不同載體菌肥對(duì)刺槐光合特性及土壤養(yǎng)分、細(xì)菌群落的影響

楊 皓 莊家堯 鄭 康 孫永濤

（1南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2國家林業(yè)和草原局華東調(diào)查規(guī)劃院，浙江 杭州 310019）

刺槐（Robinia pseudoacaciaL.）又名洋槐，是豆科刺槐屬植物，多年生落葉喬木，原產(chǎn)于北美，17 世紀(jì)初被引入歐洲，20 世紀(jì)初出現(xiàn)在我國。據(jù)調(diào)查，我國已有15 個(gè)省市將刺槐列入主要造林樹種名冊，并開展人工林種植，至今全國種植面積已超過100 萬公頃［1］。刺槐作為主要的生態(tài)防護(hù)林造林樹種，在西北黃土區(qū)和北方土石山區(qū)種植尤為廣泛，對(duì)林地土壤具有較明顯的改良作用，可以很好地發(fā)揮生態(tài)效益［2］。刺槐本身也是很好的天然能源供給者，其根系形成的根瘤是天然的氮肥，可以極大增加土壤中的氮含量。同時(shí)，含氮量豐富的葉片分解后進(jìn)入土壤也可促使土壤有機(jī)質(zhì)含量增加，促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)［3］。

然而，隨著近年來經(jīng)濟(jì)社會(huì)的高速發(fā)展，大量化肥和農(nóng)藥的施用致使土壤退化，生態(tài)系統(tǒng)受到干擾，不可避免地造成了生態(tài)負(fù)荷，土壤微生物群落失衡，一些土傳病菌如鐮刀菌、疫霉菌滋生，危害著植物的健康［4-5］。低質(zhì)低效林的出現(xiàn)既降低了土壤肥力對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的有益調(diào)控作用，又影響生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益的發(fā)揮，從而制約了農(nóng)林業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。國家對(duì)生態(tài)環(huán)境建設(shè)的日益重視大力推動(dòng)了新型肥料的發(fā)展［6］。微生物菌肥兼具功能完備、成本低廉和環(huán)保的優(yōu)良屬性，可通過自身生命活動(dòng)過程中分泌有利于植物生長的物質(zhì)來增加植物肥效，提高植物的生長速度和發(fā)育水平，提升品質(zhì)，改良土壤性質(zhì)，對(duì)于減少化肥的施用、實(shí)現(xiàn)土地供肥能力平穩(wěn)化和農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義［7］。

在微生物菌肥的商業(yè)化生產(chǎn)中，載體底物是首先需要考慮的問題。Rebah等［8］研究報(bào)道，高有機(jī)質(zhì)含量、最佳氮含量、呈中性的酸堿度、高持水能力、對(duì)吸附其中的功能微生物生長無抑制作用等因素是優(yōu)秀載體需具備的性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，泥炭是很好的菌肥載體，且在菌肥生產(chǎn)過程中應(yīng)用較多［9］，但因其多位于濕地生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)區(qū)且具備短期不可再生性，若長期開采，勢必消耗生態(tài)資源，破壞生態(tài)平衡［10］。因此尋找其他材料替代泥炭作為菌肥載體投入生產(chǎn)顯得尤為重要。

常見的農(nóng)業(yè)廢棄物有秸稈、果皮殘?jiān)?、甘薯渣、酒糟、玉米渣、麥麩等?1］，不僅營養(yǎng)元素含量豐富，而且具備菌肥載體應(yīng)有的性能，故而在載體應(yīng)用上展現(xiàn)出巨大潛能。Xu 等［12］研究多粘類芽孢桿菌生物肥料時(shí)選用甘薯淀粉生產(chǎn)廢棄物作為載體底物，測得菌肥活菌數(shù)高達(dá)9.7×109CFU·mL-1，實(shí)際噴施于茶樹葉面后，茶葉產(chǎn)量、水提物量、茶多酚含量均比對(duì)照顯著增加16.7%、6.3%、10.4%。Zhu 等［13］用廢蘑菇底物和溶磷微生物制備菌肥，活菌數(shù)達(dá)5.6×108CFU·g-1，并通過盆栽試驗(yàn)證實(shí)其可顯著改善大豆生長性狀。李月等［14］以秸稈和木本泥炭為載體與3 種腐生真菌配制成固體菌肥，并采集江西鷹潭地區(qū)紅壤應(yīng)用于玉米盆栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)植株地上生物量和土壤有效磷含量顯著增多。茍志輝［15］研究證實(shí)，以膨潤土和草炭為載體制成的復(fù)合菌肥可改善油茶生長狀況，提高土壤養(yǎng)分含量及幼苗根際微生物數(shù)量。由此可見，研究不同載體菌肥在刺槐上的應(yīng)用效果，對(duì)減少水土流失、涵養(yǎng)水源、維持生態(tài)系統(tǒng)平衡具有重大戰(zhàn)略意義，對(duì)推動(dòng)我國水土保持現(xiàn)代化建設(shè)進(jìn)程具有重要學(xué)術(shù)價(jià)值。

本研究以不同基質(zhì)（秸稈、麥麩、棉籽殼、豆餅）及其混合配方作為載體底物，設(shè)置泥炭作為對(duì)照，從不同角度分析各個(gè)載體作為菌肥載體的可行程度，并通過盆栽試驗(yàn)研究不同菌肥對(duì)刺槐光合特性、土壤養(yǎng)分及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響，旨在評(píng)估不同載體菌肥在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中的肥效，同時(shí)篩選出在林業(yè)種植實(shí)際應(yīng)用中可有效替代泥炭發(fā)揮肥效的菌肥載體，為植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）菌肥的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)地

供試菌株：溶磷菌粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens N1.14）X-45，南京林業(yè)大學(xué)水土保持實(shí)驗(yàn)室保存菌株（分離自湖南省岳陽市岳陽大道兩側(cè)的裸巖邊坡巖石樣品），具有溶解有機(jī)磷、無機(jī)磷，分泌生長素（indoleacetic acid）的優(yōu)良特性，兼具生長迅速、競爭力強(qiáng)的特點(diǎn)［16］。

培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉5 g，水1 000 mL，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

盆栽試驗(yàn)在江蘇省南京市玄武區(qū)南京林業(yè)大學(xué)新莊校區(qū)教學(xué)九樓中庭進(jìn)行。試驗(yàn)周期為2021年7月至2021年10月。盆栽用土為基質(zhì)土（購自江蘇興農(nóng)科技有限公司，pH 值5.2～6.0，N∶P2O5∶K2O=10∶11∶13），所用花盆為塑料花盆（內(nèi)徑19 cm、外徑21 cm、高19 cm），供試植物為刺槐（刺槐種子購自江蘇岡仁波齊種業(yè)有限公司），補(bǔ)充水分采用稱重法，保證每盆土壤含水量達(dá)到田間持水量的100%，其中7、8 月保證每周補(bǔ)給兩次水分，9、10月保證每周補(bǔ)給一次水分。

1.2 菌肥制備、施用及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將X-45 菌株活化后置于28 ℃培養(yǎng)箱（上海貝茵生物科技有限公司）中培養(yǎng)3 d后，接種于盛有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入30 ℃、200 r·min-1的搖床中培養(yǎng)2 d，測定菌液OD600值為0.814±0.007。菌肥制備參照朱玉［17］的方法：分別稱取不同載體及其配方各100 g于高壓滅菌袋中，置于滅菌鍋（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）內(nèi)，在121 ℃條件下滅菌30 min 后取出，將裝有載體的滅菌袋置于無菌操作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）上冷卻至室溫，加入適量無菌水混合均勻后，加入80 mL 菌液，上下晃動(dòng)使其混勻，封口。在每個(gè)滅菌袋上隨機(jī)扎4個(gè)孔，上述所有操作均在無菌條件下完成。每個(gè)載體處理設(shè)置3 組平行試驗(yàn)。將制備好的菌肥置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，測得菌肥有效活菌數(shù)為≥6億個(gè)·g-1，備用。

選取顆粒飽滿的刺槐種子和菌肥以1∶1 的比例混合，空白對(duì)照組的種子用無菌水拌種，并置于陰涼避光處2 h，使細(xì)菌充分附著在種子表面。

試驗(yàn)共設(shè)置7 個(gè)處理（表1），每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行，播種30 d 后間苗，每盆保留3 株長勢一致且長勢良好的幼苗。

表1 試驗(yàn)處理Table 1 Experimental treatments

1.3 刺槐光合特性參數(shù)的測定

在盆栽種植周期內(nèi)，于10 月份使用LI-6400 便攜式光合儀（美國Li-Cor 公司）測定幼苗的光合參數(shù)，選用LED 紅藍(lán)光源葉室（6400-02B，美國Li-Cor 公司），設(shè)置測定時(shí)的葉室溫度為30±0.6 ℃，葉室相對(duì)濕度為48.19%±4.7%，CO2濃度控制在400 μmol·mol-1，葉室內(nèi)光強(qiáng)設(shè)置為300 μmol·m-2·s-1；隨機(jī)采取植株上中下部位各3 片葉片，取樣時(shí)保證各處理組間取樣葉位一致，采用混合液浸提法［18］測量葉片的葉綠素含量，葉綠素a 和葉綠素b 含量的計(jì)算方法參照張俊逸等［19］的研究。

1.4 土壤理化性質(zhì)測定

于2021年10月8日采集土壤樣品，風(fēng)干后過100目篩用于土壤理化性質(zhì)的測定：pH 值采用mettler toledo pH計(jì)（上海忠赫儀器有限公司）測定（水土比為2.5∶1）；有效磷采用氟化銨-鹽酸浸提法測定；水解氮采用堿解擴(kuò)散法測定；速效鉀采用醋酸銨-原子吸收分光光度計(jì)法測定［20］。

1.5 對(duì)盆栽根際土的高通量測序

采用Illumina 測序平臺(tái)MiSeq 系列測序儀對(duì)細(xì)菌16S rDNA（V5-V7 區(qū)）進(jìn)行高通量測序，所用引物為799F（5＇-AACMGGATTAGATACCCKG-3＇）_1193R（5＇-ACGTCATCCCCACCTTCC-3＇），委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。具體操作如下：使用土壤基因組DNA 提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）提取土壤微生物總DNA，利用NanoDrop 微量分光光度計(jì)（美國賽默飛世爾科技公司）測定其純度，用瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司）測定其完整性。PCR擴(kuò)增體系為50 μL：5×Q5 Reaction Buffer 10 μL，5×Q5 High GC Enhancer 10 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 1.5 μL，10 μmol·L-1上游、下游引物各1.5 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL，模板X 0.05 μL（50 ng），用蒸餾水定容至50 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。使用AMPure XP 磁珠（美國貝克曼庫爾特公司）對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后用Qubit3.0 定量，用TruSeqTM DNA Sample PrepKit 構(gòu)建PE 文庫，根據(jù)Novaseq 6000 的樣品要求規(guī)范化操作后，采用PE250模式上機(jī)測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，采用Origin 2019b 軟件制作圖表，測序結(jié)果使用Qiime、R 語言（vegan 包和psych 包）、Mothur、STAMP 等軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同載體菌肥對(duì)刺槐光合特性的影響

由表2 可知，施用菌肥處理組的凈光合速率與未施肥對(duì)照組相比均有不同程度的提高。其中T3 葉片的凈光合速率最高，是CK 的1.68倍，且與其余處理之間的差異均達(dá)到了顯著水平。復(fù)合載體菌肥（T3、T4、T5）下的凈光合速率值相較于單一載體（T1、T2）均有一定程度提升，表明施用菌肥可有效提升植物的凈光合速率，且復(fù)合菌肥的應(yīng)用效果更明顯。

表2 刺槐葉片的光合特性參數(shù)Table 2 Photosynthetic characteristics of Robinia pseudoacacia leaves

不同載體菌肥施肥處理組刺槐葉片的氣孔導(dǎo)度均顯著高于CK（P＜0.05），且增幅均超過了25%，T3 的氣孔導(dǎo)度最高，分別是CK和T0的1.74和1.37倍，同時(shí)復(fù)合載體菌肥處理組的氣孔導(dǎo)度顯著高于單一載體組，表明復(fù)合載體菌肥的施入能一定程度提高光合作用CO2的供應(yīng)，促進(jìn)蒸騰作用。

不同載體菌肥施肥處理組刺槐葉片的胞間CO2濃度均顯著低于CK，其中以T3 降低程度最明顯，較CK降低了127.33 個(gè)千分點(diǎn)，T1、T2、T4 刺槐葉片的胞間CO2濃度與T0相比無顯著差異，T3、T5顯著低于T0，可見T3降低葉片胞間CO2濃度的效果最明顯。

不同載體菌肥施肥處理組對(duì)刺槐葉片的蒸騰速率有不同程度的提高，其中以T3 提高效果最明顯，分別較CK、T0增加了56.81%、30.46%，除與T5差異不顯著外，與其余處理之間的差異均達(dá)到顯著水平，表明T3植株體內(nèi)發(fā)生的代謝作用更加旺盛，使水分達(dá)到平衡狀態(tài)。

葉綠素含量是評(píng)價(jià)植物光合作用能力和積累干物質(zhì)能力的依據(jù)［21］。由表3可知，不同載體菌肥處理下刺槐葉片的光合色素含量均有不同幅度的提升。除T1外，其余處理下葉綠素a含量較CK和T0均顯著增加，以T3增加最明顯，分別較CK和T0增加了128.53%和59.76%，但與T4、T5之間差異不顯著，表明菌肥的施入能顯著促進(jìn)葉綠素a 含量的增加，且復(fù)合載體菌肥相比單一載體促生效果更顯著。不同處理葉綠素b含量較CK 也有明顯提高，增幅為74.29%～351.43%。T3、T4顯著高于T0，增幅最明顯的仍為T3，分別是CK 和T0 的4.51 和2.41倍，且顯著高于T4。

表3 刺槐葉片的光合色素含量Table 3 Photosynthetic pigment content in Robinia pseudoacacia leaves/（mg·g-1）

綜上，無論是單一載體還是復(fù)合載體菌肥，對(duì)刺槐葉片葉綠素含量均有不同幅度的提高作用?？偟膩砜矗琓3（秸稈∶麥麩=1∶1）處理應(yīng)用效果最佳，說明該處理下刺槐的光能捕捉率和利用率較高，能充分進(jìn)行光合作用。

2.2 不同載體菌肥對(duì)刺槐土壤養(yǎng)分的影響

由圖1-A可知，與未施肥對(duì)照組相比，施肥處理組的土壤pH 值均有不同程度的下降。其中，T1 土壤pH 值與CK 相比表現(xiàn)出顯著差異，所有施肥組與T0 之間的pH 值均無顯著差異，說明施用菌肥可在一定程度上使盆栽土壤酸化，并以秸稈處理酸化程度最顯著。

圖1 菌肥對(duì)土壤pH值和養(yǎng)分含量的影響Fig.1 Effect of bacterial manure on soil pH value and nutrient content

由圖1-B可知，隨著菌肥的施加，各處理下土壤水解氮含量與對(duì)照組相比均有不同程度提升，與CK 相比增加了6.28%～44.93%，與T0 相比增加了3.29%～40.85%，除T1 外，其余施肥處理的水解氮含量均顯著高于T0，其中T4 最高，為714.29 mg·kg-1，分別是CK和T0 的1.45 和1.41 倍，與此同時(shí)，T4、T5 水解氮含量整體顯著高于其余處理，說明施用菌肥能有效改善土壤營養(yǎng)環(huán)境，提高土壤中水解氮的含量，并以復(fù)合載體菌肥應(yīng)用效果更顯著。

由圖1-C可知，除T1外，其余施肥處理組土壤有效磷含量均顯著高于CK和T0，增幅分別為11.14%～43.30%和4.94%～28.04%，其中T5含量最高，為13.75 mg·kg-1，分別是CK 和T0 的1.43 和1.28 倍，T3 次之，含量為13.32 mg·kg-1，T1 最低，僅有10.66 mg·kg-1，同時(shí)，T3、T5 組含量顯著高于其他處理，說明菌肥的施用可以促進(jìn)土壤有效磷的增加，而復(fù)合載體菌肥的應(yīng)用效果相對(duì)更顯著。

由圖1-D 可知，各施肥處理組土壤速效鉀含量較CK 和T0 分別降低了34.59%～64.58% 和17.64%～55.39%，其中T1、T2、T4、T5 組間無顯著差異，T3 速效鉀含量最低，僅為37.06 mg·kg-1，分別為CK 和T0 的35.43%和44.61%，同時(shí)顯著低于其余施肥處理組，表明菌肥的施入能促進(jìn)刺槐對(duì)速效鉀的吸收利用，并以T3應(yīng)用效果最明顯。

綜合所有指標(biāo)，選取肥效更明顯的T3、T4 處理進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 不同載體菌肥對(duì)刺槐根際土微生物群落多樣性的影響

稀釋曲線達(dá)到平臺(tái)期代表著測序數(shù)據(jù)能夠覆蓋微生物群落多樣性，同時(shí)稀釋曲線還能間接反映物種的豐富程度。由圖2 可知，當(dāng)測序數(shù)目達(dá)到20 000 時(shí)細(xì)菌曲線接近平臺(tái)期，即使超出20 000 時(shí)也只能產(chǎn)生較少的分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU），且每個(gè)樣本的OTU 數(shù)目和測序數(shù)目成正比，會(huì)隨之增多，后達(dá)到一定量而趨于平穩(wěn)，說明測序量在20 000時(shí)即可涵蓋絕大多數(shù)微生物，之后測序深度再增加也鮮有新物種出現(xiàn)，測序結(jié)果合理。

圖2 各樣本稀釋曲線Fig.2 Dilution curves of each sample

Alpha 多樣性指局域生境下或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的物種數(shù)目及物種多樣性情況，主要通過Shannon、ACE、Chao1、Simpson 指數(shù)來進(jìn)行分析。由表4 可知，土壤樣本的覆蓋度均超過了99%，可見本研究的檢測結(jié)果基本反映了樣本細(xì)菌群落多樣性的情況，測序結(jié)果合理。Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)結(jié)合可表征微生物的多樣性及均勻度，Shannon指數(shù)越大，代表微生物群落豐富度越大，各物種的分配就越均勻；Simpson 指數(shù)越小，代表物種均勻度越高，多樣性就越低［22］。T4 物種shannon 指數(shù)最高，且與其余兩組的差異不顯著（P＞0.05），表明其豐富度最高；CK Simpson指數(shù)最高，且與其余兩組無顯著差異（P＞0.05），表明其均勻度最高。Sobs指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1 指數(shù)通常用來表征樣本中物種的豐富度，指數(shù)越大，細(xì)菌群落中所含物種的數(shù)量越多，細(xì)菌群落豐富度越大。T4 的Sobs、ACE 和Chao1 指數(shù)顯著高于其余處理，說明其細(xì)菌種類較為豐富。

表4 根際土細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 4 Bacterial community diversity index of rhizosphere soil

2.4 不同載體菌肥對(duì)刺槐根際土微生物群落組成的影響

由圖3 可知，施用不同載體微生物菌肥后，各處理組土壤中細(xì)菌的相對(duì)豐度都發(fā)生了變化。在相對(duì)豐度大于1%的水平上，土壤樣本中的細(xì)菌門主要包括纖維桿菌門（Fibrobacteres）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、衣原體門（Chlamydiae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。其中，Proteobacteria 是所有處理樣本中的優(yōu)勢門類。除此之外，Actinobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes的相對(duì)豐度也相對(duì)較高。與CK 相比，T3 和T4 中Fibrobacteres、Acidobacteria、Chloroflexi 的相對(duì)豐度分別提高了0.11、1.39、0.51 和0.33、1.46、0.40 個(gè)百分點(diǎn)。

圖3 不同處理樣本在門水平上的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria under different treatments in phylum level

在屬水平上，相對(duì)豐度大于1%的物種主要包括德沃斯氏菌屬（Devosia）、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、野野村氏菌屬（Nonomuraea）、直絲菌屬（Planifilum）、假乳桿菌屬（Pseudolabrys）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）、球形孢囊屬（Sphaerisporangium）和中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）等（圖4）。在所有樣本中，相對(duì)豐度最高的是Sphaerisporangium（34.71%～47.25%），其次是Actinomadura（10.37%～17.38%）。與CK 相比，T3 和T4處理的Mesorhizobium相對(duì)豐度分別上升0.85 和3.37 個(gè)百分點(diǎn)，說明菌肥的施入很大程度上促進(jìn)了Mesorhizobium相對(duì)豐度的提高，同時(shí)T3 和T4 處理的Actinomadura相對(duì)豐度也分別上升了8.56和4.32個(gè)百分點(diǎn)，表明菌肥的施加明顯影響了盆栽土壤細(xì)菌群落屬水平上的組成。

圖4 不同處理樣本在屬水平上的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria under different treatments in genus level

2.5 土壤環(huán)境因子與微生物群落之間的關(guān)系

冗余分析（redundancy analysis，RDA）可以直觀地反映樣本、微生物群落、環(huán)境因子之間的關(guān)系。本研究以屬水平上土壤的細(xì)菌群落為指標(biāo)，以盆栽土壤水解氮含量、有效磷含量、速效鉀含量、pH值為環(huán)境因子，進(jìn)行RDA 分析，結(jié)果如圖5 所示。第一軸的解釋量為84.60%，第二軸的解釋量為8.76%。水解氮、有效磷含量和施菌肥處理樣本的細(xì)菌群落分布呈正相關(guān)關(guān)系（r2=0.30，P=0.30；r2=0.63，P＜0.05），而pH 值和速效鉀含量與施肥處理樣本群落分布呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r2=30，P=0.31；r2=0.19，P=0.52），表明菌肥的施加能夠?qū)Υ袒备H土中水解氮和有效磷含量產(chǎn)生增加效果。從屬水平上細(xì)菌群落組成的變化來看，Actinomadura和Mesorhizobium在T3、T4 中的豐度明顯上升，且這兩種菌與水解氮、有效磷含量均呈正相關(guān)關(guān)系，與pH 值、速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)，表明菌肥的施入提高了這兩種菌群的豐度。

圖5 冗余分析方法確定土壤環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落組成的影響Fig.5 Redundancy analysis method to determine the impact of soil environmental factors on bacterial community composition

3 討論

3.1 菌肥施用與刺槐光合作用的關(guān)系

光合作用是植物體將光能轉(zhuǎn)化成有機(jī)物并釋放能量的主要途徑，它能維持植物體內(nèi)水分的平衡及植物的生長發(fā)育，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)具有十分重要的意義［23］。植物的光合作用能力代表的是植物的同化能力和形成碳水化合物的能力［24］，其中凈光合速率反映的是植株積累有機(jī)物的狀況，是判斷植株光合能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率直觀反映植被的水分利用效率、光合效率和對(duì)二氧化碳的吸收利用能力［25-26］。本研究中，在刺槐幼苗的培植試驗(yàn)中施用不同菌肥，對(duì)植株葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率有明顯的提升作用，對(duì)胞間CO2濃度有降低作用，這與周進(jìn)［27］的研究結(jié)果一致。其中T3的凈先合速率、氣孔導(dǎo)度，蒸騰速率達(dá)到峰值，表明該處理菌肥可最大程度發(fā)揮肥效，對(duì)刺槐的光合作用促進(jìn)作用最明顯。同時(shí)，復(fù)合載體菌肥處理下的刺槐葉片光合參數(shù)相較于單一載體處理均有一定程度提高，表明以復(fù)合載體為基質(zhì)制備的菌肥促生作用更加明顯，對(duì)于有效維持植物體內(nèi)水分平衡和提升植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力的能力更強(qiáng)，究其原因可能是單一載體菌肥中有機(jī)質(zhì)含量略低，施入到土壤中使得土壤中的有機(jī)質(zhì)含量不足，植株無法充分吸收。

葉綠素位于植物葉片表層，在吸收和傳遞光能中發(fā)揮著重要作用，其含量直接決定了光合潛力和初級(jí)生產(chǎn)的大?。?8-29］。葉綠素a、b 是光能轉(zhuǎn)化成儲(chǔ)存的化學(xué)能量的基本色素，因此研究植株葉片葉綠素含量對(duì)評(píng)估菌肥的應(yīng)用肥效有重要參考價(jià)值［30］。前人研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌肥的施用可顯著增加植株葉綠素的含量。陳建生等［31］發(fā)現(xiàn)以20%～40%的菌肥添加量替代化肥可以使花生葉片葉綠素含量顯著提升，證實(shí)菌肥可以在一定程度上替代傳統(tǒng)化肥發(fā)揮肥效。孟建宇等［32］施用以維生素為載體的菌肥后發(fā)現(xiàn)其能明顯促進(jìn)玉米生長，植株葉片葉綠素含量較對(duì)照顯著提升17.37%。本研究結(jié)果顯示，隨著菌肥的施用，刺槐葉片中的葉綠素a、b 含量均有不同程度的上升趨勢，這與上述學(xué)者的研究結(jié)果基本一致。同時(shí)，復(fù)合載體菌肥處理下的刺槐葉片葉綠素a、b 含量相比單一載體處理明顯上升，并能替代泥炭載體達(dá)到促進(jìn)光合作用的目的，說明復(fù)合載體菌肥對(duì)刺槐葉片葉綠素含量的增加效果普遍優(yōu)于單一載體，也印證了上文對(duì)刺槐光合特性參數(shù)的分析推斷。推測原因是菌肥擴(kuò)展了植物根系外延，使根系與土壤接觸面擴(kuò)大，促進(jìn)了植物對(duì)光合作用必需的營養(yǎng)元素的吸收，從而提升了光合效率［33］。

3.2 菌肥施用與刺槐土壤養(yǎng)分的關(guān)系

土壤養(yǎng)分表征著土壤肥力的高低，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)［34］。研究土壤養(yǎng)分的變化是有效評(píng)估土壤營養(yǎng)環(huán)境是否健康的有力參考［35］。已有研究表明，微生物肥料的施用可以提高土壤營養(yǎng)元素的有效性，提高土壤供肥能力和土地質(zhì)量。雷嬌嬌等［36］將菜籽油餅和麥麩作為載體底物對(duì)長枝木霉（Trichodermaspp.）進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵制成菌肥，通過兩年生閩楠幼苗種植試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)幼苗生長指標(biāo)、根際土壤有效磷、速效鉀、水解氮等含量顯著提升提升。Sun 等［37］通過將假單胞菌和芽孢桿菌肥料與土壤混合，并在其中種植蘆葦，測得土壤速效養(yǎng)分含量相比對(duì)照組顯著增多，同時(shí)蘆葦?shù)纳L得到顯著促進(jìn)。本研究中，施用不同載體菌肥的土壤水解氮和有效磷含量均高于未施肥對(duì)照，速效鉀含量則有所降低。這與王愛斌等［38］的研究結(jié)果基本一致，水解氮和有效磷含量的提高說明微生物菌肥中富含的固氮微生物和溶磷微生物可以發(fā)揮各自作用轉(zhuǎn)化空氣中的氮?dú)夂痛龠M(jìn)土壤中磷素的溶解，達(dá)到提高土壤中速效養(yǎng)分含量的效果［39］，而速效鉀含量的降低可能是因?yàn)榫实氖┯么龠M(jìn)了植物根系對(duì)鉀元素的吸收利用，進(jìn)而使土壤中速效鉀含量減少。從本研究結(jié)果看，T1、T2水解氮含量顯著低于T4、T5，推測原因是土壤中的營養(yǎng)成分無法滿足菌肥在分解有機(jī)質(zhì)時(shí)需要合成蛋白質(zhì)所需的氮素，因而造成了一定程度的脫肥［40］。T3、T5 有效磷含量顯著高于其余處理，可能是因?yàn)槿芰拙暝谶@兩種載體菌肥中的釋放力和對(duì)載體中富含的養(yǎng)分充分吸收的能力較強(qiáng)，從而使有效活菌數(shù)增多，增加了土壤中有效磷的含量［41］。復(fù)合載體菌肥施用下的盆栽土壤水解氮、有效磷含量相較于單一載體改良效果更加明顯，同時(shí)優(yōu)于泥炭對(duì)照組，這與張建貴等［42］的研究結(jié)果一致，可能是由于復(fù)合載體中的營養(yǎng)成分含量普遍高于單一載體，功能微生物在其中生長更為旺盛，施入土壤后使土壤養(yǎng)分含量增多［43］。綜上，微生物菌肥的施用普遍對(duì)土壤肥力有提高效果，且各載體都能在一定程度上代替泥炭發(fā)揮肥效，以復(fù)合載體T3、T4應(yīng)用效果最為顯著。

3.3 菌肥施用與刺槐根際土壤細(xì)菌群落的關(guān)系

土壤微生物群落多樣性代表著土壤微生物的動(dòng)態(tài)變化，直觀反映了土壤供肥能力和土壤健康情況。通過對(duì)土壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)的分析判斷，可以深度了解土壤微生物受土壤生境變化或外因影響所導(dǎo)致微觀生態(tài)水平上的變化［44］。本研究結(jié)果顯示，不同載體菌肥處理下的刺槐根際土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度有所增加，這與李金花等［45］在楸樹培植上的研究結(jié)果基本一致。其中，Alpha 多樣性的分析結(jié)果表明，T4 處理的微生物多樣性較同水平組的其余處理更為豐富，說明T4菌肥的施用使得根際土壤微生物多樣性程度大大提高，但T3 處理的ACE 和Chao1 指數(shù)較CK 相比均略有降低，究其原因可能為施用菌肥使得土壤中微生物的均勻度降低，某些細(xì)菌數(shù)量提升，致使單一細(xì)菌的占比過高，且在測序時(shí)未將真菌和放線菌的豐度計(jì)量在內(nèi)［46］。

微生物群落組成代表著在特定生態(tài)環(huán)境下微生物的活躍程度及豐富程度，是反映土壤肥力水平與土壤微生物代謝功能發(fā)揮情況的指標(biāo)之一［47］。本研究發(fā)現(xiàn)，施肥組與無菌對(duì)照組的土壤優(yōu)勢細(xì)菌群落一致，差異主要體現(xiàn)在施肥組較無菌對(duì)組照的相對(duì)豐度有一定程度的提升。由微生物群落組成可見，在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）在各個(gè)接種菌肥處理的占比較大，這與Guo 等［48］、Huang 等［49］的研究結(jié)果一致。施用菌肥處理組細(xì)菌群落在門水平上的組成和對(duì)照相比豐度提高較為明顯，主要表現(xiàn)為根際土優(yōu)勢菌門Proteobacteria相對(duì)豐度的增加，從43.94%分別增加到了50.02%和46.27%，提高6.08 和2.33 個(gè)百分點(diǎn)，而X-45 也屬于Proteobacteria，這說明菌肥的施用可促使土壤中優(yōu)勢菌門相對(duì)豐度的增加，進(jìn)一步來看，菌肥中富含的功能微生物菌株X-45 是導(dǎo)致Proteobacteria 相對(duì)豐度增加的主要原因，這與前人研究結(jié)果基本一致［22］。在屬水平上，施肥處理組細(xì)菌群落組成和對(duì)照相比有一定差別，主要表現(xiàn)在根際土中Mesorhizobium相對(duì)豐度的明顯增加。但相對(duì)豐度仍處于較低水平，推測原因是盆栽種植周期較短，不足以使該類群占據(jù)主要地位。研究記載，Mesorhizobium是一種固氮根瘤菌，可以促使大氣中的氮?dú)膺€原成氨供植物吸收利用，實(shí)現(xiàn)生物固氮。王婧儀［50］探索中慢生根瘤菌MAFF303099 參與調(diào)控共生固氮的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其中的mlr5883基因具備固氮活力。Shah 等［51］將中慢生根瘤菌（Mesorhizobium ciceri）接種至檸條后發(fā)現(xiàn)平均單株根瘤數(shù)達(dá)到110個(gè)，同時(shí)根際致病菌P.medicaginis、F.oxysporum、F.solani有效減少，由此推測中慢生根瘤菌的接種可以改善檸條生長狀況，維護(hù)土壤環(huán)境健康。本研究中Mesorhizobium相對(duì)豐度的增加直接致使土壤中固氮菌數(shù)量增多，增強(qiáng)了刺槐共生固氮的能力，提高了土壤中的水解氮含量，對(duì)應(yīng)土壤理化性質(zhì)分析結(jié)果。從環(huán)境因子的相關(guān)性分析可見，菌肥的施用可以增加根際土中速效養(yǎng)分含量，使得土壤中水解氮和有效磷含量增加，改善了土壤的營養(yǎng)環(huán)境，使得有益微生物豐度上升，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)發(fā)揮著微觀調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究表明，施用不同載體菌肥對(duì)刺槐光合作用和土壤養(yǎng)分含量具有不同程度的改良效果，復(fù)合載體菌肥處理下刺槐葉片光合作用和土壤改良效果更為明顯，主要表現(xiàn)在凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等氣體交換參數(shù)的提升和葉綠素、水解氮、有效磷含量的提升。與此同時(shí)，刺槐根際土的細(xì)菌群落組成會(huì)隨菌肥的施入而發(fā)生變化，益生菌群相對(duì)豐度增多，其中T3和T4Actinomadura豐度較CK 分別增加8.56 和4.32個(gè)百分點(diǎn)，Mesorhizobium豐度較CK 分別增加0.85 和3.37個(gè)百分點(diǎn)。此外，樣本細(xì)菌群落分布與水解氮、有效磷含量呈正相關(guān)關(guān)系，與pH 值、速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即土壤水解氮、有效磷含量的增加促使了益生菌群相對(duì)豐度的上升。因此，秸稈∶麥麩=1∶1、秸稈∶麥麩∶棉籽殼=1∶1∶1 這2 種載體配方可以作為菌肥載體投入生產(chǎn)。