/L 和106.5 mg/L［84］。之后，還開(kāi)發(fā)了順序自組裝酶反應(yīng)器，利用大腸桿菌中蛋白質(zhì)-肽相互作用將RtPAL 和Pc4CL 進(jìn)行自組裝，有效地減少了中間體的積累，大大的提高黃芩素和野黃芩素的產(chǎn)量，黃芩素的搖瓶產(chǎn)量從21.6 mg/L 提高到143.5 mg/L，提高了6.6 倍；野黃芩素的搖瓶產(chǎn)量從84.3 mg/L 提高到120.4 mg/L，提高了1.4 倍；通過(guò)發(fā)酵罐分批補(bǔ)料，黃芩素和野黃芩素的產(chǎn)量能達(dá)到271 mg/L 和288.9 mg/L；此外，還在大腸桿菌中首次實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖到黃芩素的從頭合成，通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵，黃芩素的產(chǎn)量能達(dá)到214.1 mg/L［85］。Qian 等［86］在畢赤酵母中分別引入黃芩根中4′-脫氧黃酮合成中的多個(gè)催化酶：PAL、CLL-1、CHS-2、CHI、FNSII-1、F6H、F8H、OMT5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物除了黃芩素、去甲漢黃芩素和漢黃芩素外，首次得到了千層紙素A、6-甲氧基漢黃芩素、6-甲氧基去甲漢黃芩素，表明SbF8H 和SbPFOMT5 具有多種催化作用；此外，他們?cè)诋叧嘟湍钢幸胪暾狞S芩素的生物合成途徑，并以乙醇為碳源，實(shí)現(xiàn)了黃芩素的從頭合成；為了提高黃芩素和千層紙素的產(chǎn)量，他們進(jìn)一步將黃芩素生物合成途徑分成5個(gè)模塊，還構(gòu)建了一系列的乙醇誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄信號(hào)放大裝置（ESADs）和組成性轉(zhuǎn)錄信號(hào)放大裝置（CSADs）來(lái)驅(qū)動(dòng)和平衡模塊，顯著減少了副產(chǎn)物和中間產(chǎn)物的積累，黃芩素和千層紙素A 的產(chǎn)量達(dá)到報(bào)道過(guò)的最高水平401.9 mg/L 和339.5 mg/L。

7 總結(jié)與展望

黃芩作為傳統(tǒng)的藥用植物，已有數(shù)千年的使用歷史，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，黃芩仍擁有著巨大的開(kāi)發(fā)潛力，如黃芩素能夠很好地結(jié)合新型冠狀病毒的3CLpro 靶點(diǎn)，阻止引起全球大流行的新冠病毒的復(fù)制［24］。此外，黃芩素和漢黃芩素等還具有良好的抗腫瘤、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等作用。目前，黃芩中根特異黃酮的生物合成途徑已經(jīng)完整解析，全基因組序列和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已發(fā)表，這些工作不僅為黃芩后續(xù)的研究提供了參考，也為開(kāi)發(fā)利用其他藥用植物提供了借鑒。到目前為止，黃芩黃酮骨架結(jié)構(gòu)合成途徑及A 環(huán)上的修飾機(jī)制已經(jīng)研究清楚，但其B 環(huán)修飾反應(yīng)還需進(jìn)一步研究。如韌黃芩素I、黃芩黃酮I、甘肅黃芩素I、側(cè)花黃芩素I，這些黃酮在B 環(huán)的2′、3′、5′和6′位置發(fā)生羥基化，該羥基化的酶尚未鑒定，且其中部分黃酮（韌黃芩素I 和黃芩黃酮I）在誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡方面具有比黃芩素更強(qiáng)的細(xì)胞毒性［60］，其生物合成途徑及臨床研究非常值得探索。

除黃芩外，黃芩屬中還有許多其他入藥的植物，如半枝蓮（Scutellaria barbata）在韓國(guó)和朝鮮常被用來(lái)治療咽喉腫痛、水腫和痔瘡和蛇咬傷以及一些癌癥；側(cè)花黃芩（Scutellaria lateriflora）在北美被用來(lái)治療癲癇、焦慮等神經(jīng)疾病；韓信草（Scutellaria indica）在中國(guó)、韓國(guó)和印度被用來(lái)解毒、鎮(zhèn)痛和促進(jìn)血液循環(huán)［65］。黃芩屬植物除含有黃酮化合物外，還含有豐富的二萜和生物堿，這些化合物具有良好的抗腫瘤活性，其生物合成途徑也有待研究。飛速發(fā)展的第三代測(cè)序技術(shù)、代謝物分析技術(shù)、基因編輯技術(shù)將有助于我們進(jìn)一步研究黃芩屬植物活性成分的生物合成和調(diào)控，以及黃芩屬植物的多樣化和進(jìn)化。