周海平 張 帆 陳 凱 申聰聰 朱雙兵 邱先進 徐建龍,,5,*

水稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性全基因組關(guān)聯(lián)分析

周海平1張 帆2陳 凱3申聰聰3朱雙兵3邱先進4,*徐建龍2,3,5,*

1溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院 / 浙南作物育種重點實驗室, 浙江溫州 325000;2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081;3嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室深圳分中心 / 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)基因組研究所, 廣東深圳 518210;4長江大學農(nóng)學院, 湖北荊州 434025;5海南省崖州灣種子實驗室, 海南三亞 572024

稻瘟病是一種對全球水稻生產(chǎn)威脅極大的真菌性病害, 鑒定抗稻瘟病基因并將其導(dǎo)入到現(xiàn)有感病品種改良品種的抗性是控制這種病害的有效途徑。本研究利用5個稻瘟病菌株鑒定了212份秈稻和235份粳稻種質(zhì)資源的苗瘟抗性, 分別篩選到8個和12個抗全部5個菌株的秈稻和粳稻種質(zhì)材料。采用全基因組關(guān)聯(lián)分析在秈粳混合群體、秈稻和粳稻種質(zhì)資源中共定位到43個影響水稻苗瘟抗性的QTL, 抗GD00-193、GD08-T19、GD17-CQ16、HB1708和HLJ13-856菌株的QTL分別為9、4、14、14和2個。其中, 12個抗病QTL僅在秈稻亞群中檢測到, 7個僅粳稻亞群中檢測到, 1個為秈粳2個亞群共同檢測到, 說明秈稻抗稻瘟病總體好于粳稻, 而且稻瘟病抗性存在明顯的秈粳分化。同時影響水稻對2個及2個以上菌株的抗性或在2個及2個以上群體中同時被定位到的QTL共計11個, 利用候選區(qū)間關(guān)聯(lián)分析和單倍型分析鑒定到23個抗病候選基因, 不同抗病候選基因在秈、粳群體中的分布頻率不同。研究結(jié)果為水稻品種稻瘟病抗性分子改良提供種質(zhì)資源和有利基因信息及不同抗病基因的育種利用策略。

稻瘟病抗性; 種質(zhì)資源; 全基因組關(guān)聯(lián)分析; 數(shù)量性狀位點; 有利等位基因

水稻是世界上最重要的糧食作物之一, 是全世界一半以上人口的主食。由稻瘟病菌()引起的稻瘟病每年都給水稻生產(chǎn)造成至少10%左右的產(chǎn)量損失, 嚴重時減產(chǎn)幅度高達40%～ 50%[1]。目前防治稻瘟病主要采用化學防治, 但該方法不僅成本高, 而且會造成環(huán)境污染。研究水稻抗稻瘟病的遺傳基礎(chǔ), 挖掘影響水稻抗稻瘟病的重要有利基因, 利用分子育種技術(shù)選育抗稻瘟病的水稻品種是解決這一問題最經(jīng)濟有效的方法。

我國稻瘟病菌主要分為8個亞群和50余個生理小種, 不同生理小種的遺傳差異很大[2-3], 而且稻瘟病菌的致病性變異很快, 從而導(dǎo)致抗病品種的稻瘟病抗性喪失頻繁[4]。稻瘟病抗性分為水平抗性和垂直抗性, 垂直抗性由少數(shù)主效基因控制, 存在生理小種?；? 通常表現(xiàn)為抗性強但很容易喪失。水平抗性由微效多基因控制, 無生理小種?；訹5], 表現(xiàn)為有一定程度的發(fā)病但對產(chǎn)量影響不大。因此, 聚合垂直抗性和水平抗性基因?qū)μ岣咚酒贩N的稻瘟病抗性, 延緩抗性喪失更有優(yōu)勢[6]。隨著遺傳學和分子標記技術(shù)的發(fā)展, 遺傳學家利用F2、重組自交系和導(dǎo)入系等遺傳群體已定位了超過500個影響水稻稻瘟病抗性的QTL (https://www.gramene.org/), 其中37個基因已被成功克隆[7]。

雖然基于雙親遺傳群體的QTL定位方法是挖掘水稻稻瘟病抗性基因的重要途徑, 但這種方法也存在一定的局限性。例如, 構(gòu)建遺傳群體需要花費大量的時間, 且由于群體樣本有限, 導(dǎo)致QTL定位的精度較低[8]。此外, 由于群體只攜帶雙親2種基因型, 因而只能比較每一QTL親本2種等位基因的優(yōu)劣, 無法挖掘該位點種質(zhì)資源中存在的優(yōu)異等位基因。近年來, 基于連鎖不平衡的全基因組關(guān)聯(lián)分析已被成功應(yīng)用于各種復(fù)雜性狀的遺傳解析[9-11]。利用全基因組關(guān)聯(lián)分析策略, Wang等[12]采用336份來源于中國的秈稻種質(zhì)資源和80萬的SNP基因型定位到了抗16個稻瘟病菌株的30個QTL; Kang等[13]利用420份水稻種質(zhì)資源和44,000個SNP基因型定位到影響水稻對5個稻瘟病菌株抗性的97個QTL; Mgonja等[8]利用70份秈稻和92份溫帶粳稻種質(zhì)資源以及44,000個SNP基因型定位到影響水稻對8個抗非洲稻瘟病菌株抗性的31個QTL; Raboin等[14]利用150份熱帶粳稻品種和190份秈稻品種分別定位到2個和1個影響水稻田間抗性的主效QTL; Mgonja等[15]利用190份非洲品種定位到影響6個稻瘟病病菌抗性的25個QTL。

本研究鑒定了來源于全球的212份秈稻和235份粳稻種質(zhì)資源對我國5個稻瘟病菌株的苗期稻瘟病抗性, 并利用全基因組關(guān)聯(lián)分析方法分別定位了秈粳混合群體(212份秈稻和235份粳稻合在一起的群體)、秈稻和粳稻群體中抗稻瘟病的QTL, 并對同時影響抗2個及2個以上菌株或在2個及2個以上群體中同時定位到的重要QTL進行單倍型分析, 鑒定優(yōu)異等位基因。研究結(jié)果將為分子育種改良水稻稻瘟病抗性提供重要的抗病種質(zhì)資源和有利等位基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為從菲律賓國際水稻研究所種質(zhì)庫引進的212份秈稻和235份粳稻種質(zhì)資源, 其來源于全球56個國家和地區(qū)。其中秈稻種質(zhì)資源主要來源于中國(36份)、菲律賓(34份)、印度(20份)、斯里蘭卡(17份)、孟加拉國(14份)、馬達加斯加(9份)、越南(7份)和印度尼西亞(5份)等國家; 粳稻種質(zhì)資源主要來源于印度尼西亞(22份)、科特迪瓦(20份)、巴西(19份)、馬達加斯加(18份)、泰國(12份)、哥倫比亞(9份)、中國(8份)、美國(8份)、印度(7份)和不丹(7份)等國家。

1.2 稻瘟病抗性鑒定

選用5個強致病力稻瘟病小種代表菌株, 采用人工接種的方法鑒定種質(zhì)資源的苗期稻瘟病抗性, 其中GD00-193 (中B13)和GD08-T19菌株(中B03)分別源于中國廣東省海豐縣和雷州市, GD17-CQ16菌株(中B15)來源于重慶涪陵市, HB1708菌株(中C13)來源于湖北恩施市, HLJ13-856菌株(中B05)來源于黑龍江856農(nóng)場, 前4個稻瘟病菌株收集于秈稻品種, 最后1個菌株收集于粳稻品種。參照Park等[16]描述的方法培養(yǎng)水稻幼苗和稻瘟病菌株。水稻種子催芽后穴播于30 cm × 20 cm × 5 cm規(guī)格的搪瓷盆里, 每盆播24個材料, 每個材料播種量為8～10 粒種子。稻苗采取旱育栽培, 長至一葉一心期每盆施用0.5 g硫酸銨, 接種前共施3次。待稻苗長至3.5～4.0葉齡, 用配置好的孢子液進行人工噴霧接種, 接種菌液量為20 mL盆–1。接種后置于遮光密閉的培養(yǎng)箱中, 在25℃下保濕24 h, 之后置于溫室, 在25～28℃下保濕培植至稻苗發(fā)病, 接種7 d后進行調(diào)查。菌株的小種鑒定及致病性測定均設(shè)2個重復(fù)。病級調(diào)查按國際水稻研究所稻瘟病圃苗瘟分級標準進行[17], 按0～9級記載(0級為高抗, 9級為高感), 其中0～3級為抗病類型、4～9級為感病類型。試驗重復(fù)2次, 取2次的平均值作為該品種的稻瘟病病級。

1.3 表型數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010進行種質(zhì)資源表型數(shù)據(jù)進行整理, 利用Stataistca 5.5[18]進行統(tǒng)計描述、顯著性分析和不同稻瘟病菌株抗性的相關(guān)性分析。

1.4 種質(zhì)資源基因型鑒定與全基因組關(guān)聯(lián)分析

每個品種隨機挑選20個單株的葉片混合, 采用MATAB法提取DNA[19], 并將DNA濃度調(diào)整至100 ng μL–1。利用HDRA 700K SNP芯片[20]對秈粳2套種質(zhì)資源進行基因型分析。獲得全基因組700K的基因型數(shù)據(jù)后, 利用PLINK1.9軟件[21]去掉最低等位基因頻率均小于5%和缺失率大于20%的SNP, 最終秈粳混合群體、秈稻和粳稻種質(zhì)資源分別鑒定出209,493、175,812和115,157個高質(zhì)量SNP。利用SVS8.4.0軟件包中EMMAX模塊中的單位點混合線性模型進行SNP與表型之間的關(guān)聯(lián)分析[11], 閾值設(shè)置為1.0×10–5。水稻的LD平均約為200 kb[20], 本研究中最高峰值SNP兩側(cè)各100 kb內(nèi)的QTL即認定為相同的QTL。QTL命名遵循+菌株前2個字母代號+菌株前2個數(shù)字編號+所在染色體號。

1.5 重要QTL的候選基因鑒定

針對同時影響2個及2個以上菌株抗性或2個及2個以上群體同時定位到的重要QTL進行候選區(qū)間關(guān)聯(lián)分析。以日本晴作為參考基因組, 在700K SNP基因型數(shù)據(jù)中挑選出每個QTL最顯著的峰值SNP上下游各100 kb區(qū)間內(nèi)所有基因上的SNP, 利用SVS8.4.0軟件包中EMMAX模塊中的單位點混合線性模型進行基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析[11], 閾值設(shè)置為1.0×10–5。隨后篩選出位于基因啟動子區(qū)、5￠UTR、3￠UTR、外顯子中導(dǎo)錯義突變和內(nèi)含子中導(dǎo)致剪切模式發(fā)生改變的顯著SNP進行相關(guān)性狀的單倍型分析, 采用單因素方差分析和多重比較檢驗不同單倍型之間的差異顯著性, 閾值設(shè)置為<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 種質(zhì)資源的稻瘟病抗性分析

447份種質(zhì)資源對5個稻瘟病菌株的抗性表現(xiàn)見表1。混合群體、秈稻和粳稻種質(zhì)資源對GD08-T19菌株的抗性最強, 抗級最低, 分別為2.87、2.87和2.83; 對GD17-CQ16菌株的抗性相對較差, 抗級最高, 分別為4.58、4.72和4.35。其中, 大部分秈稻品種對GD08-T19和HLJ13-856表現(xiàn)為抗病, 對其他3個稻瘟病菌株表現(xiàn)為感病; 大部分粳稻品種對GD08-T19表現(xiàn)為抗病, 而對其他4個稻瘟病菌株表現(xiàn)為感病。秈粳種質(zhì)資源對GD08-T19、GD17-CQ16和HB1708的抗感反應(yīng)相似, 抗級無顯著差異, 而秈稻對GD00-193的抗性顯著差于粳稻, 對HLJ13-856的抗性顯著優(yōu)于粳稻。顯然, 秈稻或粳稻對不同稻瘟病菌株的抗性反應(yīng)不同, 即使對同一稻瘟病小種, 秈、粳之間的抗性反應(yīng)也不完全相同, 稻瘟病抗性可能存在一定的秈粳分化。此外, 秈粳種質(zhì)資源對5個稻瘟病菌株的抗性均表現(xiàn)為連續(xù)變異, 表明種質(zhì)資源對5個稻瘟病菌株的抗性受多基因控制。其中8份秈稻(BIRAIN 360、CHUA DAU、IR 32453-20-3- 2-2、KARAYAL、KHAO PON、MA WAINE OHN、ZI GAN NAN GU和SAHEL 108)和12份粳稻(CHAHORA 144、IRAT 177、LLANERO 501、OS 6、GBUAPU 1、SENG、TOS 5790、CURINCA、IRAT 212、CIRAD 403、CT 13582-15-5-M和VIETNAM 1)對全部5個稻瘟病菌株均表現(xiàn)為抗病。

3個群體對不同稻瘟病菌株的抗性之間的相關(guān)性見表2。在3套種質(zhì)資源群體中, 品種對3個菌株GD00-193、GD17-CQ16和HB1708的抗性之間均表現(xiàn)為顯著正相關(guān), 說明品種抗某一個稻瘟病菌株的同時很可能抗另外2個菌株。此外, 秈稻種質(zhì)資源對粳型小種HLJ13-856的抗性與對其余4個秈型小種的抗性均不相關(guān), 粳稻群體對粳型小種HLJ13-856的抗性與對2個秈型小種(GD08-T19和GD17-CQ6)的抗性不相關(guān), 對另2個秈型小種(GD00-193和HB1708)呈弱的顯著正相關(guān)。

2.2 抗稻瘟病QTL定位

利用3套群體共定位到43個影響5個稻瘟病菌株的抗病QTL, 它們分布于水稻全部12條染色體上。

2.2.1 抗GD00-193和GD17-CQ16的QTL定位

定位到9個影響水稻對GD00-193抗性的QTL, 分布于1號、3號、4號、6號、8號、9號和11號染色體上(表3和附圖1)。其中7個QTL (、、、、、和)只在混合群體中被定位到, 對表型的貢獻率為1.72～17.94%;只在秈稻核心種質(zhì)中被定位到, 對表型的貢獻率為13.49%;在混合群體和粳稻中同時被定位到, 分別解釋表型變異的15.86%和15.90%。

共鑒定到14個影響水稻對GD17-CQ16抗性的QTL (表3和附圖1)。其中9個QTL (、、、、、、、和)只在混合群體中被定位到, 最高能解釋9.70%的表型變異; 2個QTL (和)只在秈稻核心種質(zhì)中被定位到, 平均解釋12.70%的表型變異;在混合群體和粳稻種質(zhì)資源中同時被定位到, 分別解釋4.93%和4.23%的表型變異;在混合群體和秈稻種質(zhì)資源中穩(wěn)定表達, 對表型的貢獻率最高為10.64%;在3個群體中同時被定位到, 對表型的貢獻率最低為3.69%。

2.2.2 抗GD08-T19、HB1708和HLJ13-856的QTL定位 在6號、11號和12號染色體上共定位到4個影響水稻對GD08-T19抗性的QTL (表4和附圖1)。其中3個QTL (、和)只在秈稻核心種質(zhì)中被定位到, 對表型的平均貢獻率為9.96%;只在混合群體中被定位到, 解釋5.89%的表型變異。

表1 種質(zhì)資源對5個稻瘟病菌株的苗期抗性表現(xiàn)

a秈粳種質(zhì)資源間稻瘟病抗級差異。

aDifference in blast resistance betweenandsubpopulations.

表2 種質(zhì)資源對不同稻瘟病菌株之間的相關(guān)性

第1、2和3行分別代表混合群體、秈稻和粳稻種質(zhì)資源對5個稻瘟病菌株抗性之間的相關(guān)系數(shù);*和**分別代表顯著水平為< 0.05和< 0.01。

Data in the first, second, and third rows represent correlation coefficients inmix population,andsubpopulations, respectively.*and**indicate significant difference at< 0.05 and< 0.01, respectively.

共鑒定到14個影響水稻對HB1708抗性的QTL, 位于除2號、9號和12號染色體外的9條染色體上(表4和附圖1)。其中7個QTL (、、、、、和)只在混合群體中被定位到, 對表型的貢獻率為1.81%～10.87%;只在秈稻種質(zhì)資源中被定位到, 能解釋表型變異的17.50%;、和只在粳稻稻種質(zhì)資源中被定位到, 對表型的貢獻率最大為10.94%;和在混合群體和秈稻種質(zhì)資源中同時被定位到, 對表型的平均貢獻率為14.95%;在混合群體和粳稻種質(zhì)資源中同時被定位到, 解釋1.08%的表型變異。

共有2個QTL與水稻對HLJ13-856的抗性關(guān)聯(lián)(表4和附圖1)。其中秈稻核心種質(zhì)只定位到1個主效QTL (), 對表型變異的貢獻率為18.93%;只在混合群體中被定位到, 對表型的貢獻率為2.02%。

稻瘟病抗性在不同群體間存在較大的差異, 對5個菌株的抗性在混合群體中單獨定位到25個抗病QTL, 其在秈或粳群體中均未檢測到, 說明這25個抗病QTL在秈或粳亞群體中的變異較小; 秈稻亞群中檢測到12個抗病QTL, 明顯多于粳稻亞群中檢測到的7個, 說明秈稻抗稻瘟病總體上好于粳稻, 其中秈粳共同定位到的僅針對GD17-CQ16菌株的1個QTL (), 表明稻瘟病抗性存在明顯的秈粳分化。

2.3 重要位點的有利等位基因鑒定

在43個影響水稻對5個稻瘟病菌株抗性的QTL中, 有11個QTL同時影響水稻對2個及2個以上菌株的抗性, 或在2個或2個以上群體中同時被定位到。利用候選區(qū)間關(guān)聯(lián)分析和單倍型分析在這11個QTL共鑒定到23個候選基因。

2.3.1 單個候選基因的QTL的有利等位基因鑒定

1號染色體28.92～29.12 Mb區(qū)間()、6號染色體10.32～10.52 Mb區(qū)間()和22.60～ 22.80 Mb區(qū)間()、7號染色體4.73～4.93 Mb區(qū)間()、8號染色體17.40～17.60 Mb區(qū)間()和20.66～20.86 Mb區(qū)間()和11號染色體6.92～7.12 Mb區(qū)間()均只鑒定到1個候選基因(圖1)。其中編碼細胞色素P450, 分為C和T兩種單倍型, 其中單倍型T對GD00-193和GD17-CQ16的抗性均顯著優(yōu)于單倍型C, 為有利等位基因(圖1-A)。編碼一個含有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域的蛋白, 分成A和C兩種單倍型, 單倍型A在混合群體和秈稻種質(zhì)資源中對HB1708的抗性均顯著優(yōu)于單倍型C, 為有利等位基因(圖1-B)。編碼一個表達蛋白, 分成A和T兩種單倍型, 單倍型A對GD17- CQ16和HB1708的抗性均顯著優(yōu)于單倍型T, 為有利等位基因(圖1-C)。編碼IPP轉(zhuǎn)移酶, 分成C和T兩種單倍型, 單倍型T在混合群體中對GD17-CQ16和粳稻種質(zhì)資源中對GD17- CQ16和HB1708的抗性均顯著優(yōu)于單倍型C, 為有利等位基因(圖1-D)。編碼一個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子, 分成單倍型A和單倍型G, 其中單倍型A在混合群體和粳稻種質(zhì)資源中對GD00-193的抗性顯著優(yōu)于單倍型G, 為有利等位基因(圖1-E)。編碼14-3-3蛋白, 分成單倍型A和單倍型G, 其中單倍型A在混合群體中對GD17- CQ16和HB1708的抗性顯著優(yōu)于單倍型G, 為有利等位基因(圖1-F)。編碼受體激酶5的前體, 有A和G兩種單倍型, 其中單倍型A在混合群體中對GD17-CQ16和HLJ13-856和在秈稻種質(zhì)資源中對GD17-CQ16的抗性顯著優(yōu)于單倍型G, 為有利等位基因(圖1-G)。

2.3.2 多個候選基因的QTL的有利等位基因鑒定

有4個位點鑒定到多個候選基因。在1號染色體1.47～1.67 Mb區(qū)間內(nèi)()共有105個SNP位于24個候選基因上, 其中有3個基因上有SNP超過閾值(圖2-A)。編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶, 有A和G兩種單倍型, 單倍型G對GD00-193、GD17-CQ16和HB1708的抗性均顯著優(yōu)于單倍型A, 為有利等位基因。編碼核酸酶PA3, 共分為3種單倍型, 其中單倍型TG對GD17-CQ16的抗性顯著優(yōu)于GA, 為有利等位基因。編碼一個表達蛋白, 分成了A和C兩種單倍型, 單倍型A對GD17-CQ16的抗性顯著優(yōu)于C, 為有利等位基因(圖2-A)。

在1號染色體33.05～33.25 Mb區(qū)間內(nèi)()有143個SNP位于30個候選基因上。有4個基因(、、和)內(nèi)有SNP超過閾值(圖2-B),其中沒有啟動子區(qū)、5￠UTR、3￠UTR、外顯子中導(dǎo)錯義突變和內(nèi)含子中導(dǎo)致剪切模式發(fā)生改變的顯著SNP。編碼一個SAND結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì), 分成了3種單倍型, 在粳稻種質(zhì)資源中單倍型GT對HB1708的抗性均顯著優(yōu)于單倍型AC和GC, 為有利等位基因。編碼一個表達蛋白, 在混合群體中將其分為3種單倍型, 在粳稻種質(zhì)資源中分為2種單倍型。單倍型AGA在混合群體對GD00-193和HB1708和粳稻種質(zhì)資源中對HB1708的抗性顯著優(yōu)于單倍型CAC, 為有利等位基因。編碼rp1, 分為A和G兩種單倍型。其中單倍型A在混合群體對GD00-193和HB1708和粳稻種質(zhì)資源中對HB1708的抗性顯著優(yōu)于單倍型G, 為有利等位基因(圖2-B)。

圖1 7個單候選基因位點的候選區(qū)間關(guān)聯(lián)分析及單倍型分析

單倍型分析中不同小寫字母代表性狀在< 0.01水平差異顯著。

Different lowercase letter represents significantly difference at< 0.01 in haplotype analysis.

圖2 4個多候選基因位點的候選區(qū)間關(guān)聯(lián)分析及單倍型分析

單倍型分析中不同小寫字母代表性狀在< 0.01水平差異顯著。

Different lowercase letter represents significantly difference at< 0.01 in haplotype analysis.

在8號染色體6.36～6.56 Mb區(qū)間內(nèi)()共有187個SNP位于27個候選基因上, 9個基因(、、、、、、、和)內(nèi)有SNP超過閾值(圖2-C)。其中和沒有啟動子區(qū)、5￠UTR、3￠UTR、外顯子中導(dǎo)錯義突變和內(nèi)含子中導(dǎo)致剪切模式發(fā)生改變的顯著SNP, 其余基因(、、、、、和)均編碼反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。、、、、和均有2種單倍型, 其中單倍型A、A、T、A、T和T在混合群體和秈稻種質(zhì)資源中對HB1708的抗性顯著優(yōu)于單倍型G、T、C、G、C和G, 為有利等位基因。分為AA和TC兩種單倍型, 單倍型AA在混合群體和秈稻種質(zhì)資源中對HB1708的抗性顯著優(yōu)于單倍型TC, 為有利等位基因(圖2-C)。

利用104個位于21個候選基因上的SNP對9號染色體10.66～10.86 Mb區(qū)間()進行關(guān)聯(lián)分析, 5個基因(、、、和)內(nèi)有SNP超過閾值(圖2-D), 其中和沒有啟動子區(qū)、5￠UTR、3￠UTR、外顯子中導(dǎo)錯義突變和內(nèi)含子中導(dǎo)致剪切模式發(fā)生改變的顯著SNP。編碼一個表達蛋白,編碼捕光葉綠素/結(jié)合蛋白基因,編碼一個含短鏈脫氫還原酶家族結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶。這3個基因均有2種單倍型, 其中單倍型A、G和C對GD17-CQ16的抗性顯著優(yōu)于單倍型C、A和T, 為有利等位基因。此外,和的單倍型C和T對GD00-193的抗性顯著優(yōu)于單倍型C和T (圖2-D)。

3 討論

3.1 水稻對稻瘟病菌抗性分化與秈粳亞種間稻瘟病抗性差異

稻瘟病是稻瘟病菌()感染引起的一種真菌性病害, 我國稻瘟病菌主要分為8個亞群和50余個生理小種, 且不同生理小種的遺傳差異較大[2]。李旭升等[17]利用3K種質(zhì)資源中的1217份種質(zhì)資源篩選到144份抗稻瘟病的種質(zhì)資源。對其中30份種質(zhì)資源進行苗期30個稻瘟病菌接種發(fā)現(xiàn)僅17份種質(zhì)資源的抗性頻率高于70%。楊楠等[22]對云南的46份地方品種進行了8個生理小種抗性鑒定, 結(jié)果表明同一品種對不同菌株的抗性差異很大。此外, 目前已經(jīng)克隆的37個稻瘟病抗性基因中, 僅、和等少數(shù)基因具有廣譜抗性, 其余基因均只能抗少數(shù)幾種生理小種, 表明同一抗性基因?qū)Σ煌硇》N的抗性不同[7,23-24]。本研究利用212份秈稻和235份粳稻種質(zhì)資源對5個稻瘟病菌株進行了抗性鑒定, 結(jié)果表明大部分秈稻品種對GD08-T19和HLJ13-856表現(xiàn)為抗病, 對其他3個稻瘟病菌株表現(xiàn)為感病; 大部分粳稻品種對GD08-T19表現(xiàn)為抗病, 而對其他4個稻瘟病菌株表現(xiàn)為感病。此外, 品種對GD00-193、GD17-CQ16和HB1708這3個菌株的抗性之間均表現(xiàn)為顯著的正相關(guān), 而對其他2個菌株的抗性均無顯著相關(guān)性, 表明品種對不同稻瘟病菌株的抗性存在分化。關(guān)聯(lián)分析定位到的43個稻瘟病抗性QTL中, 有9個QTL同時影響對2個或2個以上菌株的抗性, 其中7個位點均同時影響水稻對GD00-193、GD17-CQ16和HB1708中2個菌株的抗性, 1個位點同時影響水稻對這3個菌株的抗性, 1個位點同時影響水稻對GD17-CQ16和HLJ13-856的抗性, 表明水稻對不同稻瘟病菌株的抗性也存在遺傳分化。因此, 在抗稻瘟病抗性育種中, 要盡量選擇同時抗不同菌株的抗病QTL, 以提高品種對稻瘟病的抗譜。

另一方面, 秈粳亞種對同一菌株的抗性也表現(xiàn)出顯著差異。李旭升等[17]在湖北恩施進行了1217份種質(zhì)資源的抗稻瘟病鑒定, 并篩選到的144份不同時期抗稻瘟病的抗病材料中, 一半以上為秈稻, 溫帶粳稻僅占7.6%, 說明在秈稻對恩施環(huán)境下的秈型生理小種的抗性顯著優(yōu)于粳稻。楊楠等[22]對云南地方品種進行8個秈型菌株的稻瘟病抗性評價, 結(jié)果也表明秈稻的稻瘟病抗性整體高于粳稻。本研究所用的5個菌株中, 除HLJ13-856為粳型菌株外, 其余4中均為秈型菌株。秈稻對GD00-193的抗性顯著差于粳稻, 對HLJ13-856的抗性顯著優(yōu)于粳稻。結(jié)果表明, 對同一稻瘟病菌株, 秈粳之間的抗性存在差異。秈稻群體對粳型小種HLJ13-856的抗性與對其余4個秈型菌株的抗性均不相關(guān), 粳稻群體對粳型小種HLJ13-856的抗性與對2個秈型小種(GD00-193和HB1708)呈弱的顯著正相關(guān), 也說明對稻瘟病菌的抗性存在著一定的秈粳分化。此外, 在本研究定位的43個抗5個稻瘟病菌株中, 有3個QTL在混合群體與秈稻種質(zhì)資源中同時被定位到, 3個QTL在混合群體與粳稻種質(zhì)資源中同時被定位到,僅1個QTL在3個群體中均被定位到, 表明秈粳群體對稻瘟病抗性的遺傳基礎(chǔ)不同。因此, 在稻瘟病抗性育種中, 盡量選用在不同遺傳背景下定位到的QTL進行稻瘟病抗性改良, 這些抗病QTL的抗性表達受遺傳背景的影響可能較小。

3.2 本研究定位的抗稻瘟QTL與前人研究的比較

本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析共定位到43個影響水稻對5個稻瘟病菌株抗性的QTL, 部分QTL與前人克隆的稻瘟病抗性基因/QTL位于相同或相近位置。例如, 1號染色體的、、和分別與()和位于相同區(qū)間[25-28], 2號染色體的與位置相同[29], 5號染色體的與()處于相近區(qū)間[30], 6號染色體的、和分別與()、//位置相同[23,30], 位于7號染色體的和與qDI-7位置相同[31], 位于11號染色體的、和與和物理位置一致[32-34], 位于12號染色體的與()位于相同位置[30]。將來需要對這些相同或相近的QTL進行精細定位和克隆驗證它們是否為同一QTL。

3.3 重要抗稻瘟位點的候選基因分析

本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法共定位到43個影響5個菌株抗性的QTL, 其中11個QTL同時影響2個以上菌株的抗性或在2個以上群體中同時被定位到, 為重要的QTL。在這些QTL中, 有7個位點挖掘到了1個候選基因, 有3個位點都挖掘到了3個候選基因, 1個位點挖掘到了7個候選基因。其中, 1號染色體1.47～1.67 Mb區(qū)間內(nèi)編碼核酸酶PA3的是抗GD17- CQ16菌株的最有可能候選基因, 由于其在混合群體中的3種單倍型對GD00-193和HB1708的抗性均無顯著差異, 推測不同于抗病QTL1和的候選基因, 也即、和雖然定位在同一個區(qū)間, 但不是同一抗病基因, 可能存在緊密連鎖的關(guān)系。水稻中已發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶III[35]與水稻稻瘟病抗性相關(guān), 表明核酸酶參與到水稻對稻瘟病的抗性, 因此最可能是該位點的候選基因。1號染色體28.92～29.12 Mb區(qū)間的候選基因編碼細胞色素P450, 其同源基因[36]編碼細胞色素P450單加氧酶, 可催化色胺轉(zhuǎn)變成血清素, 增強水稻對稻瘟病均侵染的抗性。因此,可能是該位點的候選基因。1號染色體33.05～33.25 Mb區(qū)間內(nèi),編碼一個SAND結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì), 提高其表達量將導(dǎo)致穎花發(fā)育異常。水稻另一個基因與稻瘟病抗性有關(guān), 該基因突變后也導(dǎo)致穎花發(fā)育異常[37-38]。因此,是該位點最有可能的候選基因。6號染色體10.32～10.52 Mb區(qū)間的編碼一個含有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域蛋白, 前人克隆的稻瘟病基因中大多數(shù)均為含有NBS-LRR的蛋白質(zhì)[7], 因此可能是該位點的候選基因。8號染色體20.66～20.86 Mb區(qū)間的編碼14-3-3蛋白, 為已克隆的稻瘟病抗性基因[39]。在9號染色體10.66～10.86 Mb區(qū)間內(nèi),編碼一個含短鏈脫氫還原酶家族結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶。前人研究發(fā)現(xiàn)[40]、[41]和[42]等多個編碼氧化還原酶類的基因具有稻瘟病抗性, 可以推測植物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)可以影響植物對稻瘟病的抗性, 因此是該位點最可能的候選基因。上述這些可能的候選基因還有待通過基因編輯敲除和轉(zhuǎn)基因過表達進行功能驗證, 這些候選基因的有利等位基因也需要通過分子標記輔助選擇的方法導(dǎo)入到感病品種中, 明確其在水稻抗病育種中的利用價值。

3.4 對水稻抗稻瘟病分子育種的啟示

稻瘟病對全球水稻生產(chǎn)造成了巨大威脅, 尤其在亞洲和非洲, 稻瘟病每年都導(dǎo)致巨大的產(chǎn)量損失[40]。選育抗稻瘟病的水稻品種能極大地幫助這些地區(qū)降低稻瘟病造成的損失, 保障糧食安全。然而, 抗稻瘟病新品種的選育也極大地依賴于抗稻瘟病種質(zhì)資源的發(fā)掘和利用。本研究鑒定了447份秈稻和粳稻種質(zhì)資源對5個稻瘟病菌株的抗性, 從中篩選出了8份和12份抗全部5個菌株的秈稻和粳稻種質(zhì)資源。這些種質(zhì)資源能作為抗稻瘟病的抗源直接應(yīng)用于育種。

在本研究定位到的43個影響水稻抗稻瘟病QTL中, 其中秈、粳亞群體分別定位到12個和7個主效抗病QTL, 秈稻中抗瘟基因多于粳稻, 與水稻育種實踐中觀察到的秈稻對稻瘟病抗性總體強于粳稻是一致的。本研究從秈、粳種質(zhì)資源中鑒定到一批效應(yīng)較大(解釋表型貢獻率秈稻背景>15%、粳稻背景>10%)且僅抗1個菌株的抗病QTL, 如僅在秈稻資源中鑒定到的抗GD17-CQ16菌株的, 抗HLJ13-856菌株的, 抗HB1708菌株的和。這4個QTL中,的有利等位基因為A, 其在秈稻種質(zhì)資源中的頻率為78.33%, 但其在粳稻種質(zhì)資源中的頻率為2.34%;的有利等位基因為C, 其在秈稻種質(zhì)資源中的頻率為20.57%, 但其在粳稻種質(zhì)資源中的頻率為0.45%;的有利等位基因為T, 其在秈稻種質(zhì)資源中的頻率為31.75%, 但其在粳稻種質(zhì)資源中的頻率為0;的7個候選基因在秈稻種質(zhì)資源中的頻率分別為36.77%、38.24%、19.59%、76.19%、33.33%、48.21%和35.23%, 而它們在粳稻種質(zhì)資源中的頻率分別為1.82%、3.20%、2.26%、1.94%、2.25%、0.46%和1.81%。結(jié)果表明, 這些QTL有利等位基因在秈稻中的比例顯著高于粳稻, 因此在水稻抗稻瘟病育種實踐中, 可以利用秈稻資源作為抗源將這4個抗瘟基因?qū)刖緛硖岣呔酒贩N的抗稻瘟病水平。同樣, 僅在粳稻資源中鑒定到抗HB1708菌株的和抗GD00-193菌株的, 其中的候選基因在粳稻種質(zhì)資源中的有利等位基因頻率為23.41%, 而其在秈稻種質(zhì)資源中的頻率僅為0.49%;的候選基因在粳稻種質(zhì)資源中的有利等位基因頻率為75.69%, 而其在秈稻種質(zhì)資源中的頻率僅為0.96%。這2個QTL的候選基因有利等位基因在粳稻中的頻率顯著高于秈稻, 也可以利用粳稻資源作為抗源將這2個抗瘟基因?qū)攵i稻來提高秈稻品種的抗稻瘟病水平。此外, 在1號染色體1.47～1.67 Mb區(qū)間定位到抗HB1708、GD00-193和GD7-CQ16的3個抗病QTL (、和),是最可能的候選基因, 該候選基因在秈稻種質(zhì)資源的有利等位基因頻率分別為59.89%, 顯著高于粳稻中的40.20%。在后續(xù)的秈稻、粳稻和秈粳交品種選育過程中, 可以針對這些大效應(yīng)位點和同時影響水稻對多個稻瘟病菌株抗性的重要位點, 根據(jù)等位基因的差異開發(fā)KASP標記, 通過分子標記輔助選擇提高水稻品種的稻瘟病抗性; 此外, 還可以將抗不同稻瘟病菌株的QTL進行聚合, 以達到拓寬水稻抗譜的目的。

4 結(jié)論

212份秈稻和235份粳稻種質(zhì)資源苗期對5個稻瘟病菌株的抗性變異十分豐富, 且對不同菌株的抗性存在分化, 對同一菌株的抗性也表現(xiàn)出秈粳差異。利用全基因組關(guān)聯(lián)分析共定位到43個影響水稻對5個稻瘟病菌株抗性的QTL, 其中11個位點同時影響水稻對2個以上菌株抗性或在2個以上群體中同時被定位到, 為廣譜較廣的抗稻瘟病QTL。挖掘到23個候選基因和23個優(yōu)異等位基因。根據(jù)抗病QTL在秈粳群體中的不同分布頻率, 可以針對性地選擇抗病QTL用于秈粳品種的稻瘟病抗性改良, 研究結(jié)果為水稻抗稻瘟病育種提供了抗源和抗病基因信息及不同抗病基因利用的策略。

致謝 廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所朱小源團隊幫助完成稻瘟病接種鑒定, 在此深表感謝！

附圖 請見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical- zuowxb.aspx。

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Identification of rice blast resistance inandgermplasms by genome-wide association study

ZHOU Hai-Ping1, ZHANG Fan2, CHEN Kai3, SHEN Cong-Cong3, ZHU Shuang-Bing3, QIU Xian-Jin4,*, and XU Jian-Long2,3,5,*

1Wenzhou Academy of Agricultural Sciences / South-Zhejiang Crop Breeding Key Laboratory, Wenzhou 325000, Zhejiang;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Shenzhen Branch, Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture, Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, Guangdong, China;4College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China;5Hainan Yazhou Bay Seed Laboratory, Sanya 572024, Hainan, China

Rice blast is one of the major fungal diseases that threaten rice production worldwide. To improve rice blast resistance, identifying blast resistant genes and introgressing them into elite rice varieties is an effective way. In this study, a panel of 212accessions and 235accessions collected worldwide were evaluated for resistance against five blast isolates at seedling stage. All of them showed large variations in resistance against five isolates, and 8and 12accessions were detected to present resistance to all five blast isolates. Using genome-wide association strategy, a total of 43 QTLs were identified for resistance to five isolates in mix population (subpopulation andsubpopulation), including 9, 4, 14, 14, and 2 QTLs for GD00-193, GD08-T19, GD17-CQ16, HB1708, and HLJ13-856, respectively. Among them, 12 resistant QTLs were detected only inricesub-population, 7 only detected inrice sub-population, and 1 simultaneously detected in bothsub-populations, indicating that blast resistance was generally better inthan inrice, and there was obvious differentiation in blast resistance betweenandrice. A total of 11 QTLs affected resistance to two or more trains or were simultaneously identified in two or more populations, and 23 candidate genes were identified by candidate interval association analysis and haplotype analysis. Different resistance candidate genes had different frequencies inandpopulations. The results provide germplasm resources and favorable genes information for molecular improvement of blast resistance in rice varieties and the breeding and utilization strategies of different resistance genes.

blast resistance; germplasm; genome-wide association study; quantitative trait locus (QTLs); favorable allele

10.3724/SP.J.1006.2023.22024

本研究由海南崖州灣種子實驗室揭榜掛帥項目(B21HJ0216)和溫州市農(nóng)業(yè)新品種選育協(xié)作組專項(2019ZX006)資助。

This study was supported by the Hainan Yazhou Bay Seed Laboratory (B21HJ0216) and the Wenzhou Agricultural New Variety Breeding Collaborative Project (2019ZX006).

徐建龍, E-mail: xujianlong@caas.cn; 邱先進, E-mail: xjqiu216@yangtzeu.edu.cn

E-mail: zhouhaiping7583@126.com

2022-04-24;

2022-09-05;

2022-09-15.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220915.0835.002.html

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