寧小婭,丁涵露

(1.遵義醫(yī)科大學(xué),貴州 遵義 563000;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科,四川 成都 610072)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種世界性的健康挑戰(zhàn),其發(fā)生率在過去的數(shù)十年里迅速上升。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會的數(shù)據(jù)顯示,在2021年的時候,全世界DM患者總數(shù)超過5.0億人(20～79歲人群),而預(yù)計到2045年,這一數(shù)字可能將急劇上升至接近8.0億[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是DM最常見的微血管并發(fā)癥,影響多達(dá)30%的1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)患者和40%的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者[2]。此外,DN已成為眾多慢性腎臟病中導(dǎo)致終末期腎臟病(end stage renal disease,ESRD)的重要因素,給患者帶來了極大的威脅。越來越多的研究表明,腎小管損傷和進(jìn)行性間質(zhì)纖維化與DN的進(jìn)展更為密切相關(guān)。腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)對DN患者腎纖維化的啟動和促進(jìn)至關(guān)重要?，F(xiàn)將DN中TEC的EMT的發(fā)病機(jī)理的研究進(jìn)展做一綜述。

1 EMT概述

EMT是在一系列信號通路及細(xì)胞因子的刺激下,上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的一個極其動態(tài)的過程。其轉(zhuǎn)變的特征表現(xiàn)為細(xì)胞間接觸的消失,基底膜的破壞,上皮鈣黏素和緊密連接蛋白-1的喪失,蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu),還有新的間充質(zhì)標(biāo)志物的出現(xiàn),如α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白、I型膠原蛋白和纖維連接蛋白等。EMT可以分為三種不同的類型:1型EMT可以促進(jìn)胚胎發(fā)育和器官形成,2型EMT則可以引起炎癥和器官纖維化,而3型EMT則可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[3]。多項研究顯示,EMT在DN的病理中起主導(dǎo)作用,其中2型EMT與DN腎纖維化密切相關(guān)。

2 EMT與DN腎纖維化

進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化被認(rèn)為是DN的標(biāo)志性病理特征,表現(xiàn)為I型和IV型膠原、層粘蛋白和纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白成分在小球系膜和小管間質(zhì)過度蓄積。肌成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生演變的關(guān)鍵,它們在正常腎臟中極為罕見,因此,它們的出現(xiàn)可以被視為腎間質(zhì)纖維化的開端。目前,肌成纖維細(xì)胞的來源仍然不完全清楚,但可能的前體細(xì)胞包括常駐間充質(zhì)細(xì)胞、骨髓來源細(xì)胞、周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。越來越多的證據(jù)表明,TEC不僅是損傷的受害者,也是腎臟疾病進(jìn)展的驅(qū)動力。TEC損傷后,可能出現(xiàn)EMT或部分EMT、細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老,并分泌促纖維化細(xì)胞因子,從而刺激肌成纖維細(xì)胞活化,導(dǎo)致纖維化的產(chǎn)生[4]。目前,越來越多的研究證明,TEC的EMT能夠促進(jìn)ECM蛋白成分的表達(dá),在DN間質(zhì)纖維化的病理中起著關(guān)鍵作用。EMT的分子機(jī)制是十分復(fù)雜的,許多信號通路和中介物相互影響共同調(diào)節(jié)這一過程。

3 DN中EMT的不同發(fā)病機(jī)制

3.1 信號通路與EMT

3.1.1轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/Smad信號通路 TGF-β是一種多樣的轉(zhuǎn)化生長因子,包含三種不同的亞型:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,其中TGF-β1被證明是參與腎纖維化形成的關(guān)鍵因子,并被證明是EMT最有效的誘導(dǎo)劑。其通過Smad依賴(典型)和Smad非依賴(非典型)信號通路導(dǎo)致ECM過度蓄積和纖維化形成,以Smad依賴信號通路最為重要。Smad2和Smad3是TGF-β1最為重要的下游介質(zhì),它們在腎臟纖維化的發(fā)生過程中發(fā)揮著不同的生物學(xué)作用,甚至相互拮抗。Smad2通過抑制TGF-β1/Smad3信息通路,阻止了TGF-β1引起的腎纖維化,進(jìn)而起到腎臟保護(hù)作用,而Smad3則可以促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生,加重腎臟疾病進(jìn)展[5]。Smad7被稱為抑制性Smad,它是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,在腎臟保護(hù)中起著重要作用。Wang等[6]的實驗發(fā)現(xiàn),下調(diào)Smad7可促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)的EMT,從而加重DN的腎損害。骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)屬于TGF-β超家族成員,它被認(rèn)為是一種有效的抗纖維化因子。Peng等[7]研究發(fā)現(xiàn),在DN中,BMP7可能通過下調(diào)TGF-β1/Smad3信息通路和上調(diào)Smad1/5信息通路,從而抑制EMT和ECM的沉積。

3.1.2Wnt/β-catenin信號通路 Wnt是重要的半胱氨酸糖蛋白質(zhì),它被細(xì)胞分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中,并在接觸細(xì)胞時激活受體介導(dǎo)的信號傳遞。Wnt信息通道包含典型的Wnt/β-catenin、非典型的Wnt/Ca2+和細(xì)胞極性通道,其中以典型的Wnt/β-catenin信息通道最為重要。 Wnt/β-catenin信號能夠刺激上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)Snail1、Twist、基質(zhì)金屬蛋白酶-7和血管緊張素等下游介質(zhì),它們參與腎纖維化的形成[8]。此外,Wnt/β-catenin信號還能通過與其他信號通路交織在一起,如TGF-β/Smad通路、Notch通路和結(jié)締組織生長因子等,促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。越來越多的證據(jù)表明,Wnt/β-catenin信息通道在DN的TEC的EMT過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。He等[9]的實驗發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin信息通道能夠促進(jìn)高糖(high glucose,HG)誘導(dǎo)的人近端小管上皮(HK-2)細(xì)胞EMT,而當(dāng)抑制β-catenin的表達(dá)時,HK-2細(xì)胞EMT被減輕。C-反應(yīng)蛋白(CRP)被證明可促進(jìn)TEC的EMT,它是通過活化Wnt/β-catenin這一信號通路來實現(xiàn)的[10]。

3.1.3Notch信號通路 Notch信號通路是一種細(xì)胞-細(xì)胞通信機(jī)制,其通過Notch受體(Notch1-Notch4)的異常激活介導(dǎo)疾病的發(fā)生和發(fā)展。Notch信號在腎小球上皮細(xì)胞中的增多與蛋白尿和腎小球硬化有關(guān),而Notch信號在TEC的增多則與腎間質(zhì)纖維化密切有關(guān)。Cummins等[11]的研究證明,Notch4的過表達(dá)可增強(qiáng)人源性腎小管細(xì)胞系中TGF-β介導(dǎo)的腎纖維化,并且其在糖尿病小鼠和人的纖維化腎的腎小管中表達(dá)增加。Notch通路與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),并對EMT的誘導(dǎo)起著重要作用。Li等[12]的實驗表明,當(dāng)HG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中Notch通路成員(Notch1、Jagged-1、Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)、Hes5)水平下降時,波形蛋白和α-SMA的表達(dá)同樣也降低了,而上皮鈣黏素的表達(dá)則顯著升高。Yang等[13]的研究表明,在DN模型KKAy小鼠中,通過降低Notch1、Jagged-1和Hes1在TEC中的表達(dá)水平,可以有效阻止HG誘導(dǎo)EMT發(fā)生。

3.1.4其他信號通路 DN中TEC的EMT發(fā)生還與TLR4/NF-κB、ERK1/2、JAK/STAT3等信號通路有關(guān)。S100A8和S100A9是一類與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì),它們在糖尿病RTEC中表達(dá)升高。研究表明,S100A8/A9的過度表達(dá)可以活化TLR4/核因子κB(NF-κB)信號通路,促進(jìn)EMT過程,導(dǎo)致糖尿病小鼠腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[14]。研究表明,抗炎中成藥黃葵膠囊可以有效地控制腎臟NLRP3炎癥小體的活性,并且可以阻斷TLR4/NF-κB信號通道,從而緩解了DN模型大鼠的腎小管EMT進(jìn)程[15]。ERK1/2信號通路也與腎間質(zhì)纖維化相關(guān)。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DN中,CRP可以通過Wnt/β-catenin和ERK1/2信號通路促進(jìn)EMT[10]。Gao等[16]在探討豆蔻素(CAD)在糖尿病大鼠腎損傷中的作用的研究發(fā)現(xiàn),CAD通過抑制大鼠RTEC中的PI3K/AKT和JAK/STAT3信號通路,減弱了RTEC的EMT,從而減輕了糖尿病誘導(dǎo)的腎損傷。

3.2 炎癥與EMTDN是一種嚴(yán)重的慢性腎臟疾病,持續(xù)的微炎癥狀態(tài)在它的進(jìn)展中起著核心作用。在DN中,NOD樣受體(NLRs)、Toll樣受體(TLRs)、NF-κB、JAK/STAT等炎癥信號通路上調(diào),細(xì)胞粘附分子-1 (ICAM-1)、血管粘附蛋白-1 (VAP-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白介素-1(IL-1)、IL-6、 IL-18等炎癥介質(zhì)大量釋放,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向腎間質(zhì)浸潤。并且所有的這些事件形成正反饋回路,無限放大炎癥反應(yīng),從而加重腎損害[17]。此外,持續(xù)的炎癥狀態(tài)刺激大量間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,從而導(dǎo)致進(jìn)行性腎纖維化的發(fā)生。S100A8/A9主要由中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌,在炎癥這一極其復(fù)雜的事件中發(fā)揮著重要作用。已有研究證明,它們可通過激活RTEC中的TLR4/NF-κB信號通路,促進(jìn)EMT發(fā)生[14]。C-X3-C基序配體1(CX3CL1)已被證明參與炎癥反應(yīng)。當(dāng)CX3CL1的表達(dá)升高時,可通過激活RAF/MEK/ERK通路來促進(jìn)高血糖或HG誘導(dǎo)的腎小管EMT[18]?？梢?炎癥可通過單一機(jī)制或與其它信號通道相互作用,激活TEC的EMT事件。

3.3 氧化應(yīng)激與EMT腎臟氧化應(yīng)激通常是由誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生的促氧化酶增多和抗氧化劑耗盡共同引起。在腎臟中涉及許多生成ROS的酶系統(tǒng),其中NADPH氧化酶是最重要的貢獻(xiàn)者。ROS在DN的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。高血糖、高游離脂肪酸會激發(fā)NADPH氧化酶,從而生成巨量的ROS,而這部分ROS無法被抗氧化劑消除,從而引起炎癥細(xì)胞的大規(guī)模集聚,進(jìn)而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子、生長因子和轉(zhuǎn)錄因子生成,加劇了DN腎纖維化的發(fā)生。ROS在DN的EMT過程中起著重要作用。Lu等[19]的研究證明,HG通過增加正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞系(NRK-52E)內(nèi)ROS的產(chǎn)生促進(jìn)TGF -β1的表達(dá),并激活PI3K/Akt信號通路,導(dǎo)致雷帕霉素靶點(mTOR)磷酸化,促進(jìn)腎小管EMT發(fā)生。發(fā)育調(diào)控和DNA損傷應(yīng)答1(regulated in development and DNA damage response 1,REDD1)是新發(fā)現(xiàn)的缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的靶基因。Mu等[20]的研究發(fā)現(xiàn),REDD1在DN患者和糖尿病小鼠的腎臟中表達(dá)增加,其缺失顯著抑制了糖尿病小鼠的凋亡和EMT。該研究進(jìn)一步通過體外實驗表明,HG可誘導(dǎo)內(nèi)源性REDD1與硫氧還蛋白相互作用蛋白形成強(qiáng)大的復(fù)合物,通過抑制ROS的產(chǎn)生來阻止HG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和EMT。

3.4 自噬與EMT自噬是一種復(fù)雜的多步驟過程,它通過溶酶體依賴的機(jī)制降解受損蛋白和大分子,以保持細(xì)胞內(nèi)的平衡與穩(wěn)定。在正常情況下,足細(xì)胞具有較高的自噬水平,但如果自噬水平不足,就會增加腎小球疾病的風(fēng)險。與足細(xì)胞不同,RTEC表現(xiàn)出低水平的基礎(chǔ)自噬,以防止細(xì)胞衰老及缺血再灌注損傷。然而,持續(xù)的自噬上調(diào)將導(dǎo)致腎纖維化的發(fā)生。因此,在正常血糖水平下,自噬是腎臟上皮細(xì)胞的重要保護(hù)機(jī)制。在慢性高血糖的刺激下,自噬調(diào)節(jié)失常,將促進(jìn)DN的發(fā)生和發(fā)展。自噬是一種生物過程,它的啟動和自噬體的形成需要許多基因組,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了30多個自噬相關(guān)基因蛋白,它們在調(diào)控自噬流程中起著至關(guān)重要的作用。Beclin1、LC3、p62都是與自噬相關(guān)的關(guān)鍵蛋白,因此它們常被作為評估自噬的標(biāo)記物。自噬活性與Beclin1、LC3II的表達(dá)水平呈正相關(guān),而與p62的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。mTOR和AMP激酶(AMPK)是與自噬啟動相關(guān)的兩個關(guān)鍵分子。mTOR通常負(fù)責(zé)抑制自噬,而AMPK與mTOR途徑的作用相反,是自噬的一種正性調(diào)節(jié)因子。Wang等[21]在探討二甲雙胍對DN腎纖維化的影響的研究發(fā)現(xiàn),在DN大鼠中,P62表達(dá)升高,LC3II/I比值降低,表現(xiàn)為自噬抑制。當(dāng)使用二甲雙胍治療后,P62表達(dá)下降,LC3II/I比值升高,自噬顯著增加,腎組織中的纖維連接蛋白和I型膠原蛋白的表達(dá)降低。體外研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),高血糖狀態(tài)下,在p-AMPK失活的TEC中,上皮鈣黏素的表達(dá)水平下降,α-SMA的表達(dá)水平升高。Xu等[22]的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用自噬激活劑(雷帕霉素)時,減弱了高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積和EMT,而使用自噬抑制劑(二磷酸氯喹等)時,則加劇了脂質(zhì)蓄積和EMT。該研究也發(fā)現(xiàn),持續(xù)高糖誘導(dǎo)的自噬激活會導(dǎo)致HK-2細(xì)胞表現(xiàn)出EMT。因此,一定水平基礎(chǔ)的自噬激活可以抑制EMT的發(fā)生,但當(dāng)自噬持續(xù)激活時,將會發(fā)生病理變化,發(fā)生EMT上調(diào)。

3.5 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與EMTRAS是參與血壓和鹽平衡調(diào)節(jié)的激素系統(tǒng)。它的過度激活將會構(gòu)成一種致病機(jī)制,導(dǎo)致組織損傷和纖維化的發(fā)生。腎內(nèi)的血管緊張素肽水平明顯高于血漿或其他器官組織,其中,血管緊張素II (AngII)是RAS重要生理功能的主要效應(yīng)物。在慢性高血糖的刺激下,AngII在腎臟局部升高,通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥和一些生長因子及其受體的上調(diào)引起蛋白尿,最終導(dǎo)致小管間質(zhì)纖維化。此外,AngII能顯著影響RTEC中α-SMA的表達(dá),并且呈時間依賴性增加,通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)腎纖維化的發(fā)展。這一過程主要通過TGF-β1這一關(guān)鍵介質(zhì)來介導(dǎo)。Zhou等[23]的研究證明,HG通過使局部RAS升高后激活A(yù)T1受體,導(dǎo)致TGF-β1的合成增加,促進(jìn)ERK1/2磷酸化,誘導(dǎo)RTEC發(fā)生EMT。Chen等[24]的研究發(fā)現(xiàn),AngII以時間和劑量依賴的方式顯著提高各種Wnt mRNA和活性β-catenin蛋白在HK-2細(xì)胞中的表達(dá)水平。表明Wnt/β-catenin信號通路也參與AngII介導(dǎo)的EMT過程。

3.6 微RNAs(miRNAs)與EMTmiRNAs是一種小的非編碼RNA分子,被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中,通常含有18～24個核苷酸,可調(diào)控人類基因組編碼的大多數(shù)基因的表達(dá)。其除了能調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)外,還能驅(qū)動包括DN在內(nèi)的許多腎臟疾病的病理。miRNAs可以通過調(diào)節(jié)EMT來影響DN的結(jié)局。大部分miRNAs通過影響TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來參與DN的EMT過程。Wang等[25]的實驗發(fā)現(xiàn),在NRK-52E中,TGF-β1和TGF-β2均可使miR-200a的表達(dá)水平降低,從而Smad-3的活性被減弱,導(dǎo)致TGF-β引起的EMT得到減輕。該研究還發(fā)現(xiàn),miR-141和miR-200a均可抑制TGF-β2的表達(dá),從而間接影響TGF-β1的表達(dá)水平。因此,miR-200a和miR-141既可作為TGF-β信號的下游介質(zhì),也可作為反饋調(diào)節(jié)介質(zhì)來影響TGF-β依賴的EMT。Sun等[26]的研究發(fā)現(xiàn),在TGF-β1處理HK-2細(xì)胞和糖尿病OLETF大鼠的腎皮質(zhì)中,miR-133b和miR-199b表達(dá)水平顯著上升。當(dāng)它們被抑制后,可有效緩解TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞和糖尿病OLETF大鼠的EMT和腎纖維化,這個過程被證明通過激活Sirt1實現(xiàn)。除TGF-β信號通路外,PI3K/AKT通路是miRNAs影響的另一常見通路。有研究證明,下調(diào)miR-320c導(dǎo)致PI3K/AKT信息通路被抑制,從而減輕了HG誘導(dǎo)的EMT,同時還減弱了HK-2細(xì)胞的遷移力和侵襲力[27]。

3.7 其他機(jī)制與EMT鋅指DNA/RNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子陰陽1(Yin Yang 1,YY1)參與包括DM在內(nèi)的多種代謝性疾病,并被證明是腎纖維化的一種新型調(diào)節(jié)因子。Yang等[28]的實驗表明,YY1在db/db小鼠及HK-2細(xì)胞中表達(dá)增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),HG通過mTORC1/P70S6K信號通路誘導(dǎo)YY1的過表達(dá)和核易位,并上調(diào)α-SMA的表達(dá),隨后通過EMT相關(guān)蛋白失調(diào)而促進(jìn)腎纖維化發(fā)生。因此,YY1在TEC的EMT中的重要作用不容忽視。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞活化和腎纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,被證明可促進(jìn)DN腎小管發(fā)生EMT。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1 (MALAT1)屬于lncRNA家族,因最早在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)而得名。Zhang等[29]的研究發(fā)現(xiàn),在HG刺激的HK-2細(xì)胞中,MALAT1的表達(dá)顯著增多,并導(dǎo)致TEC發(fā)生EMT。進(jìn)一步研究證明,這個過程是通過激活Wnt/β-catenin通路來觸發(fā)的。最近的研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)體系統(tǒng)可能也參與了腎小管EMT的發(fā)生。V-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域4 (VSIG4)是補(bǔ)體C3的受體。Gong 等[30]的實驗發(fā)現(xiàn)VSIG4在高糖刺激的HK-2細(xì)胞中上調(diào),并誘導(dǎo)EMT。當(dāng)VSIG4被抑制時,HG誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程也被抑制。進(jìn)一步研究表明,VSIG4是TGF-β的下游調(diào)節(jié)因子,其通過TGF-β信號通路促進(jìn)腎小管EMT。

4 展望

總之,TEC的EMT在DN腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色,為治療DN提供了一種全新的思路。在DN中,TEC發(fā)生EMT的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜且相互交織。因此,深入探討EMT的發(fā)生機(jī)制、調(diào)理機(jī)制、以及參與其中的信息通路將促進(jìn)新的治療策略的發(fā)展,為改善DN的預(yù)后創(chuàng)造更多的可能性。然而,目前關(guān)于TEC的EMT參與DN腎纖維化的研究主要集中在細(xì)胞實驗和動物實驗,未來我們需要在臨床患者中進(jìn)行更多的研究。