侯 哲，婁曉鳴，李 昂，黃長兵

(蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇蘇州 215008)

植物的生長發(fā)育離不開光合作用，而光合作用最重要的場地在葉綠體中。rbcL基因在光合作用的整個過程中起到至關重要的作用，如rbcL基因可以編碼Rubisco酶中的大亞基，從而催化光合作用的核心過程：羧化反應與加氧反應。由此可以看出，rbcL基因?qū)χ参锏膬艄夂下视兄种匾挠绊慬1]。rbcL基因在不同植物、不同自然條件下會產(chǎn)生不同的耐受性，因此基因的表達也會各不相同，這對植物的光合作用也會產(chǎn)生一定的影響[2]。所以，了解其密碼子偏好性可以更好地理解不同植物在不同自然條件下是如何適應與進化的。因此，對于rbcL基因密碼子偏好性的研究是非常有意義的[3]。

充分了解植物的密碼子偏好性為理解物種進化提供了重要的信息[3]。密碼子是指在mRNA上每3個相鄰核苷酸排列成的三聯(lián)體，一種密碼子決定一種氨基酸，利用A、U、G、C，可以組成64種密碼子，除UAA、UGA和UAG外的61種密碼子用來編碼常見的20種氨基酸[4]。而一種氨基酸可以由一至多個密碼子編碼，由于基因突變和自然選擇的存在，在不同物種翻譯過程中，氨基酸的編碼中出現(xiàn)偏愛某些密碼子的現(xiàn)象，稱為密碼子的偏好性[5]。漂變、突變、基因表達水平、自然選擇及tRNA豐度等都會對物種的密碼子使用情況產(chǎn)生影響[6-9]。

唐松草屬植物在全世界大約有150種，在中國各地有76種，其中約30種由于富含生物堿、三萜、酚類及黃酮等具有藥理活性的化合物，因而具有非常高的藥用價值，根和莖常被作為傳統(tǒng)的民間藥物，用于治療流感、癌癥、高血壓、細菌感染及結(jié)膜炎等癥狀[10]。目前關于唐松草屬的研究內(nèi)容較少，且多是對其化學成分的研究[10]。迄今為止，有關唐松草屬葉綠體基因組方面的研究還比較少，對其rbcL基因密碼子偏好性的研究也未見報道。因此，筆者從NCBI上下載唐松草屬目前已公布的所有葉綠體基因組，并從中獲取rbcL的基因序列，深度分析其序列特征，并對其密碼子使用情況進行分析，優(yōu)選出使用頻率最高的密碼子，為其后續(xù)的葉綠體基因組應用、種質(zhì)資源保護及基因功能等研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 唐松草屬植物11條rbcL基因序列獲取

于2022年5月20日，在蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院植物生理實驗室開展本研究，從NCBI公共數(shù)據(jù)庫上下載唐松草屬目前已知的所有葉綠體基因組序列，并從蛋白編碼序列文件中獲取rbcL基因序列，用于后續(xù)密碼子偏好性分析。

1.2 密碼子組成分析

利用CodonW軟件(http：//codonw.sourceforge.Net)分析11條序列的密碼子偏好參數(shù)：(1)密碼子的出現(xiàn)次數(shù)(N)；(2)有效密碼子數(shù)(ENC)；(3)計算出RSCU值，并將RSCU>1的密碼子過濾到高頻密碼子中，并分別用TBtools[11]及R語言繪圖，對RSCU的聚類分析在SPSS在線軟件(https：//spssau.com/help.html)中進行。使用EMBOSS在線網(wǎng)站(https：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/)分析星毛唐松草葉綠體基因組中各個密碼子的GC1、GC2、GC3和GCall，最后用SPSS在線軟件(https：//www.spssau.com/102000000)對各個參數(shù)進行了相關性分析。

1.3 中性繪圖分析

通過中性繪圖分析，可以對密碼子的使用偏好性的影響因素進行分析[12]。以GC3為橫坐標，GC1與GC2的平均值為縱坐標，然后繪制二維散點圖并對二者進行相關性分析。如果圖中的分散點沿對角線分布集中，則回歸系數(shù)接近1，表明密碼子偏好性主要受突變的影響。反之，如果圖中的分散點不沿對角線分布，說明選擇對該基因的密碼子偏好性產(chǎn)生了重要影響[12]。

1.4 ENC-plot 繪圖分析

ENC既可直觀反映基因密碼子使用模式，也可以用于判斷突變或選擇對基因密碼子偏好性的影響，ENC值一般在20～61區(qū)間。當ENC接近20時，表明突變是密碼子偏好的主要影響因素，而當ENC接近61時，說明選擇起到了決定性作用[13]。以11條rbcL基因序列中的ENC值為縱坐標，GC3作為橫坐標，然后用R語言作圖，構(gòu)建ENC值的期望曲線，并結(jié)合頻率對差異進行一定量化分析。

1.5 PR2-plot繪圖

PR2-plot分析，根據(jù)每個密碼子的第3位數(shù)計算A、T、C和G的含量。首先橫坐標選取A3/(A3+T3)值，而縱坐標為G3/(G3+C3)值，然后繪制 PR2-plot 散點圖。

1.6 聚類分析

11條基因通過MAFFT軟件[14]比對后，用MEGA 7.0[15]軟件的鄰接法(NJ)生成系統(tǒng)進化樹。

1.7 密碼子使用頻率比較

通過計算唐松草屬植物與模式植物基因組序列的密碼子使用頻率的比值，可以得出它們與模式植物的密碼子使用偏好性的不同程度，當比值在 0.5～2.0區(qū)間內(nèi)，則差異較小[16]。在密碼子使用數(shù)據(jù)庫中分別下載幾種模式植物的密碼子使用頻率，用在線軟件CUSP(https：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/)計算唐松草屬植物的密碼子使用頻率后，計算相對使用頻率，再用Tbtools[11]繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐松草屬rbcL基因信息

從公共數(shù)據(jù)庫NCBI中獲取11條唐松草屬植物的rbcL基因信息(表1)。

表1 11種唐松草屬植物rbcL基因信息

2.2 密碼子相關偏性指數(shù)分析

為了研究唐松草屬植物中rbcL基因密碼子使用偏差的程度，計算了11個基因的有效密碼子數(shù)(ENC)的值(表2)。ENC值的范圍為50.531～50.992，平均值為50.757，其中細唐松草的rbcL基因的ENC值最小，而貝加爾唐松草的ENC值最大，雖然不同植物的ENC值各不相同，但是差別不是很大(表2)，說明11種唐松草植物的rbcL基因密碼子的偏好性不強。此外，筆者發(fā)現(xiàn)不同基因的GC1、GC2、GC3含量存在明顯的差異，各基因總體的GC含量為0.445，表明rbcL基因偏好使用A與T堿基。而GC1、GC2、GC3的平均含量分別為0.583、0.435、0.321。其中，第1位密碼子的GC含量最大，而第3位密碼子的GC含量最小，表現(xiàn)出明顯的差異。第3位密碼子的GC含量差異最明顯，而GC3也是評估密碼子偏好性的重要指標。第3位密碼子A、T、C、G的含量分別為0.387、0.477、0.155、0.218，表明rbcL基因偏好使用A與T結(jié)尾的密碼子。

表2 11種唐松草屬植物rbcL基因的堿基類別及有效密碼子(ENC)

2.3 密碼子RSCU分析

11個唐松草屬植物的rbcL基因共包含5 236個密碼子，其中蛋氨酸和色氨酸僅由1個密碼子編碼，分別為ATG和TGG。其余的氨基酸由2～6個密碼子編碼，并表現(xiàn)出明顯的密碼子使用偏好性(圖1)。11個唐松草屬植物的rbcL基因中，最豐富的是亮氨酸(Leu)，共包含461(8.8%)個。同時，在編碼亮氨酸的6個密碼子中，CUA的RSCU值最大，為1.72(表3)，表明CUA密碼子具有很高的偏好性，是最常用的密碼子。

表3 唐松草屬rbcL基因RSCU分析

從圖2可以看出，11個唐松草屬rbcL基因中，共包含27個使用度較高的密碼子，即RSCU值大于1，在這27個密碼子中，有23個密碼子均以A或者U結(jié)尾，而僅有4個密碼子ACC、CGC、AUC和UCC以C結(jié)尾，表明rbcL11個基因的密碼子均偏好以A或者U結(jié)尾。繼續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，密碼子使用度最高的3個密碼子(RSCU值大于2)，CGU、UCU、ACU均以U結(jié)尾。表明在A與U中，rbcL基因更偏好使用U結(jié)尾的密碼子。

2.4 密碼子參數(shù)相關性分析

對密碼子3個位置的GC含量及ENC值做相關性分析(表4)，GC1與GC2的相關系數(shù)為0.350，顯示出顯著的相關性；GCall與GC1的相關系數(shù)為0.710，極顯著相關，與GC2的相關系數(shù)為0.615，也極顯著相關，而與GC3的相關系數(shù)為0.405，顯著相關。GC3與GC1的相關系數(shù)為0.060，與GC2的相關系數(shù)為-0.098，均不具有相關性，表明rbcL基因中，密碼子第1位與第2位的堿基組成具有高度的相似度，但是第3位的堿基組成與第1位和第2位具有明顯的不同。ENC值與GC1和GC2的相關系數(shù)分別為0.255和-0.049，相關性不顯著，而與GC3為0.335，顯著相關，說明在rbcL基因中，密碼子第3位的堿基組成與密碼子的偏好性顯著相關，第3位的堿基組成對密碼子的偏好性有十分重要的影響。GC3與密碼子的出現(xiàn)次數(shù)(N)也具有顯著相關性，表明密碼子第3位的堿基組成對密碼子的出現(xiàn)次數(shù)也有一定的影響。ENC值與N不相關，說明基因序列的大小對密碼子的偏好性影響較弱。

表4 rbcL基因GC1、GC2、GC3、GCall、ENC及GC12的相關性分析

2.5 密碼子中性繪圖分析

GC3與GC12的相關性很弱(圖3)，相關系數(shù)非常低，表明3個位置的密碼子含量存在明顯的不同。在生成的所有基因的中性圖中，回歸線的斜率接近于0，而且大多數(shù)繪圖點不在對角線上或沿對角線分布。這些數(shù)據(jù)給出的證據(jù)表明，密碼子的偏好是由自然選擇主導的[12]。

2.6 ENC-plot結(jié)果

ENC-plot結(jié)果表明，所有的基因位點均偏離了預期的曲線，表明所有rbcL基因的ENC值低于預期值，位于曲線下方(圖4)。因此，這些結(jié)果證實，11個唐松草屬植物的rbcL基因密碼子偏好性大部分來自于選擇的影響[13]。且11個基因位點距離非常接近，表明自然選擇對11個唐松草屬物種的密碼子偏好的影響相差不大[13]。

2.7 PR2-plot分析

PR2-plot分析結(jié)果見圖5，可以看出11個唐松草屬植物的rbcL基因全部位于左下方，表明這11個基因密碼子第3位的堿基使用情況為T大于A且C大于G，也就是說相比嘌呤C/T，嘧啶A/G的使用頻率要更低。PR2-plot分析結(jié)果表明，選擇對唐松草屬rbcL基因密碼子的使用模式影響較大。

2.8 基于RSCU 和CDS 的聚類分析

分別使用CDS序列和所有密碼子的RSCU值對11個唐松草屬進行聚類分析，結(jié)果(圖6)顯示，NJ樹與聚類圖分別將11個唐松草屬植物分為4～5個分枝，表明不同唐松草屬植物rbcL的氨基酸編碼模式具有一定的差異，雖然NJ樹與聚類圖的內(nèi)部分枝存在明顯的不同，但在分枝水平上，也有一致的聚類結(jié)果，比如都將星毛唐松草、粘唐松草聚為1個分枝，將朝鮮唐松草和唐松草葉銀蓮花聚在一起，且都將瓣蕊唐松草、細唐松草、歐洲唐松草及亞歐唐松草聚在1個分枝，表明用RSCU值做聚類分析，在一定程度上也可以反映唐松草屬植物的親緣關系，即同一屬內(nèi)不同植物的密碼子使用偏好性與其親緣關系也存在著某種程度的關聯(lián)。

2.9 與模式物種相對密碼子使用頻率分析

唐松草屬植物與模式植物基因組序列的密碼子使用頻率結(jié)果表明，與唐松草屬rbcL相比，大腸埃希菌有36個密碼子的比值大于2，最大值為5.27(AGA)，而酵母有30個密碼子的比值大于1，最大值為2.61(GUU)，表明相比大腸埃希菌來說，酵母與唐松草屬植物的密碼子使用偏好性更為接近，因此可以選用酵母作為其表達受體。煙草有29個密碼子比值大于2，最大值為2.02(AAG)，擬南芥有26個密碼子比值大于2，最大值為2.001(GCA)，番茄有29個密碼子的比率大于2，最大值為2.09(GUG)(圖7)，這些結(jié)果充分說明，與番茄和煙草相比，擬南芥更適用于唐松草屬rbcL基因的遺傳轉(zhuǎn)化受體。

3 討論與結(jié)論

rbcL是植物重要的編碼基因，主要位于葉綠體基因組，葉綠體基因組結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，因而植物葉綠體基因組常被用于群體進化、種質(zhì)資源鑒定及群體遺傳學研究[17]。密碼子在生物體內(nèi)信息傳遞方面發(fā)揮著不可或缺的作用，功能基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及表達同樣受到密碼子的影響，因而密碼子的偏好性也會對功能基因的表達產(chǎn)生重要的作用[18]。密碼子的使用偏好與基因表達密切相關表達，并影響到基因組中的蛋白質(zhì)和mRNA水平，密碼子獨有的使用方法及使用偏好性會在植物長期的進化進程中逐漸累積，因而在不同的植物中，甚至同一植物不同基因間，密碼子的偏好性也會各有不同，對其進行深入研究可以更好地理解功能基因的表達模式及進化方式，從而進一步了解不同物種間的進化關系[19]。

11個唐松草屬rbcL基因中，最豐富的氨基酸是亮氨酸，共包含461(8.8%)個，這與其他被子植物葉綠體基因組所報道[20]的一致。更有意思的是，大多數(shù)以A/U結(jié)尾的密碼子的RSCU值都大于1，而以C/G結(jié)尾的則小于1，這一模式與其他植物的葉綠體基因組的使用模式一致[21]。植物葉綠體基因組rbcL基因中，密碼子第3位通常比較保守，選擇壓力對其影響不大，所以GC3是密碼子偏好性評估的一項重要指標[21]。本研究發(fā)現(xiàn)不同基因的GC1、GC2、GC3含量存在明顯的差異，GC1、GC2、GC3的平均含量分別為0.583、0.435、0.321。其中，GC1含量最大，而GC3含量最小，且GC1與GC2顯著相關，而GC3與GC1、GC2、GC12均沒有相關性，表明星毛唐松草的密碼子A/U含量比C/G含量要多，中性繪圖分析結(jié)果表明，密碼子的偏好性受到了選擇的影響，這與多種植物的研究結(jié)果[20-21]一致。

11個唐松草屬rbcL基因中，ENC值均大于45，表明這些基因的密碼子具有較弱的偏好性。ENC-plot分析結(jié)果可以看出，該基因主要受到了選擇作用的影響，巨桉的葉綠體基因組密碼子偏好研究中，同樣也發(fā)現(xiàn)了這一規(guī)律[22]。PR2-plot繪圖表明，密碼子第3位的堿基出現(xiàn)的規(guī)律為T、G大于A、C，這一結(jié)果體現(xiàn)出選擇對11個唐松草屬rbcL基因中密碼子偏好性影響較大，突變及其他因素的作用較小，這與原曉龍等在蒜頭果(Malaniaoleifera)研究中發(fā)現(xiàn)的規(guī)律[12]一致?？偨Y(jié)以上結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，11個唐松草屬rbcL基因中，密碼子使用偏好性與多種因素有關，但是選擇的作用最為明顯。

雖然基于基因序列的NJ樹與基于RSCU值的聚類圖的內(nèi)部分枝存在明顯的不同，但在分枝水平上，也有一致的聚類結(jié)果，表明用RSCU值做聚類分析，在一定程度上也可以反映唐松草屬植物的親緣關系，二者之間存在一定的對應關系。RSCU聚類樹結(jié)果的偏差可能是由于僅選取RSCU值這一單一的數(shù)據(jù)導致的，結(jié)合密碼子偏好性的其他數(shù)據(jù)，可能會降低誤差，在苔蘚植物中，也得出了同樣的結(jié)論[23]。

模式物種通常被選作目標基因的異源表達受體，來完成轉(zhuǎn)基因試驗，而如果二者的基因密碼子使用的偏好性具有相似性，這一過程會更加順利，目標基因可以高效表達[24]。研究發(fā)現(xiàn)，酵母與唐松草屬植物的密碼子使用偏好性更為接近，可以作為其表達受體，而擬南芥更適用于唐松草屬rbcL基因的遺傳轉(zhuǎn)化受體[25]。