李璟依,張慧云,何韶衡,孫健

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種與過(guò)敏相關(guān)的常見(jiàn)慢性復(fù)發(fā)性皮膚病。根據(jù)血清總IgE水平和是否具有特異性IgE，AD可以分成內(nèi)源性AD(iAD)和外源性AD(eAD)兩種類型。嗜堿性粒細(xì)胞通過(guò)抗原呈遞、Th2型免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和維持以及分泌細(xì)胞因子等多種途徑參與過(guò)敏性疾病的發(fā)生。有研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，在特應(yīng)性皮炎患者的病變組織尤其是斑貼試驗(yàn)測(cè)試部位，存在著嗜堿性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且AD患者皮膚中嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量顯著升高[3]。另外，AD患者外周血中存在特異性IgE介導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞激活[4]，這些研究提示嗜堿性粒細(xì)胞參與了AD的發(fā)生發(fā)展。

CD63是一種溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP)，早在1991年CD63就被發(fā)現(xiàn)與嗜堿性粒細(xì)胞激活有關(guān)，且可以作為嗜堿性粒細(xì)胞激活的標(biāo)記物[5]。CD203c是一種糖基化Ⅱ類跨膜分子，又稱為外核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶3(NPP3)，常表達(dá)于肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞表面[6]。作為嗜堿性粒細(xì)胞的激活標(biāo)記物，CD203c具有比CD63更高的敏感性[7]。FcεRI即高親和力IgE受體，在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上表達(dá)，通過(guò)抗原交聯(lián)特異性IgE誘導(dǎo)細(xì)胞活化[8]。流式細(xì)胞術(shù)分析時(shí)常用的指標(biāo)有百分比和平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)，與傳統(tǒng)的百分比門控策略相比，使用MFI進(jìn)行分析是一種更敏感和可靠的方法[9]。目前，對(duì)于特應(yīng)性皮炎患者外周血嗜堿性粒細(xì)胞上CD63、CD203c和FcεRI表達(dá)的研究較少，且尚未有研究對(duì)于內(nèi)、外源性AD嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)水平進(jìn)行比較。本研究運(yùn)用CCR3+CD123+HLA-DR-標(biāo)記嗜堿性粒細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)源性AD(intrinsic atopic dermatitis,iAD)、外源性AD(extrinsic atopic dermatitis,eAD)嗜堿性粒細(xì)胞表面CD63、CD203c和FcεRI的表達(dá)，探討外周血嗜堿性粒細(xì)胞尤其是其表面CD63、CD203c和FcεRI表達(dá)與不同類型特應(yīng)性皮炎的關(guān)系，希望能為AD的診斷和治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 APC偶聯(lián)抗人CCR3抗體、FITC偶聯(lián)抗人CD123抗體、APC/Cy7偶聯(lián)抗人HLA-DR抗體、PE/Cy7偶聯(lián)抗人CD63抗體、PE偶聯(lián)抗人CD203c抗體、PerCP偶聯(lián)FcεRI抗體、FcR阻斷劑、紅細(xì)胞裂解液、FACSVerse流式細(xì)胞儀等購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。PBS緩沖液購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司。

1.2研究對(duì)象 選取2021年4月-2021年12月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的AD患者36例(表1)，其中內(nèi)源性AD患者18例、外源性AD患者18例，并招募20例健康人(healthv control,HC)作為對(duì)照組。AD患者診斷符合特應(yīng)性皮炎Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)，且要求所有AD患者至少2周前停止服用抗過(guò)敏藥物。本研究獲得了錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，志愿者均簽訂了知情同意書。

表1 志愿者的一般資料Tab.1 General information of the volunteers

1.3研究方法 對(duì)每位研究對(duì)象采集4 mL外周血，置于含EDTA抗凝劑的采血管中。1 200 r/min離心血液10 min，抽出血漿后補(bǔ)充1640培養(yǎng)基。加入5 μL FITC-CD123、APC-CCR3、APC/Cy7-HLA-DR標(biāo)記嗜堿性粒細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)管加入5 μL PE/Cy7-CD63、PE-CD203c和PerCP-FcεRI，同型管加入相應(yīng)的同型抗體；室溫避光孵育15 min；加入1.5 mL紅細(xì)胞裂解液，吹打混合，室溫下避光孵育12 min；1 200 r/min離心6 min，棄去紅色上清液；加入1 mL 1×PBS，混合后再次以1 200 r/min離心6 min，棄去上清液；加入200 μL PBS，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件分析結(jié)果。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AD患者嗜堿性粒細(xì)胞富集群(設(shè)門方法見(jiàn)圖1)。

圖1 嗜堿性粒細(xì)胞富集群的設(shè)門方法Fig.1 Gating strategies of basophil-enriched cells

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS23.0分析數(shù)據(jù)。本研究數(shù)據(jù)屬于非正態(tài)計(jì)量資料，采用中位數(shù)(M)和四分位間距(IQR)表示，使用非參數(shù)檢驗(yàn)Manner-Whitney進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)界值為1.96。

2 結(jié)果

2.1AD患者外周血嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)結(jié)果 AD患者粒細(xì)胞群中嗜堿性粒細(xì)胞MFI較健康對(duì)照組增加了2.5倍(Z=-6.156，P<0.01，圖2a)，內(nèi)源性AD組與外源性AD組的嗜堿性粒細(xì)胞MFI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各型AD患者嗜堿性粒細(xì)胞比例與健康組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

MFI expression in granulocyte population of basophils between groups；MFI expression in granulocyte population of CD63+ basophils between groups；Percentage of CD63+ basophils in the mononuclear cell population between groups圖2 各組間嗜堿性粒細(xì)胞和CD63+嗜堿性粒細(xì)胞在粒細(xì)胞群和單個(gè)核細(xì)胞群中的表達(dá)比較Fig.2 Comparison of the expression of basophils and CD63+ basophils in the granulocyte population and the mononuclear cell population between groups

表2 各組嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)水平比較 [M(IQR)]Tab.2 Comparison of basophil expression levels between groups [M (IQR)]

2.2AD患者外周血CD63+嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)水平 AD患者粒細(xì)胞群中CD63+嗜堿性粒細(xì)胞MFI較對(duì)照組升高了34%(Z=-2.249，P<0.05，圖2b)，且AD患者單個(gè)核細(xì)胞群中CD63+嗜堿性粒細(xì)胞比例較健康對(duì)照組增加了23%(Z=-3.688，P<0.01，圖2c)，不同分型AD患者間CD63+嗜堿性粒細(xì)胞的比例和MFI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 各組CD63+嗜堿性粒細(xì)胞比較 [M(IQR)]Tab.3 Comparison of CD63+ basophils between groups [M(IQR)]

2.3AD患者外周血CD203c+嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)水平 與健康對(duì)照組相比，AD患者的CD203c+嗜堿性粒細(xì)胞MFI在粒細(xì)胞群中升高了23%(Z=-2.112，P<0.05，圖3a)、在單個(gè)核細(xì)胞群中升高了2%(Z=-2.061，P<0.05，圖3b)，且AD患者外周血粒細(xì)胞群中CD203c+嗜堿性粒細(xì)胞比例升高了4.8倍(Z=-4.925，P<0.01，圖3c)，但內(nèi)、外源性AD患者之間在外周血CD203c+嗜堿性粒細(xì)胞的比例和MFI上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

MFI expression in granulocyte population of CD203c+ basophils between groups；Percentage of CD203c+ basophils in the granulocyte population between groups；MFI expression in mononuclear cell population of CD203c+ basophils between groups圖3 各組間CD203c+嗜堿性粒細(xì)胞在粒細(xì)胞群和單個(gè)核細(xì)胞群中的表達(dá)比較Fig.3 Comparison of the expression of CD203c+ basophils in the granulocyte population and themononuclear cell population between groups

表4 各組CD203c+嗜堿性粒細(xì)胞比較 [M(IQR)]Tab.4 Comparison of CD203c+ basophils between groups [M(IQR)]

2.4AD患者外周血FcεRI+嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)水平 AD患者外周血粒細(xì)胞群FcεRI+嗜堿性粒細(xì)胞比例較健康對(duì)照組升高了6.3倍(Z=-4.694，P<0.01，圖4)，AD及其不同分型FcεRI+嗜堿性粒細(xì)胞MFI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且內(nèi)、外源性AD患者外周血FcεRI+嗜堿性粒細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表5。

表5 各組FcεRI+嗜堿性粒細(xì)胞比較 [M(IQR)]Tab.5 Comparison of FcεRI+ basophils between groups [M(IQR)]

圖4 各組FcεRI+嗜堿性粒細(xì)胞在粒細(xì)胞群中百分比的流式代表圖Fig.4 Flow cytometric representation of the percentage of FcεRI+ basophils in each group of granulocyte populations

3 討論

特應(yīng)性皮炎可分為外源性AD和內(nèi)源性AD兩種類型，其中內(nèi)源性AD血清IgE水平正常且沒(méi)有特異性IgE致敏，外源性AD則表現(xiàn)為血清總IgE水平升高且具有特異性IgE致敏[10]。外源性AD患者常表達(dá)高水平的Th2型細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5和IL-13[11]，并且具有更明顯的嗜酸性粒細(xì)胞升高傾向[12]。而內(nèi)源性AD更傾向于表達(dá)高水平的Th17和 Th22 型細(xì)胞因子[13]。另外，在血漿氨基酸代謝方面，急性發(fā)作期外源性AD與內(nèi)源性AD在組氨酸代謝通路上具有顯著差異，具體體現(xiàn)為內(nèi)源性AD的組氨酸代謝水平低[14]。在本研究中，并未發(fā)現(xiàn)內(nèi)、外源性AD在外周血嗜堿性粒細(xì)胞及其激活物標(biāo)志上有差異，這提示嗜堿性粒細(xì)胞作為過(guò)敏反應(yīng)的初級(jí)效應(yīng)細(xì)胞，在內(nèi)源性AD和外源型AD的發(fā)病過(guò)程中都起作用。

目前認(rèn)為，AD與免疫失衡、皮膚屏障功能紊亂、皮膚菌群異常等因素密切相關(guān)。嗜堿性粒細(xì)胞在AD的免疫失衡中發(fā)揮重要作用，在特應(yīng)性皮炎小鼠模型中，IL-4表達(dá)水平升高[15]，嗜堿性粒細(xì)胞是皮膚中IL-4的初始和主要來(lái)源[16-17]，嗜堿性粒細(xì)胞來(lái)源的IL-4對(duì)ILC2的增殖至關(guān)重要，它可以誘導(dǎo)ILC2激活和AD樣皮膚炎癥[2]。

CD63和CD203c是目前評(píng)估嗜堿性粒細(xì)胞活化的常用標(biāo)志物[18-19]。CD203c和CD63在嗜堿性粒細(xì)胞活化早期就可以受到FcεRI介導(dǎo)的反應(yīng)上調(diào)，在嗜堿性粒細(xì)胞活化晚期也受細(xì)胞因子介導(dǎo)從而發(fā)揮作用[20]。在20世紀(jì)90年代早期，CD63的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了利用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)嗜堿性粒細(xì)胞的過(guò)敏原特異性激活技術(shù)的發(fā)展[21]。在嗜堿性粒細(xì)胞活化時(shí)，處于胞內(nèi)顆粒中的CD63會(huì)隨著胞吐作用高表達(dá)于細(xì)胞表面，這一特性使CD63可以表示嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒。本研究發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血嗜堿性粒細(xì)胞CD63的表達(dá)增強(qiáng)，這提示嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒參與了AD發(fā)病。在血細(xì)胞中，CD203c只在嗜堿性粒細(xì)胞上恒定表達(dá)，這使它可以作為嗜堿性粒細(xì)胞的激活標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn)，AD患者CD203c+嗜堿性粒細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，與Wang等[22]的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了激活的嗜堿性粒細(xì)胞參與AD發(fā)病這一假設(shè)。FcεRI在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上表達(dá)，受到抗原刺激時(shí)，細(xì)胞表面的FcεRI會(huì)與IgE交聯(lián)形成復(fù)合物導(dǎo)致細(xì)胞活化[23]，可作為細(xì)胞致敏的標(biāo)記物，已有研究[24]發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出特應(yīng)性的慢性蕁麻疹患者其FcεRI水平顯著升高。本研究觀察到，AD患者FcεRI+嗜堿性粒細(xì)胞比例較健康對(duì)照升高，提示處于致敏狀態(tài)的嗜堿性粒細(xì)胞在AD發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。

總之，AD發(fā)病原因復(fù)雜，本研究發(fā)現(xiàn)AD嗜堿性粒細(xì)胞及其表面CD63、CD203c和FcεRI表達(dá)上調(diào)，提示活化的嗜堿性粒細(xì)胞及其表面CD63、CD203c和FcεRI參與AD的進(jìn)程，檢測(cè)嗜堿性粒細(xì)胞及其相關(guān)分子對(duì)診斷AD具有一定意義，未來(lái)可考慮研發(fā)嗜堿性粒細(xì)胞活化的阻斷劑從而治療AD。