色素上皮衍生因子在結(jié)直腸癌中的作用

楊 鄴,文 武,張穎杰,蔣 燁,胡珊珊 ,陳鳳林

(1.成都市青白江區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科,四川 成都 610300;2.成都市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科,四川 成都 610017)

在全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是第三大最常見的癌癥,其死亡率排名第二[1],隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的提高其發(fā)病率還將繼續(xù)增加。目前國內(nèi)外公認(rèn)的治療手段主要包括了內(nèi)鏡和手術(shù)切除,術(shù)前降期放化療,復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的多學(xué)科綜合治療,靶向治療和免疫治療等[2]。局限性結(jié)直腸癌患者的5年相對存活率約90%,但是一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則下降至14%左右[3],20%患者在初診時就已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移從而失去了根治性手術(shù)的機會,非手術(shù)治療對提高患者的生存率有著舉足輕重的作用。色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor,PEDF)是一種有效的血管生成抑制劑[4],抑制腫瘤相關(guān)血管生成是控制癌癥進(jìn)展的一種有前景的治療方式,PEDF作為抗血管生成治療的標(biāo)志物對評估腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后具有潛在的臨床價值,目前PEDF在胰腺癌、黑色素瘤等多種實體腫瘤中的抗腫瘤作用已得到證實[5,6]。本文總結(jié)了PEDF在CRC中的表達(dá)情況,分析了PEDF在結(jié)直腸癌中可能的抗腫瘤機制及治療作用,同時探討了PEDF在CRC中的研究前景。

1 PEDF概述

色素上皮衍生因子是由418個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量約為50 KDa的分泌性糖蛋白,于1989年首次在人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中作為一種神經(jīng)元分化誘導(dǎo)因子被發(fā)現(xiàn),是Y79視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)劑[7],它與絲氨酸蛋白酶抑制劑 (Serpin) 超家族成員具有結(jié)構(gòu)和序列同源性[8]。PEDF蛋白帶有一個蛋白酶敏感暴露環(huán)的球狀構(gòu)象,包含C末端的絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族反應(yīng)環(huán)和N末端的促進(jìn)神經(jīng)活性的區(qū)域,它雖然在典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑溶液中具有折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),但PEDF屬于非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑[9]。

1999年Dawson等[10]首次發(fā)現(xiàn)PEDF具有抗血管新生活性的作用。人血漿中純化的PEDF可以被蛋白激酶2(CK2)及蛋白激酶A(PKA)磷酸化,PEDF的功能受細(xì)胞外磷酸化位點調(diào)節(jié),CK2 磷酸化的PEDF神經(jīng)營養(yǎng)活性降低,而其抗血管生成活性顯著增加[11]。PEDF基因由SERPINF1基因編碼,最早出現(xiàn)在脊椎動物中,該基因的調(diào)節(jié)和生物學(xué)作用在脊椎動物中得以保留,人類PEDF基因位于第17號染色體短臂1區(qū)3帶1亞帶(17p13.1),這是一個包含一組癌癥相關(guān)基因的區(qū)域,基因全長約15.6 kb,分為了8個外顯子和7個內(nèi)含子[12,13],它在哺乳動物物種的進(jìn)化中顯示出了強烈的保守性,PEDF基因在眼、乳腺、宮頸、胰腺、肝臟、食管、結(jié)腸等組織中廣泛表達(dá)。

2 PEDF在各種腫瘤中的作用

PEDF在眼部黑色素瘤動物模型中抑制了抗血管生成反應(yīng)從而減少了肝轉(zhuǎn)移[6],乳腺癌組織中PEDF表達(dá)下降,它與層粘連蛋白相互作用抑制了NADPH氧化酶誘導(dǎo)的ROS生成以及VEGF和MMP-9的表達(dá),進(jìn)而對乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移起抑制作用[14]。PEDF在宮頸癌組織中表達(dá)水平也下降,它通過雙重抑制PI3K/Akt信號通路降低宮頸癌HeLa細(xì)胞活性和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)[15]。在胰腺癌組織中PEDF的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān),它減弱了纖維炎癥反應(yīng)從而限制胰腺癌的進(jìn)展[5]。雖然PEDF在大部分腫瘤中表達(dá)下調(diào)并抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移,但它在部分腫瘤中也存在相反的作用。與鄰近的正常組織相比,肝細(xì)胞癌中PEDF表達(dá)增加,過表達(dá)的PEDF顯著增強了肝細(xì)胞癌體內(nèi)外癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移[16],對于PEDF的這種相反作用,Li等[17]建立了異位腫瘤移植小鼠模型,通過 PEDF 對腫瘤血管生成和FFA代謝的雙重調(diào)節(jié)揭示了PEDF在HCC發(fā)展中相反的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外功能,并表明PEDF過表達(dá)可以在早期顯著誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的生長,而在晚期則輕微降低腫瘤生長。同樣,PEDF在食管癌患者腫瘤組織和食管癌細(xì)胞中也過度表達(dá),PEDF在食管鱗狀細(xì)胞癌中也可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[18]。

3 PEDF在CRC中的表達(dá)情況

3.1 CRC組織中PEDF水平在患者CRC組織PEDF表達(dá)差異性相關(guān)研究中,檢測方法多種多樣,通過采用反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(westernblot)、免疫組化染色法(immunohistochemical staining,IHC)實驗表明,CRC組織中PEDF表達(dá)水平比癌旁組織低,且其表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期呈負(fù)相關(guān)[19,20],腫瘤組織中PEDF表達(dá)的降低與生存時間的縮短顯著相關(guān)[19];利用熒光定量PCR(FQ-PCR)方法研究發(fā)現(xiàn)CRC組織中PEDF mRNA的表達(dá)也明顯低于相應(yīng)癌旁組織,其表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義,早期患者CRC組織中PEDFmRNA的表達(dá)比晚期患者明顯升高,腫瘤組織中PEDF mRNA的表達(dá)量與組織分化程度呈正相關(guān)[21];此外,Harries等[22]在采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)和IHC方法對其研究也表明PEDF在CRC細(xì)胞組織中表達(dá)下調(diào),且隨著腫瘤分級的惡化而顯著下降,同時其研究結(jié)果還表明在轉(zhuǎn)錄分析中PEDF在女性CRC中的表達(dá)比男性高(這一結(jié)果與W?gs?ter等[23]的觀點相反),在直腸癌中的表達(dá)比結(jié)腸癌中高,在IHC中,PEDF在高分化的粘液腺癌中的表達(dá)更明顯,而在腫瘤位置的表達(dá)上并沒有明顯差異。上述研究雖然利用了不同的檢測方法,但結(jié)果都顯示PEDF在CRC組織中表達(dá)下降,這與早期W?gs?ter等[23]通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測定量研究所示的在CRC組織中的PEDF表達(dá)與配對正常組織相比并沒有顯著差異相矛盾,導(dǎo)致結(jié)論差異的原因需要借助后續(xù)研究進(jìn)一步明確。

3.2 CRC細(xì)胞中PEDF水平在采用體外功能試驗法檢測重組PEDF處理對細(xì)胞功能的影響的研究中發(fā)現(xiàn),PEDF在CRC細(xì)胞系和CRC細(xì)胞中的表達(dá)低于正常結(jié)直腸成纖維細(xì)胞[22];Ji等[19]的研究表明PEDF在正常黏膜、結(jié)直腸原發(fā)癌和結(jié)直腸腺瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中均有表達(dá),然而,PEDF在癌細(xì)胞中的表達(dá)比正常黏膜明顯下降。

3.3 CRC血液中PEDF水平2010年W?gs?ter等[23]對CRC患者組織和血漿中PEDF蛋白表達(dá)做了首次定量分析研究,研究顯示CRC患者組的血漿PEDF水平明顯低于健康對照組,健康對照組的男性血漿PEDF水平明顯高于女性,然而CRC患者的血漿PEDF水平與性別或其他臨床特征無關(guān)。其中CRC血清中PEDF的表達(dá)低于健康對照組這一結(jié)果在Ji等[19]的研究中也得到了證實,此外還發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺瘤患者與健康對照組血清PEDF之間無顯著差異,低血清PEDF水平與TNM分期和肝轉(zhuǎn)移以及較差的總生存率相關(guān),血清PEDF水平隨CRCTNM分期惡化而顯著降低,黏液性腺癌患者血清PEDF水平明顯高于腺癌患者。

總之,大量研究顯示PEDF在CRC組織、細(xì)胞、血液中的表達(dá)降低,并與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移有顯著關(guān)系,這種表達(dá)的差異性可能對CRC患者的治療和預(yù)后的評估有指導(dǎo)意義。

4 PEDF在CRC中可能的抗腫瘤機制

4.1 降低微血管密度、抑制腫瘤血管的生成在實體瘤的發(fā)展過程中,新生血管生長是必要的。PEDF可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Fas配體(FasL),內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡可以通過FasL與Fas受體結(jié)合來誘導(dǎo),而高濃度的抗凋亡蛋白存在于正常血管內(nèi)皮細(xì)胞使得其不表達(dá)Fas受體,PEDF可選擇性抑制新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并保留預(yù)先存在的血管系統(tǒng)[24]。裝載在PLGA納米粒中的PEDF基因(PEDF- PGLANPs)通過降低微血管密度和抑制血管生成在體內(nèi)抑制小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞(CT26)的生長[25]。C26荷瘤小鼠模型中,裝載PEDF基因的CPPC納米顆粒(D-NPs)與負(fù)載空質(zhì)粒的PEG-PLGA納米顆粒(Dv-NPs)相比,6小時內(nèi)二者均在基質(zhì)凝膠表面形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu),但D-NPs顯著破壞了管的形成,同時D-NPs處理的小鼠的海藻酸鹽珠中的新生血管明顯稀疏,D-NPs通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和小管狀形成、阻斷體內(nèi)外血管生成來抑制腫瘤生長和延長荷瘤小鼠的存活時間[26]。Bao等[27]基于CD31作為血管生成的生物標(biāo)志物這一基礎(chǔ),在注射CT26細(xì)胞的小鼠模型及肺轉(zhuǎn)移模型中研究了iRGD肽制備的腫瘤靶向PEDF-DNA脂質(zhì)體(R-LP/PEDF)對血管生成的影響,經(jīng)LP/PEDF和R-LP/PEDF治療后,腫瘤組織中CD31陽性細(xì)胞較少,LP/PEDF和R-LP/PEDF治療抑制了腫瘤組織的血管生成并起到了抗腫瘤的作用。此外,在荷瘤小鼠模型中PEDF+5-FU組腫瘤組織中微血管數(shù)量較對照組和5FU組明顯減少,PEDF和5-FU聯(lián)合用藥可對CT26結(jié)腸癌細(xì)胞起到協(xié)同治療作用,且效果優(yōu)于單獨用5-FU[28]?？傊?各項研究發(fā)現(xiàn)PEDF可通過降低微血管密度、抑制腫瘤血管新生起到抗CRC的作用。

4.2 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡在體內(nèi)外,PEDF-PLGANPs可誘導(dǎo)CT26凋亡來抑制CT26腫瘤的生長[25];在接受新輔助放療的局部晚期直腸癌研究中,PEDF可以抑制直腸癌細(xì)胞的增殖并抑制裸鼠異種腫瘤生長[29];腺病毒轉(zhuǎn)染PEDF可以增強腫瘤細(xì)胞的凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞的生長[30]。在靜脈注射C26皮下腫瘤模型中裝載PEDF基因的CPPC納米顆粒(D-NPs)具有顯著的抗腫瘤活性并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[26];通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,腫瘤靶向的PEDF-DNA脂質(zhì)體(R-LP/PEDF)對轉(zhuǎn)移性CRC模型起到有效的抗腫瘤作用[27]。PEDF+5-FU組荷瘤小鼠腫瘤體積小于5-FU組,PEDF+5-FU組細(xì)胞凋亡率高于5-FU組,且抗腫瘤的效果優(yōu)于5-FU組[28]。上述大量研究均表明PEDF在CRC中的抗腫瘤作用與其可以抑制腫瘤細(xì)胞的增值、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

4.3 防止腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的遷移和侵襲在轉(zhuǎn)移中有重要作用,大約90%的癌癥患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移而不是原發(fā)腫瘤的生長,轉(zhuǎn)移性CRC患者預(yù)后較差。高水平的PEDF表達(dá)通過抑制局部晚期直腸癌患者的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移來促進(jìn)無病生存期時間[29];通過腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)分泌PEDF的間充質(zhì)干細(xì)胞顯著抑制了CT26結(jié)直腸腹膜癌擴散小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移和惡性腹水形成[30];重組PEDF治療顯著降低了CRC細(xì)胞系的CRC細(xì)胞遷移和侵襲率,使細(xì)胞粘附增加,預(yù)防CRC轉(zhuǎn)移擴散[22];并且PEDF衍生肽可降低結(jié)腸癌細(xì)胞系異種移植腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[31]。在CRC中,防止腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移是PEDF抗腫瘤的機制之一。

4.4 受體介導(dǎo)的信號通路血漿中PEDF可以被CK2及PKA磷酸化,其功能受細(xì)胞外磷酸化位點調(diào)節(jié)[11],在HCT116(結(jié)腸癌)異種移植模型中,三重擬磷突變體 (EEE-PEDF)可以提供比野生型PEDF(WT-PEDF)更有效的抗血管生成和抗癌活性[32];JNK1/2 和 p38α分別且彼此獨立地調(diào)節(jié)野生型PEDF及其擬磷突變體的凋亡和抗遷移活性,PEDF 的抗血管生成信號也主要通過激活p38和JNK應(yīng)激相關(guān)激酶發(fā)生,與 WT-PEDF 相比,EEE-PEDF增強的抗血管生成和抗癌特性是通過與層粘連蛋白受體的更強的結(jié)合及更強的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)效應(yīng)實現(xiàn)的,JNK和p38 MAPKs信號通路差異調(diào)節(jié)PEDF的促凋亡和抗遷移活性[33]。P53信號通路參與了CRC細(xì)胞增殖、有絲分裂及細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的生物過程,也參與了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中 PEDF誘導(dǎo)的自噬[34],通過美國癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫識別與PEDF相關(guān)的基因,在所有674個預(yù)先定義的“Reactome”基因集中,在TCGA直腸癌數(shù)據(jù)集以及局限性晚期直腸癌隊列分析中PEDF的表達(dá)均與雙鏈斷裂(DSBs)修復(fù)通路呈負(fù)相關(guān),與G蛋白激活通路呈正相關(guān),使用在線數(shù)據(jù)庫STRING研究PEDF與相關(guān)基因之間的相互作用表明了P53是PEDF的下游基因,通過生物信息學(xué)分析研究發(fā)現(xiàn)PEDF通過激活P53調(diào)控雙鏈斷裂修復(fù)通路和激活G蛋白激活通路發(fā)揮抗直腸癌的作用[29]。血管生成刺激劑和抑制劑之間的不平衡可能導(dǎo)致新生血管形成,PEDF可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF-A的表達(dá)和分泌[4],PEDF和VEGF是相互調(diào)控的信號,PEDF信號通路可能成為未來的一種輔助治療工具,可降低IC50劑量、不良反應(yīng)和治療成本[31]。雖然CRC中介導(dǎo)PEDF抗腫瘤作用的信號通路機制尚未完全描述,但這仍將是一個有潛力的研究方向。

5 PEDF在CRC中的治療作用

新輔助放療可以降低II期、III期局部晚期直腸癌患者的局部復(fù)發(fā)率,PEDF可作為預(yù)測局部晚期直腸癌患者對新輔助放療反應(yīng)的生物標(biāo)志物[29]。對于能耐受化療的轉(zhuǎn)移性CRC患者,聯(lián)合化療是其一、二線治療[2],但腫瘤的耐藥性嚴(yán)重抑制了其治療效果,結(jié)腸癌細(xì)胞系對PEDF 衍生肽(CT/CTE)的急性和慢性暴露降低了對常規(guī)結(jié)腸直腸癌化療(如奧沙利鉑或伊立替康)的耐藥性[31]。在CRC全身化療中,5-氟尿嘧啶是重要組成部分,PEDF聯(lián)合5-FU用藥對CT26結(jié)腸癌細(xì)胞的治療有協(xié)同作用,且治療效果比單用5-FU治療更佳[28]。通過改良的雙乳液溶劑蒸發(fā)方法,將PEDF和化療藥物紫杉醇(PTX)同時封裝在同一納米顆粒中,雙載藥納米粒子(D/P-NPs)對C26和A549細(xì)胞具有增強的抗腫瘤作用,在C26皮下腫瘤模型中該種聯(lián)合療法也被證明有顯著改善抗腫瘤的作用[35]。

靶向藥物治療是適用于大多數(shù)CRC患者的一線治療,PEDF在實體腫瘤的靶向治療中已取得了一定成效。在體外,靶向癌癥的PEDF-DNA脂質(zhì)體 (R-LP/PEDF) 對CRC細(xì)胞的侵襲、遷移和促凋亡具有增強的抑制作用,并且可以減少肺中的轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)、延長轉(zhuǎn)移性CRC小鼠模型的存活時間[27]。在體內(nèi)抗腫瘤活性試驗中,共載索拉非尼(SORA)與PEDF基因的PEG-PLGA納米粒的抗腫瘤作用優(yōu)于單載藥納米粒及游離藥物組[36]。將索拉非尼和PEDF封裝在基于PEG-PLGA 的納米粒子中獲得共包封納米粒子(Sora@PEDF-NPs),在急性毒性試驗中,Sora@PEDF-NPs 在小鼠體內(nèi)的毒性低于游離 Sora[37]。

6 總結(jié)和展望

研究表明PEDF在CRC中的表達(dá)下降,它與腫瘤的惡性程度、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān),PEDF可以通過降低微血管密度、抑制腫瘤血管的生成和腫瘤細(xì)胞的增殖遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,以及介導(dǎo)信號通路對CRC起到抗腫瘤的作用,同時它能降低化療藥物的耐藥性,可以作為新輔助放療反應(yīng)的生物標(biāo)志物,并對化療、靶向治療、基因治療起到協(xié)同增強作用,且在目前的研究中PEDF安全性良好,未發(fā)現(xiàn)PEDF的毒性作用。PEDF在CRC中表達(dá)水平的差異性及相關(guān)性可能為CRC患者的臨床診斷和預(yù)后判斷提供一定的指導(dǎo)意義,但縱觀國內(nèi)外現(xiàn)有的研究,其研究對象多數(shù)采用細(xì)胞株、實驗動物等,且?guī)缀跷瓷婕按竽c息肉及腺瘤等癌前病變,后續(xù)的研究中我們可以考慮從正常組織到癌前病變再到大腸癌的PEDF表達(dá)情況著手對比分析及研究,從而評估PEDF作為CRC的診斷或評估預(yù)后的生物學(xué)因子的可行性。同時有必要對PEDF在CRC發(fā)展中的調(diào)控機制進(jìn)行進(jìn)一步研究,以期它可能成為CRC治療中的新靶點。