異源三倍體普通煙草（SST）減數(shù)分裂期的分子細胞學研究

汪格格 邱詩蕊 張琳晗 楊國偉 徐小云 汪愛羚 曾淑華 劉雅潔

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 610000；2. 四川中煙工業(yè)有限責任長城雪茄廠，德陽 618400）

煙草屬（Nicotiana）有75 個種，包括11 個四倍體種、33 個二倍體種和31 個非整倍體種［1］。其中，普通煙草是種植最廣泛、影響力最大的栽培煙草，利用遠緣雜交將二倍體野生煙草中的優(yōu)秀性狀導入栽培煙草，將為栽培煙草品種改良創(chuàng)建資源材料。

目前，已報道的普通煙草種間雜種至少有400多種，有16 例利用煙草種間的基因轉(zhuǎn)移和基因滲入進行煙草改良的成功實例［2］，例如，利用種間雜交將抗煙草花葉病毒的N 基因從野生煙草Nicotiana glutinosa成功轉(zhuǎn)移到栽培煙草中，育成的抗性栽培煙草品系是目前最重要的花葉病病毒病抗性資源。利用多種野生煙草細胞質(zhì)和栽培煙草細胞核的胞質(zhì)不育，創(chuàng)建了目前生產(chǎn)上廣泛使用的雄性不育系類型，為雜交種的制備提供便利［3］。然而，遠緣雜交種染色體配對異常和非同源染色體互作引起減數(shù)分裂紊亂和染色體失衡，產(chǎn)生非對稱和非整倍體配子，極大降低了遠緣雜種早期世代的育性［4］，部分雜種可以通過大量的回交以恢復育性，但仍有超過60 個煙草種間無法產(chǎn)生子代。

異源種間雜種的減數(shù)分裂研究主要集中在減數(shù)分裂行為異常觀察，包括減數(shù)分裂不同步、部分同源配對、不減數(shù)配子的產(chǎn)生、微核和多分孢子等。Risso-Pascotto 等［5］發(fā)現(xiàn)Brachiaria ruziziensis和Brachiaria brizantha種間三倍體雜種的減數(shù)分裂從中期I 到末期II 過程中發(fā)現(xiàn)了來自雙親基因組的不同步行為。Wang 等［6］在海甘藍和甘藍型油菜的屬間體細胞雜種的花粉母細胞中，通過基因組原位雜交方法檢測到了海甘藍染色體和甘藍型油菜染色體之間的部分同源配對。徐利遠等［7］利用甘藍型油菜品種奧羅和藍花子雜交獲得雜種F1，發(fā)現(xiàn)在雜種花粉母細胞減數(shù)分裂終變期，存在一種染色體不配對的減數(shù)分裂類型，這一類型能產(chǎn)生少量未減數(shù)配子。羅向東等［8］在野黃瓜與栽培黃瓜種間雜種雄配子減數(shù)分裂末期中發(fā)現(xiàn)，4 個染色體子群和早期落后的染色體周圍逐漸形成細胞壁，產(chǎn)生不同類型的多分孢子體。Binsfeld 等［9］在向日葵的種間雜種的減數(shù)分裂中觀察到一些落后的染色體濃縮，進而形成四分體中的微核，這些微核會形成小的不育花粉粒。

正常配子形成過程中，減數(shù)分裂只進行一次DNA 復制，進行2 次染色體分離［10］。目前許多減數(shù)分裂相關(guān)的基因已經(jīng)被鑒定出。細胞周期蛋白CYCA1，2/TAM/SDS 調(diào)控減數(shù)分裂前期CO 結(jié)構(gòu)的形成并且能抑制減數(shù)分裂I 的退出，其功能缺失導致減數(shù)分裂缺陷［11］。細胞周期蛋白激酶CDKA1控制減數(shù)分裂時染色體聯(lián)會和二價體形成。此外，DNA 重組酶DMC1 在減數(shù)分裂I 后期的DNA 雙鏈斷裂（DSB）形成后，介導同源重組中的IH DNA 修復。外層動粒核心組份MIS12 影響著動粒復合體的裝配及染色體與紡錘體微管的正確連接［12］。著絲粒組蛋白H3（CENH3，在人類中稱為CENP-A）通過招募大量的動粒蛋白，介導減數(shù)分裂I 后期的同源染色體分離［13］，其功能缺失導致減數(shù)分裂的著絲粒行為異常。這些減數(shù)分裂相關(guān)基因的動態(tài)平衡共同保證了減數(shù)分裂的有序進行，而種間雜種中這種平衡被打破，如油菜異源三倍體中負責同源重組配對的基因被下調(diào)表達［14］。

雖然關(guān)于減數(shù)分裂細胞學方面的研究較多，但種間雜種減數(shù)分裂相關(guān)的分子和細胞學調(diào)控機制仍有待研究。

本研究利用普通煙草栽培種K326（2n=48,SSTT）為母本，煙草野生種林煙草Q67（2n=24, SS）為父本進行遠緣雜交獲得異源三倍體SST，通過觀察花粉母細胞減數(shù)分裂過程、染色體行為及其育性水平，找尋普通煙草-林煙草三倍體育性障礙的細胞學原因。并通過分析減數(shù)分裂相關(guān)基因表達水平變化，從分子遺傳角度判斷其減數(shù)分裂異常原因，為后續(xù)探尋異源種間雜種減數(shù)分裂異常的遺傳學機制提供思路，為利用遠緣雜交改良栽培煙草品質(zhì)和抗性提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料為普通煙草栽培種K326（Nicotiana tabacumL.cv.K326，4n=48）和林煙草（Nicotiana sylvestriscv.Q67, 2n=24）。林煙草由四川省煙草科學研究所提供，普通煙草K326 由四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院提供。

1.2 方法

1.2.1 雜交種獲得及體細胞染色體計數(shù) 以林煙草Q67 和普通煙草K326 為父母本雜交，得到雜種F1的種子。光照培養(yǎng)箱（25℃）中水培后取長度約0.5 cm 的根尖，用0.002 mol/L 的8-羥基喹啉處理24 h后轉(zhuǎn)移至卡諾固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）固定。用酸解法處理根尖，并用壓片法制片后顯微觀察。

1.2.2 花粉育性調(diào)查 采用醋酸洋紅染色法調(diào)查花粉育性。取花朵未散粉花藥于37℃處理12-24 h，待花粉散出后制片觀察。統(tǒng)計可育花粉粒以及不可育花粉粒的數(shù)目，計算百分比，并保證每個材料統(tǒng)計的花粉數(shù)目不低于600 個。

花粉育性（%）=可育花粉數(shù)/（可育花粉數(shù)+不可育花粉數(shù)）×100%

1.2.3 異源三倍體減數(shù)分裂行為觀察 將花蕾置于卡諾固定液中處理24 h，再轉(zhuǎn)入70%乙醇中4℃保存?；ㄋ幪幚硗?，經(jīng)卡寶品紅染色，壓片法制片后置于顯微鏡下觀察減數(shù)分裂過程并拍照統(tǒng)計異常分裂相。

1.2.4 基因組原位雜交（GISH） 隨機引物法標記探 針，使 用Invitrogen 公 司BioPrime?DNA Labeling System 試劑盒，以2.5 μg 林煙草Q67 基因組DNA 為模板，按照試劑說明制成探針；隨后繼續(xù)制備封阻DNA，將提取的普通煙草K326 DNA 置于沸水浴中處理30 min，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段長度，100-500 bp 長度內(nèi)可作封阻DNA。

酶混合液中酶的成分和濃度為4%纖維素酶、2%果膠酶、1%蝸牛酶，酶解時間90-120 min。具體操作方法參照文獻［15］。Olympus CX 31 熒光顯微鏡下觀察拍照，Adobe Photoshop（2020）軟件合成圖像。

1.2.5 實時定量PCR 提取普通煙草K326、林煙草Q67 及兩者種間異源三倍體雜種總RNA，提取材料為成熟期處于減數(shù)I 中期至減數(shù)II 末期的花蕾，重量大于0.1 g。所用耗材經(jīng)DEPC 處理，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR118, TIANGEN）按照試劑說明合成第一鏈cDNA，以ACTIN為內(nèi)參基因，利用實時定量試劑盒（FP205, TIANGEN）進行RT-qPCR，反應(yīng)程序為95℃ 15 min；94℃ 10 s，60℃ 20 s，40 個循環(huán)（表1）。

表1 RT-qPCR 所用引物Table 1 Primers used in RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 異源三倍體SST的細胞學鑒定

以普通煙草K326（SSTT, 4n=48）為母本，以林煙草（SS, 2n=24）為父本，雜交獲得117 個單株，根尖染色體計數(shù)結(jié)果表明，染色體條數(shù)為36 條的種間雜種（SST）共計68 株（表2，圖1），占比58.12%；根尖染色體條數(shù)27-34 條的單株34 個，占29.06%，包括部分多次統(tǒng)計染色體條數(shù)不一致的單株及未能成功統(tǒng)計染色體條數(shù)的單株；染色體條數(shù)為48 條的植株共計15 株，占12.82%，推測可能為雜交過程中花粉污染所致。選取染色體條數(shù)為36 的單株編號后盆栽，用于后續(xù)試驗。

表2 雜交后代染色體條數(shù)統(tǒng)計Table 2 Chromosome number statistics of hybrid off spring

圖1 種間雜種染色體計數(shù)Fig. 1 Chromosome number of the allotriploid hybrids

對染色體條數(shù)為36 條的種間雜種體細胞進行基因組原位雜交分析（圖2），在種間雜種的36 條染色體中，有24 條染色體可被S 基因組探針標記，表明種間雜種的染色體組成為SST，進一步證實種間雜種為異源三倍體。

圖2 種間雜種體細胞原位雜交Fig. 2 GISH analysis of allotriploid hybrids

表型統(tǒng)計結(jié)果（圖3）表明，體染色體條數(shù)為36 的種間雜種的株高、葉片數(shù)、最大葉長葉寬、花冠長寬、花色均介于雙親之間，方差分析結(jié)果（表3）表明，種間雜種在苗期和成熟期的葉柄型態(tài)與母本K326 相似，葉色和葉型介于雙親之間，葉型呈長橢圓狀與K326 類似，葉尖漸圓類似林煙草?；ü谡w型態(tài)和顏色偏向K326，但是花冠長度介于雙親之間。全部種間雜種F1（2n=36）的型態(tài)表現(xiàn)幾乎一致，均兼?zhèn)潆p親的多個典型表型特征，表型結(jié)果驗證其為雜種。

表3 種間雜種及其親本植株形態(tài)特征比較Table 3 Morphological characteristics comparison between the allotriploid and parents

圖3 種間雜種及其親本形態(tài)學比較Fig. 3 Morphological characteristics of allotriploid hybrids and parents

2.2 異源三倍體SST的花粉育性鑒定

利用醋酸洋紅染色統(tǒng)計體染色體條數(shù)為36 的種間雜種的花粉可染性，結(jié)果表明，種間雜種的花粉大多數(shù)著色淺、干癟，花粉粒直徑小于兩親本，正常染色的花粉數(shù)量少僅為11.05%，遠低于雙親（表4 和圖4），其中，包括1.28%的超大可染花粉粒（花粉直徑為其余花粉粒直徑的1.5 倍以上），推測其為未減數(shù)配子。由此推測種間雜種雄配子發(fā)育異常，但少量的可染花粉仍具備一定能力的育性。

表4 種間雜種及其親本花粉育性統(tǒng)計Table 4 Pollen fertility of the allotriploid, BC1 and parents

圖4 種間雜種及其親本花粉育性Fig. 4 Pollen fertility of the allotriploid and parents

2.3 異源三倍體SST減數(shù)分裂行為觀察

利用涂片法觀察花粉母細胞（PMCs）的減數(shù)分裂行為，體細胞染色體條數(shù)為36 的種間雜種減數(shù)分裂異常的細胞占統(tǒng)計總量的29.26%（圖5-圖6 和表5-表7）。觀察到的減數(shù)分裂異常行為包括板外染色體（減數(shù)I 中期、減數(shù)II 中期）、染色體橋（減數(shù)II 前期和中期）、滯后染色體（減數(shù)I 后期、減數(shù)II 后期）、微核（減數(shù)II 末期）（圖5），其中減數(shù)分裂I 和減數(shù)分裂II 中期的異常細胞頻率最高，分別達到異常細胞總數(shù)中的29.52%和36.17%（表5）。此外，在減數(shù)第一次分裂前期，觀察到種間雜種的部分PMCs 的同源染色體在偶線期并未完全聯(lián)會（圖5-a 和圖5-b）。

表5 種間雜種SST 減數(shù)分裂進程的異常染色體行為Table 5 Abnormal chromosome behavior during the meiosis of the F1 SST

對減數(shù)分裂I 和減數(shù)分裂II 中期染色體落后的統(tǒng)計結(jié)果表明，T 染色體組的染色體在減數(shù)分裂中期更易出現(xiàn)板外分布。減數(shù)分裂I 和減數(shù)分裂II 中期落后染色體條數(shù)分布在1-3 條間，其中，落后2條染色體的異常細胞均最多，在2 個時期分別占比51.35%和59.56%（表6 和圖6）。GISH 分析結(jié)果顯示，種間雜種減數(shù)分裂I 和減數(shù)分裂II 中期的異常細胞中58.18%和52.94%的落后染色體來源于T 染色體組，23.64%和25.00%異常細胞的落后染色體來源于S 染色體組，14.55%和17.65%異常細胞的落后染色體來源于S 和T 染色體組（表7 和圖6）。

表7 落后染色體來源的 GISH 分析結(jié)果Table 7 GISH statistics of lagging chromosomes composition

圖6 種間雜種減數(shù)分裂原位雜交Fig. 6 GISH analysis of allotriploid hybrids

減數(shù)分裂I 后期和減數(shù)分裂II 后期及末期的統(tǒng)計結(jié)果表明，落后染色體和不均等分離同時出現(xiàn)，但分離后的染色體組成仍接近2∶1（S∶T）。減數(shù)分裂I 后期的主要異常為不均等分離，占到該時期異常細胞總數(shù)的77.42%，且落后一條分離比為17∶18 的類型最多，占該時期不均等分離細胞中的29.17%，不均等分離后的染色體組成大多呈現(xiàn)S∶T=2∶1 的比例，與體細胞SST 的染色體組成基本一致，統(tǒng)計到的分離比如（11S+7T）:（13S+4T）（包含1 條落后染色體）、（13S+8T）∶（11S+4T）、（14S+7T）∶（10S+5T）等（表6）。減數(shù)分裂II 末期觀察到占比較少的微核形成（圖5-g），推測其為不均等分離或者落后染色體的導致。

表6 種間雜種SST 減數(shù)分裂進程的染色體具體行為Table 6 Chromosome behavior of interspecific hybrids SST during meiosis

圖5 種間雜種、K326 減數(shù)分裂Fig. 5 Meiosis of the allotriploids hybrid and K326

2.4 異源三倍體STO減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達分析

按花蕾長度對減數(shù)分裂前期I 和減數(shù)分裂I 中期-減數(shù)分裂II 末期的花蕾進行分別取材，分析2 份花蕾中減數(shù)分裂相關(guān)基因（DMC1、CENH3、CDKA、CYCA和MIS12）表達水平變化，結(jié)果（圖7-A）顯示，種間雜種在減數(shù)分裂I 前期，除來源于S 染色體組的CDKA:5319表達顯著上調(diào)和CYCA:6720表達極顯著上調(diào)，其余基因均極顯著下調(diào)表達，其中，包括中前期聯(lián)會復合體組成相關(guān)基因DMC1，以及著絲粒相關(guān)基因MIS12和CENH3，其相對K326 極顯著下調(diào)，與細胞學同源染色體聯(lián)會異常的結(jié)果表現(xiàn)一致，缺乏MIS12表達產(chǎn)物致使紡錘體微管缺乏張力，導致錯誤的染色體行進方向。且MIS12 作為動粒外層蛋白復合物，需要與CENH3 協(xié)作以發(fā)揮其功能［12］。著絲粒相關(guān)基因的表達異?？赡苁菍е虏痪确蛛x和落后染色體的原因。

種間雜種在減數(shù)分裂I 中期至減數(shù)分裂II 末期，相較于對照，除了MIS12和來自于T 染色體組的CDKA:0239無顯著變化，其余基因（CENH3、CDKA:5319、CYCA:0111和CYCA:6720）均呈顯著或極顯著上調(diào)（圖7-B）。其中，包括來源于S 基因組的CDKA:5319，這可能影響同源染色體重組頻率，從而影響配子的形成；以及來源于S 和T 基因組的CYCA，表示三倍體減數(shù)分裂的周期轉(zhuǎn)換可能出現(xiàn)異常，導致周期過程中精準有序的進程被打亂，造成大量的減數(shù)分裂異常表現(xiàn)。

圖7 減數(shù)分裂相關(guān)基因在異源三倍體及親本K326 中的差異表達Fig. 7 Differential expressions of meiosis related genes in allotriploid and parent tobacco K326

3 討論

異源多倍體植物，由于受到雜合性和多倍性因素的雙重影響，其減數(shù)分裂過程往往具有非常復雜的染色體行為［16-19］。Li 等［20］在對種間雜種油茶的研究發(fā)現(xiàn)，種間雜種減數(shù)分裂過程明顯異常，頻繁出現(xiàn)染色體橋和落后染色體。王玉蛟等［21］研究表明，種間雜種芍藥花粉母細胞存在單價體、三價體、不均等分離等異常，導致最終形成二分體或三分體。本研究發(fā)現(xiàn)種間雜種的PMCs 減數(shù)分裂進程中存在很多減數(shù)分裂異常現(xiàn)象，可以歸為聯(lián)會異常、落后染色體、染色體不均等分離、染色體橋和微核。落后染色體在種間雜種減數(shù)分裂異常情況中均占比最大，這些落后的染色體造成遺傳物質(zhì)增多或減少，隨著分裂的進行或丟失，或在減數(shù)分裂末期形成微核，使孢子的育性降低。這些減數(shù)分裂異常的細胞都導致了不育配子的產(chǎn)生，但這些異常現(xiàn)象并不是孤立存在的，它們在不同的時期出現(xiàn)并且相互關(guān)聯(lián)，導致了種間雜種的大部分孢子中遺傳物質(zhì)的不均衡，最終形成不育配子，從細胞學的角度解釋了種間雜種高度不育的原因。此外，這些異常的出現(xiàn)伴隨著染色體片段缺失、臂內(nèi)倒位等變異，這些變異也造成了種間雜種植株的性狀改變。種間雜種的GISH分析結(jié)果顯示，在2 次減數(shù)分裂中出現(xiàn)最多攜帶落后染色體的情況，其落后的染色體都來自T 基因組。推測S 基因組染色體能夠基因組內(nèi)正常配對，而T基因組染色體極少形成基因組間和基因組內(nèi)配對，導致T 基因組染色體落后。出現(xiàn)染色體橋即說明同源染色體和異源染色體發(fā)生配對，進而導致后代遺傳物質(zhì)交換和更激烈的遺傳變化。

為進一步探索種間雜種育性下降以及植株高度不育的原因，本研究對異源三倍體SST 進行了減數(shù)分裂相關(guān)基因表達量的分析。對異源三倍體SST 中減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達量進行分析發(fā)現(xiàn)，在減數(shù)第一次分裂前期，種間雜種的DMC1表達量低于同期K326 的表達量，從基因表達的層面解釋了種間雜種和回交子代在偶線期聯(lián)會異常。MIS12 作為動粒外層蛋白復合物，需要與CENH3 協(xié)作以發(fā)揮其功能［17］，而種間雜種在減數(shù)分裂I 中期至減數(shù)第二次分裂末期，CENH3和MIS12的表達趨勢均不同步，這可能導致著絲粒組蛋白和動粒蛋白不能同時發(fā)揮作用，最終造成著絲粒功能紊亂，落后染色體的出現(xiàn)即是著絲粒功能紊亂在減數(shù)分裂過程中的具體體現(xiàn)。在減數(shù)分裂I 中期至減數(shù)第二次分裂末期，相較于對照K326，種間雜種F1中來源于T 基因組的CDKA:0239表達被抑制，來源于S 基因組的CDKA:5319和CYCA:6720以及來源于T 基因組的CYCA:0111表達量均顯著上調(diào)，由此從分子的角度推斷種間雜種的細胞周期紊亂，細胞內(nèi)出現(xiàn)染色體不均等分離的現(xiàn)象。盡管關(guān)于煙草異源三倍體的研究已經(jīng)出現(xiàn)了很多，但是將雜交種的減數(shù)分裂行為細胞學研究與減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達水平進行同時研究的報道還不是很多。而本研究通過K326 與林煙草進行遠緣雜交，創(chuàng)建出新的異源三倍體種質(zhì)材料，并對其生長發(fā)育情況、花藥發(fā)育過程、減數(shù)分裂細胞學分析、基因表達分析進行了一系列的相關(guān)研究，討論了雜交過程對其生殖細胞發(fā)育過程的影響，對研究種間雜交異源多倍體材料的遺傳穩(wěn)定性提供了一定的參考，后續(xù)可應(yīng)用到包括煙草在內(nèi)的多種作物的研究和遺傳改良中。雖然種間雜種煙草目前在生產(chǎn)栽培上尚未體現(xiàn)出直接的應(yīng)用價值，但種間雜種可以通過與其他倍性作物的雜交創(chuàng)建異附加系、異代換系等遺傳材料，并能夠以種間雜種為中間橋梁挖掘祖先種中優(yōu)秀遺傳資源培育新的材料。比如利用人工合成的種間雜種植物材料已經(jīng)創(chuàng)建出了野油菜-芥藍［22］、白菜型油菜-甘藍頭狀花序［23］、甘藍型油菜-菘藍［24］以及抗白粉病小麥-黑麥6R［25］等單體異附加系和二體異附加系，進而研究基因組之間的親緣關(guān)系和基因表達。

4 結(jié)論

以林煙草為父本、普通煙草為母本進行種間雜交獲得68 株異源三倍體雜種，其體染色體為36 條，染色體組成為SST，種間雜種單株間表型相似，其株高、葉片數(shù)、最大葉寬葉長、花冠長度、花色兼具雙親特征，可育花粉僅有11.05%。種間雜種的花粉母細胞減數(shù)分裂期異常細胞占比為29.26%，主要異常行為為減數(shù)分裂I 和II 中期的T 染色體組來源的染色體滯后，落后染色體條數(shù)為1-3 條，其中，減數(shù)分裂I 中期和II 中期落后類型最多的分別為落后1 條T 染色體和落后2 條T 染色體的細胞；減數(shù)分裂I 后期和減數(shù)分裂II 后期及末期的異常類型主要為不均等分離、落后染色體和微核，其中減數(shù)分裂I 后期統(tǒng)計到多種異常分離比，但分離后染色體組成仍接近2∶1（S∶T）。減數(shù)分裂相關(guān)基因的調(diào)控功能紊亂和缺失均會導致減數(shù)分裂的異常最終影響植株的育性。