韓善潁,程 林,劉 毅,石 毅,樊建剛

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.耳鼻咽喉頭頸外科,b.人力資源部,c.科技部,四川 成都 610072)

頭頸癌涉及頭頸部區(qū)域內(nèi)的多個器官和組織,通常發(fā)生在口腔、鼻咽、喉和鼻腔,是全球第六大最常見的惡性腫瘤,病因主要為煙草、酒精消費(fèi)和HPV感染等[1～3]。據(jù)GLOBOCAN統(tǒng)計(jì),每年大約有600000例新增病例,350000例死亡病例,給社會和公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[4]。盡管頭頸癌的診斷和治療方面取得了進(jìn)步,但總體生存率仍然很低。目前,頭頸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是組織活檢,此侵入性的方法無法確定和監(jiān)測腫瘤的動態(tài),開發(fā)能夠連續(xù)取樣、早期診斷疾病進(jìn)展和縱向監(jiān)測治療反應(yīng)的“液體活檢方法”對于頭頸癌的診斷和預(yù)后極為重要。細(xì)胞外囊泡(extracellular vehicles,EVs)作為液體活檢的工具,參與腫瘤發(fā)生、生長和發(fā)育、免疫反應(yīng)的逃避、耐藥性的發(fā)展等過程[6],是診斷頭頸癌的新興策略之一,有望在腫瘤基因組和突變的表征方面方面得到廣泛的應(yīng)用。EVs還提供可重復(fù)性的實(shí)時治療監(jiān)測和可行性預(yù)估,同時具有微創(chuàng)性和成本效益[5]。

1 EVs

1.1 EVs的特征和組成EVs在結(jié)構(gòu)上與其起源細(xì)胞相似,具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu),其內(nèi)含物包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、RNA(miRNA等)和代謝物等生物活性分子。EVs由細(xì)胞釋放至細(xì)胞外空間和液體中后[7,8],被有效地遞送至受體細(xì)胞,從而生成通信網(wǎng)絡(luò)。EVs內(nèi)含物可以作用于受體細(xì)胞,重塑周圍的微環(huán)境并改變遠(yuǎn)處的目標(biāo),影響其生物學(xué)行為。

1.2 EVs的生物發(fā)生EVs是由多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生并釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的30 nm至1 μm的膜囊泡,穩(wěn)定廣泛存在于各種體液中,如血漿、唾液、腦脊液、母乳、尿液、精液、淋巴液、滑膜液、羊水和痰液等。EVs的生物學(xué)起源始于早期內(nèi)體,它通過質(zhì)膜內(nèi)陷形成。在此過程中,細(xì)胞外成分和細(xì)胞膜蛋白被包裹起來,早期內(nèi)體膜的向內(nèi)出芽導(dǎo)致囊泡的形成。早期內(nèi)體不僅與其他細(xì)胞器交換物質(zhì),而且與不同的內(nèi)體融合形成晚期內(nèi)體。具有管腔內(nèi)囊泡的晚期核內(nèi)體——多泡體,它們負(fù)責(zé)與細(xì)胞膜融合以將EVs釋放到細(xì)胞外環(huán)境中[9,10]。

1.3 EVs的優(yōu)勢① EVs 由腫瘤和其他細(xì)胞主動釋放,而不是由于細(xì)胞凋亡而被動釋放[11];②由于脂質(zhì)雙分子層的保護(hù),EVs及其內(nèi)容物相對穩(wěn)定[12];③ EV 體積小,對細(xì)胞外基質(zhì)具有高滲透性[13];④EVs由一系列分子內(nèi)含物組成,有利于發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性生物標(biāo)志物[14]。EVs反映細(xì)胞的動態(tài)及實(shí)時變化,隨著精準(zhǔn)化、個體化治療的推進(jìn),EVs使提高預(yù)后和治療效果的評價及推動抗腫瘤新藥的研發(fā)成為可能[15]。

1.4 EVs分離和表征方法

1.4.1EVs分離方法 目前較常采用的EVs分離策略主要是基于EVs的大小、形狀、表面電荷、密度和孔隙率、表面抗原等物理化學(xué)特性進(jìn)行EVs的分離,包括超速離心、基于尺寸的過濾、尺寸排阻色譜、聚合物沉淀、免疫親和捕獲法和基于微流體的分離方法[16]。

1.4.2EVs表征技術(shù) 許多技術(shù)已常規(guī)用于表征EVs,其中,使用表面蛋白標(biāo)記 CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101的蛋白質(zhì)印跡和流式細(xì)胞術(shù)是最常用的EVs表征分析方法[17,18]。通過透射電子顯微鏡可以表征EVs的形態(tài)和形狀,利用納米粒子跟蹤分析 (NTA)表征EVs大小[19]。此外,可調(diào)電阻脈沖傳感、ELISA分析、掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡也是常用的EVs表征技術(shù)[20]。

2 EVs作為潛在生物標(biāo)志物來源在頭頸癌診斷中的作用

因其雙層結(jié)構(gòu)、生物相容性、低免疫原性以及與靶細(xì)胞相互作用的能力,EVs被公認(rèn)為潛在的頭頸癌生物標(biāo)志物來源。據(jù)報(bào)道,EVs影響頭頸癌生長,參與頭頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移,調(diào)節(jié)頭頸癌腫瘤微環(huán)境,促進(jìn)頭頸癌的耐藥性產(chǎn)生。作為調(diào)控頭頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為和頭頸癌細(xì)胞動態(tài)實(shí)時變化的監(jiān)測窗口,EVs發(fā)揮功能的主要內(nèi)含物則是其內(nèi)部封裝的DNA(EVs-DNA)、RNA(EVs-RNA)和蛋白質(zhì)(EVs-蛋白質(zhì))。

2.1 EVs-DNA在頭頸癌中的生物標(biāo)志物潛力EVs-DNA中的基因組DNA包括單鏈和雙鏈和線粒體DNA (mtDNA)[21]。近來一項(xiàng)對來自胰腺癌患者血清的成對腫瘤組織和CD63+/TSG101+EVs的開創(chuàng)性研究報(bào)告稱,EVs-DNA 覆蓋了整個基因組,并攜帶與親本腫瘤相同的突變。此外,EVs-DNA似乎可以通過主動運(yùn)輸?shù)姆绞?影響相應(yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)水平,進(jìn)而影響細(xì)胞功能。其還反映了親本腫瘤細(xì)胞的突變狀態(tài),而無需直接腫瘤取樣。基于此研究結(jié)果開發(fā)了一種名為 ExoDx EGFR的EV 檢測方法,該方法使用qPCR檢測EVs-DNA中的EGFR突變[22～24],具有高靈敏度和特異性。頭頸癌經(jīng)常以EGFR突變?yōu)樘卣?未來的研究也在致力于利用ExoDx EGFR進(jìn)行EVs-EGFR突變的早期檢測和西妥昔單抗(一種針對EGFR的單克隆抗體)治療晚期頭頸癌的療效評估,試圖通過這種非侵入性的檢測方式,找尋相關(guān)的頭頸癌生物標(biāo)志物,為臨床管理和用藥提供信息。

2.2 EVs-RNA在頭頸癌中的生物標(biāo)志物潛力近年來,EVs-RNA在頭頸癌中的作用主要聚焦于EVs內(nèi)含物——非編碼RNA(miRNA)的研究。EVs-miRNA作為參與頭頸癌的必需調(diào)節(jié)分子,是一類長度約為20個核苷酸的單鏈非編碼短RNA分子,通過形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物降解靶基因的mRNA,在調(diào)節(jié)頭頸癌各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用,可作為頭頸癌疾病生物標(biāo)志物并可能發(fā)展為頭頸癌新的治療靶點(diǎn)。因?yàn)镋Vs-miRNA具有穩(wěn)定性并且能夠調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因,已成為頭頸癌患者早期診斷、預(yù)后和治療靶標(biāo)的潛在生物標(biāo)志物。近來已在包括頭頸癌在內(nèi)的各種癌癥類型中探索了EVs-miRNA相關(guān)的生物標(biāo)志物潛力[25]。

2.2.1miR-21 在EVs中富集的miR-21是一種致癌miRNA,靶向與增殖、凋亡和侵襲相關(guān)的腫瘤抑制基因,在共培養(yǎng)后可以從腫瘤細(xì)胞水平轉(zhuǎn)移到人類單核細(xì)胞。EVs相關(guān)miR-21已被證明能夠反映口腔癌患者腫瘤的實(shí)時表達(dá)狀態(tài),暗示了其作為生物標(biāo)志物的潛力[26]。miR-21的生物標(biāo)志物潛力也在區(qū)分惡性喉癌和良性疾病中得到了驗(yàn)證,miR-21表達(dá)水平的差異與臨床參數(shù)相關(guān)。此外,在缺氧環(huán)境中,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和HIF-2α能夠促進(jìn)EVs中更高水平的致癌miR-21的表達(dá),從而介導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。當(dāng)HIF-1α和HIF-2α被敲除時,EVs中miR-21的表達(dá)恢復(fù)到原始水平,從而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[27]。據(jù)Momen-Heravi和Bala報(bào)道,miR-21可以激活炎癥途徑,尤其是激活NF-κB,這可以上調(diào)炎癥細(xì)胞因子如IL-6、PGE2、MCP1和MMPs,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。血清EVs-miR-21的表達(dá)與頭頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期等臨床參數(shù)有關(guān),但在促進(jìn)腫瘤分化方面沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異[28]。

2.2.2miR-24-3p 除了miR-21,與健康對照相比,EVs相關(guān)的miR-941也顯示在喉癌患者的血漿中高表達(dá)[29]。另一項(xiàng)研究表明,miR-24-3p是與口腔癌患者唾液中的CD9+EVs相關(guān)的最顯著上調(diào)的miRNA之一[30],這與miR-24-3p在口腔癌細(xì)胞中的功能一致,即miR-24-3p能夠產(chǎn)生“腫瘤友好”的微環(huán)境,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,且ROC分析顯示EVs-miR-24-3p可以顯著區(qū)分口腔癌患者和正常的對照組,并具64.4% 的敏感性和80%的特異性。EVs-miRNA-34a-5p過表達(dá)可通過AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路促進(jìn)口腔鱗癌的進(jìn)展,從而誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[31]。

2.2.3EVs-miR-196a 頭頸癌患者血漿中EVs-miR-196a的表達(dá)水平高于健康供體,并且在腫瘤切除后減少,表明EVs-miR-196a是被頭頸癌腫瘤組織釋放的。較高的EVs-miR-196a與頭頸癌患者的耐藥性和較差的總生存期相關(guān)。通過監(jiān)測血漿EVs-miR-196a水平,可以將患者分為化療耐藥組和化療敏感組,靈敏度高達(dá)85%,特異性約為70%。上述研究表明,血漿EVs-miR-196a可作為頭頸癌患者的預(yù)后因素和化療耐藥性預(yù)測因子[32]。miRNA-491-5p 治療前后的動態(tài)變化與1年疾病復(fù)發(fā)率(80%的敏感性和69.23%的特異性)以及無病生存率和總體生存率相關(guān),生存率分別為2.82和5.66,這一發(fā)現(xiàn)可能有助于識別腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險高的患者[33,34]。

2.3 EVs-蛋白質(zhì)在頭頸癌中的生物標(biāo)志物潛力在EVs中,蛋白質(zhì)組在脂質(zhì)雙層中得到了很好的保護(hù),并且可以在生物體體液樣本中得以完整保存。此外,EVs中特異的蛋白質(zhì)信息可以反映蛋白質(zhì)組特征的變化[35]。通過近年來研究,EVs-蛋白質(zhì)在頭頸癌中的關(guān)鍵作用已取得重大進(jìn)展。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)EVs中的一些蛋白質(zhì),包括CD9、小窩蛋白1(CAV1)和腫瘤排斥抗原1(gp96),在頭頸癌中具有診斷價值[36]。Ono等發(fā)現(xiàn),與未轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞相比,口腔鱗癌癌癥細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時,EVs中CD9和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的表達(dá)水平較高,這表明CD9和EpCAM的分泌促進(jìn)了口腔鱗癌的惡性進(jìn)展。EGFR和PD-L1已被報(bào)道為頭頸癌潛在生物標(biāo)志物,CD44已成為頭頸癌的作用診斷候選物。CD44v3在頭頸癌中的過度表達(dá)與增殖、遷移和轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)以及預(yù)后不良有關(guān)?；诖?最近的一項(xiàng)研究表明,頭頸癌患者血漿EVs中CD44v3的表達(dá)水平與頭頸癌疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和免疫功能障礙相關(guān)[37]。其他有針對性的研究表明,賴氨酰氧化酶樣2和親環(huán)蛋白A表達(dá)水平升高與頭頸癌患者血漿中的EVs相關(guān),并與疾病狀態(tài)相關(guān)[38,39]。富含微纖維相關(guān)蛋白5(MFAP5)通過激活由EVs介導(dǎo)的MAPK和AKT通路,促進(jìn)口腔舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長和遷移[40]。此外,來自轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的EVs含有豐富的HSP90,這與HSP90α和HSP90β基因敲除后癌癥細(xì)胞數(shù)量的下降一致;這些發(fā)現(xiàn)表明HSP90的表達(dá)增加是口腔鱗狀細(xì)胞癌的不利預(yù)后因素。因此,HSP90在EVs中的表達(dá)可以成為口腔鱗狀細(xì)胞癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[41]。

3 EVs作為頭頸癌藥物治療載體在抗癌治療中的前景

EVs作為各種分子的內(nèi)源性納米載體,由于其免疫原性低、跨越生理屏障的能力強(qiáng)、固有的靶向能力、良好的生物分布和生物利用度,正在成為化療藥物的藥物輸送載體[42～45]。研究表明,EVs遞送的miRNA-138在體外和體內(nèi)有效賦予口腔鱗狀細(xì)胞癌抗腫瘤功能,支持EVs在頭頸癌中也具有作為遞送劑潛力的假設(shè)[46]。Cohen等評估了間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體(MSC-exo) 和A431鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 (A431-exo) 的外泌體作為藥物載體的參數(shù),發(fā)現(xiàn) MSC-exo在A431荷瘤小鼠中表現(xiàn)出明顯更大的腫瘤滲透能力[47]。姜黃素是姜黃的生物活性成分,具有較好的抗癌作用[48]。最近研究表明,姜黃素、多柔比星和紫杉醇可以被加載到EVs中,以提高其治療效果。研究者將姜黃素加載到白色念珠菌分泌的EVs中,然后將其轉(zhuǎn)移到口腔舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中,并將其與未加載的姜黃素細(xì)胞系進(jìn)行比較,研究結(jié)果顯示,EVs中姜黃素的添加提高了生物利用度[49]。以上的研究結(jié)果皆表明,EVs可被發(fā)展為優(yōu)異的治療載體,在頭頸癌抗癌治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

總而言之,EVs研究是一個有吸引力的新興領(lǐng)域,其優(yōu)勢取決于它們內(nèi)含物的“信號箱”作用,這些EVs內(nèi)含物可以通過多組學(xué)檢測識別和評估早期檢測頭頸癌的各種生物標(biāo)志物?；陬^頸癌中EVs的液體活檢方法,不僅可以評估惡性程度和腫瘤進(jìn)展,還可以為頭頸癌的治療提供適當(dāng)?shù)姆椒ê捅O(jiān)測。EVs相關(guān)的臨床研究已取得顯著的進(jìn)展,可以促進(jìn)頭頸癌癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,以及癌細(xì)胞的免疫逃逸或耐藥性產(chǎn)生。盡管這些研究促進(jìn)了EVs在頭頸癌診斷中的臨床應(yīng)用,但仍有許多問題需要進(jìn)一步闡明。由于EVs在癌癥發(fā)生中的關(guān)鍵作用,需要在該領(lǐng)域進(jìn)行更多的研究,以探索EVs在腫瘤治療中的潛力。