OsDIS1 通過抗氧化途徑負調(diào)控水稻耐旱性

楊茂 林宇豐 戴陽朔 潘素君 彭偉業(yè) 嚴明雄 李魏 王冰 戴良英

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，長沙 410128）

水稻（Oryza sativa）作為世界一半以上人口的主要食物來源，近年來水資源短缺、土地荒漠化等外界因素嚴重危害了其產(chǎn)量和品質(zhì)［1］。隨著分子生物學技術在作物育種上的廣泛應用，發(fā)掘抗旱相關的基因，研究其作用機制，成為培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)耐旱水稻品種的重要途徑［2-3］。

植物在適應干旱這一逆境過程中演化出了多種高效保護機制［4］。這些干旱調(diào)節(jié)機制極其復雜，其中有多種干旱應答相關的基因參與調(diào)節(jié)，并伴隨著各種生理、生化反應以及一系列的信號轉(zhuǎn)導［5］。脫落酸（abscisic acid, ABA）是一種重要的干旱脅迫響應激素，通過參與復雜的調(diào)控網(wǎng)絡來響應干旱脅迫［6］。其參與的干旱相關調(diào)控網(wǎng)絡分為兩大類，即ABA 依賴型和非ABA 依賴型［7］。如NAC 轉(zhuǎn)錄因子OsNAC10 可被ABA 誘導，通過ABA 依賴途徑顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻對干旱和高鹽的耐受性［8］；擬南芥DREB1A 轉(zhuǎn)錄因子通過激活RD29B轉(zhuǎn)錄，調(diào)控基因表達，參與ABA 非依賴型信號途徑［9］。除此之外，干旱脅迫使得植物體內(nèi)活性氧的含量升高，進而加劇自身氧化過程，危害植物組織。因而，植物體內(nèi)隨之開發(fā)出一種復雜的抗氧化系統(tǒng)來清除活性氧維持體內(nèi)平衡［10］。研究發(fā)現(xiàn)，油菜中過表達BrLAS基因的植株在干旱脅迫期間能夠減少活性氧的積累，進而增強抗氧化酶活性［11］。擬南芥中GhTZF1通過減少活性氧的積累不僅延緩葉片衰老，還增強了植物對干旱脅迫的耐受性［12］。

E3 泛素連接酶在植物生長發(fā)育、抗病抗逆等一系列生命活動過程中發(fā)揮重要的作用。E3 泛素連接酶包含4 個亞家族：RING（really interesting new gene）亞家族、U-box 亞家族、CRLs（Cullin-RING ubiquitin ligases）亞家族、HECT（homologous to the E6-AP Car boxy terminus）亞家族。其中RING-finger型E3 泛素連接酶在應對非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用［13-14］。已有研究表明，在蘋果中過表達E3泛素酶基因MdMIEL1后，蘋果植株對鹽脅迫的耐受性降低［15］；E3 泛素連接酶AtAIRP3正調(diào)控擬南芥對高鹽和干旱的耐受性［16］；另外，大豆E3 泛素連接酶基因GmAIRP1也被發(fā)現(xiàn)通過激活抗氧化酶,提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，從而增強其抵御高鹽和干旱脅迫的能力［17］。水稻中存在多種RING 型泛素連接酶基因，比如，OsSDIR1、OsRDCP1、OsDSG1等，這些基因調(diào)控水稻抵御干旱脅迫［18］。具有環(huán)指蛋白結(jié)構(gòu)域的E3 泛素連接酶基因SINAT5通過泛素化NAC1，減弱生長素信號來調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育［19］。OsDIS1是一個響應干旱脅迫的SINA 泛素連接酶基因，和擬南芥中SINAT5基因的親緣關系較近，已有研究表明過表達該基因削弱了水稻抗旱性，而沉默增強了水稻對干旱的抗性;同時OsDIS1 與OsNeK6存在相互作用，可能通過泛素化促進OsNeK6 的降解進而負調(diào)控水稻的干旱脅迫耐受性［20］。但是，其具體影響下游哪條通路，還未被進一步驗證。探究其干旱脅迫響應機制對于培育抗旱、高產(chǎn)水稻具有重要價值。

因此，為了進一步明確OsDIS1在負調(diào)控水稻干旱脅迫的響應途徑，我們對OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因水稻進行了脫落酸敏感性試驗、抗氧化酶活性測定等一系列生理生化實驗及農(nóng)藝性狀分析。研究發(fā)現(xiàn)OsDIS1通過抗氧化信號途徑負調(diào)控水稻的抗旱性，而并非ABA 信號途徑；同時OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因水稻的生長和產(chǎn)量沒有受到影響。為OsDIS1基因在培育抗旱水稻新品種上的應用提供更多的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

以日本晴（Nipponbare）OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因純合株系為試驗材料；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購于天根生化科技有限公司；過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量測定試劑盒等購于北京索萊寶科技有限公司；3,3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購于美國Amresco 生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因水稻（OsDIS1-RNAi）的獲得 將轉(zhuǎn)基因水稻種子播種于含有50 mg/mL 潮霉素、3%蔗糖的1/2 MS 培養(yǎng)基上，后期經(jīng)篩選鑒定獲得RNAi-8、RNAi-21、RNAi-22 三個沉默效率較高的轉(zhuǎn)基因純合株系，作為后續(xù)試驗材料。

1.2.2 RNA 提取及實時熒光定量檢測 使用試劑盒（TIANGEN，北京）從水稻葉片中提取總RNA。將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再在熒光定量PCR 儀上進行實時熒光定量。以水稻內(nèi)參基因OsUBQ作為內(nèi)參對照，用3 次技術重復進行RT-PCR 擴增。反應條件：預變性95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 35 s,68℃ 15 min，40 個循環(huán)；68℃ 6 min。所用引物列于表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.2.3 脫落酸敏感性試驗 將野生型和OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因水稻種子播種于含有不同濃度ABA（0、1、2、3 μmol/L）的1/2 MS 培養(yǎng)基上，在28℃的溫室中生長7 d 后，記錄發(fā)芽種子的數(shù)量。14 d 后拍照并記錄野生型和OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因株系（RNAi-21）之間的表型差異，并測量根長和株高。

1.2.4 抗氧化酶活性和丙二醛含量的測定 通過估算降低氯化硝基四氮唑藍（NBT）還原的速率來測定SOD 的活性。即在（560 ± 100）nm 波長下測定反應混合物的吸光度。抑制NBT 光還原50%所需的酶的體積為一個單位的超氧化物歧化酶活性。POD活性按照愈創(chuàng)木酚法進行測定。該反應混合物由30 μL 酶提取物、76 μL 愈創(chuàng)木酚、112 μL 30% H2O2和200 mL 乙酸鈉緩沖液（pH 6.0）組成。一個單位的POD 活性即1 min 內(nèi)470 nm 下的吸光值。CAT 活性通過測量H2O2在240 nm 下的吸光值來評估。該反應混合物由30 μL 酶提取物、300 μL 30% H2O2和200 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）組成。在240 nm 處每分鐘0.01 吸光度單位的減少量為一個單位的CAT活性。

MDA 含量采用以下方法進行測定。向2 mL 上清液中加入含0.5%二硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3 mL?；靹蚝笤诜兴屑訜?0 min，快速冷卻。5 000 r/min 離心15 min 后，測定上清液在532 nm 和600 nm 波長下的吸光度。最后的脂質(zhì)過氧化水平即丙二醛的含量。

1.2.5 DAB 染色 將剪下的水稻葉片浸沒在含有1 mg/mL 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的溶液中，室溫避光孵育8 h，蒸餾水沖洗一遍后加入無水乙醇，再置于96℃水浴鍋中脫色20 min，然后在95%酒精中浸泡48 h，直到所有的葉綠素都被去除，拍照記錄染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 OsDIS1抗旱性可能與ABA信號通路無關

已有研究表明，干旱處理后OsDIS1-RNAi 植株的存活率明顯高于野生型，并且在恢復供水后能恢復正常生長，OsDIS1基因沉默的植株提高了水稻的抗旱性。為明確OsDIS1基因負調(diào)控水稻抗旱性干旱脅迫背后的分子機制，進一步分析了OsDIS1-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻對ABA 的敏感性。在不同濃度的ABA（0、1、2、3 μmol/L）處理后，野生型和轉(zhuǎn)基因植株沒有明顯的表型差異（圖1-A）。且OsDIS1-RNAi 與野生型的種子發(fā)芽率一致，均隨ABA 濃度的增加而降低（圖1-B）。此外，與野生型相比，OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植物的根長和株高沒有顯著差異（圖1-C, D）。OsDSM2和OsBZIP23兩個基因在抗旱期間參與ABA途徑，因此對干旱處理后RNAi 和野生型中OsDSM2和OsBZIP23的轉(zhuǎn)錄水平進行了評估。結(jié)果顯示OsBZIP23和OsDSM2在野生型和OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株中都有增加，但兩者之間沒有顯著差異（圖2）。據(jù)此推斷OsDIS1可能不通過ABA 信號通路調(diào)節(jié)水稻抗旱性。

圖1 脫落酸處理下OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株的表型Fig. 1 Phenotypes of OsDIS1-RNAi transgenic plants treated with abscisic acid (ABA)

圖2 RT-qPCR 檢測ABA 途徑基因在OsDIS1-RNAi 植株中的表達量Fig. 2 Expressions of ABA pathway genes in OsDIS1-RNAi plants detected by RT-qPCR

2.2 OsDIS1負調(diào)控水稻的抗氧化能力

干旱脅迫期間植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，并通過氧化脅迫對其造成損傷。而SOD、CAT 和POD 有助于清除細胞內(nèi)活性氧。前面實驗證明OsDIS1不通過ABA 信號通路調(diào)節(jié)水稻抗旱性，因而進一步分析了抗氧化途徑是否參與其中。為了研究OsDIS1基因?qū)τ谒究寡趸芰Φ挠绊懀紫仁褂肈AB 染色法檢測了OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因和野生型水稻中的活性氧含量；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株顯示出更深、更大面積的染色（圖3）。同時檢測了干旱處理后OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因和野生型中SOD、CAT、POD 酶的活性。結(jié)果顯示，與野生型相比，OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植物的3 種抗氧化酶活性顯著增強（圖4-A, B, C）。干旱脅迫期間，植物可以通過調(diào)節(jié)活性氧含量從而進行滲透調(diào)節(jié)，MDA是活性氧破壞細胞膜脂質(zhì)的副產(chǎn)物。因此，對干旱處理后植株體內(nèi)的MDA 含量進行了檢測，發(fā)現(xiàn)干旱處理后OsDIS1-RNAi 植株中MDA 的含量明顯降低（圖4-D）。

圖3 野生型和RNAi 的活性氧含量檢測Fig. 3 Detection of reactive oxygen content of wild-type and RNAi

圖4 OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化酶活性和MDA 含量檢測Fig. 4 Detection of antioxidant enzyme activity and MDA content in OsDIS1-RNAi transgenic plants

此外，OsDSM1、OsSIK1和OsSKIPa參與抗氧化信號通路，對此在野生型和OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株中測定了基因表達量。發(fā)現(xiàn)OsDSM1和OsSKIPa在未經(jīng)處理的OsDIS1-RNAi 植株中被激活；并且干旱處理后OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植物中OsDSM1、OsSIK1和OsSKIPa的轉(zhuǎn)錄被誘導（圖5）。以上結(jié)果表明，OsDIS1通過激活抗氧化系統(tǒng)清除細胞內(nèi)活性氧來負調(diào)節(jié)抗旱性。

圖5 RT-qPCR 檢測OsDIS1-RNAi 植物中相關活性氧（ROS）清除基因的表達量Fig. 5 Expressions of related reactive oxygen species（ROS）scavenging genes in OsDIS1-RNAi plants by RT-qPCR

2.3 OsDIS1不影響水稻的生長和產(chǎn)量

E3 泛素連接酶在應對干旱脅迫中發(fā)揮著重要的作用，它們還能影響植物生長。為分析OsDIS1的應用價值，對OsDIS1-RNAi 植株的農(nóng)藝性狀進行了研究。正常條件下，OsDIS1-RNAi 與野生型之間沒有顯著的形態(tài)差異（圖6）。同時對OsDIS1-RNAi的株高、穗長、每穗實粒數(shù)、每穗粒數(shù)和單株產(chǎn)量進行了評估，發(fā)現(xiàn)兩者之間沒有顯著差異（表2）。因此，OsDIS1-RNAi 不影響水稻植株生長和產(chǎn)量，表明OsDIS1可以應用于培育耐旱水稻的基因工程。

表2 轉(zhuǎn)基因水稻OsDIS1-RNAi 的農(nóng)藝性狀Table 2 Agronomic characteristics of transgenic rice OsDIS1-RNAi

圖6 OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因水稻的生長表型Fig. 6 Growth phenotypes of OsDIS1-RNAi transgenic rice

3 討論

泛素化途徑涉及3 種酶：泛素激活酶（E1）、泛素偶聯(lián)酶（E2）和泛素連接酶（E3）［21］。在這一途徑中E3 連接酶通過泛素化靶蛋白，然后通過26S蛋白酶體識別偶聯(lián)蛋白使靶蛋白降解,其在植物抵抗生物和非生物脅迫響應中發(fā)揮重要的作用。例如OsPUB67作為U-box 型E3 泛素連接酶基因顯著提高水稻抗旱性［22］；OsDIS1是一種重要的E3 泛素連接酶，調(diào)節(jié)植物細胞過程的許多方面。有報道發(fā)現(xiàn)其在抗旱中發(fā)揮重要作用。但其調(diào)控通路尚未明確。探明干旱脅迫的分子機制是培育耐旱品種的前提條件［23］。

前人研究中，脫落酸已被證明是植物抵御干旱脅迫的關鍵因子［24］。植物干旱脅迫適應途徑分為脫落酸依賴途徑和脫落酸非依賴途徑［25］。研究報道MlNAC10通過脫落酸信號通路作為干旱脅迫耐受性的關鍵調(diào)節(jié)因子［26］。本試驗分析了OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株對ABA 的敏感性，以了解OsDIS1調(diào)控干旱脅迫的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的脫落酸處理后，OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株種子的發(fā)芽率、根長和株高沒有表現(xiàn)出顯著差異。在水稻中，OsDSM2和OsbZIP23通過ABA 依賴性途徑調(diào)節(jié)耐旱性［27］。本研究發(fā)現(xiàn)OsDSM2和OsBZIP23基因表達上調(diào)，但是在野生型和OsDIS1-RNAi 植株之間沒有明顯差異。這些結(jié)果顯示OsDIS1不依賴于ABA 的調(diào)節(jié)途徑調(diào)節(jié)抗旱性。

有報道發(fā)現(xiàn)，抗氧化途徑也是調(diào)控植株抗旱性的重要方式［28］。本研究發(fā)現(xiàn)干旱處理后OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因水稻中CAT、POD、SOD 的活性增強。干旱脅迫會導致水稻體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，從而損傷植物體［29］。針對此現(xiàn)象，植物也進化出了復雜的調(diào)控機制，例如增強CAT、POD、SOD 等活性氧清除酶活性［30］?；钚匝醯倪^度積累會產(chǎn)生大量MDA等次級產(chǎn)物，這些次級產(chǎn)物會導致細胞膜嚴重的過氧化損傷［31］。與干旱處理后的野生型植株相比，OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株的MDA 積累顯著減少，這與OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株的SOD、CAT、POD 活性顯著增強相一致。干旱脅迫誘導活性氧（ROS）清除基因的表達，有研究表明，水稻OsDSM1基因通過調(diào)節(jié)水稻中活性氧（ROS）的含量，在早期干旱脅迫響應中起作用［32］。在本研究中，干旱處理后的OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植株中，OsDSM1、OsSIK1和OsSKIPa基因表達量顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明，OsDIS1-RNAi 轉(zhuǎn)基因植物通過增強活性氧清除酶活性，提高清除活性氧及次級產(chǎn)物的能力，來提高其本身對干旱的耐受性。

培育耐旱水稻對于滿足人類日益增長的需求至關重要。E3 泛素連接酶也參與到調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程。在擬南芥中敲除泛素連接酶SINAT5 抑制側(cè)根形成［33］。如果沉默OsDIS1會減弱其他農(nóng)藝性狀，就降低了其在育種中的應用價值。為此，分析OsDIS1-RNAi 植株的農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)與野生型植物相比，沒有明顯的表型差異。因此，OsDIS1可以認為是耐旱基因育種的較為理想候選基因。

4 結(jié)論

OsDIS1通過提高抗氧化系統(tǒng)活性來清除干旱脅迫誘導的細胞內(nèi)活性氧，從而負調(diào)控水稻抗旱性。沉默OsDIS1基因不影響植株的正常生長和產(chǎn)量。