戴文慧 朱 琪 張小芳 呂沈陽 項顯波 馬 濤 陳宇杰 朱世華 丁沃娜,*

研究簡報

一個水稻脆稈突變體的鑒定和基因定位

戴文慧1,2朱 琪1,2張小芳1,2呂沈陽1項顯波3馬 濤1陳宇杰1朱世華1丁沃娜1,*

1寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 浙江寧波 315212;2寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 浙江寧波 315211;3平陽縣市場監(jiān)督管理局, 浙江溫州 325400

利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變秈稻Kasalath獲得一個脆稈突變體。表型分析發(fā)現(xiàn), 該突變體的莖稈及葉片均易折斷, 且該脆性表型在苗期開始表現(xiàn), 至成熟期時最顯著。莖稈機械強度分析表明,莖稈的抗折力、拉伸力顯著下降。樹脂切片及掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),莖稈的厚壁組織細胞空隙增多, 細胞壁明顯變薄。莖稈細胞壁組分含量分析表明, 與野生型相比,的纖維素含量降低36.60%, 半纖維素和木質(zhì)素含量分別升高23.08%和26.06%。經(jīng)遺傳分析得出,的脆性性狀由隱性單基因控制。利用SSR標(biāo)記和自行設(shè)計的STS標(biāo)記將基因定位于水稻第6號染色體STS標(biāo)記STS2和STS3之間約52.9 kb的范圍內(nèi), 該區(qū)間內(nèi)沒有已報道的水稻脆性相關(guān)基因, 表明可能是1個新的水稻脆稈基因, 為進一步揭示水稻莖稈機械強度的調(diào)控機制提供了材料支撐。

水稻; 脆稈突變體; 細胞壁; 纖維素; 基因定位

莖稈的機械強度是決定植株抗倒伏能力的首要因素, 水稻生長發(fā)育期間發(fā)生倒伏不僅影響產(chǎn)量還會降低稻谷品質(zhì), 甚至引起植株死亡[1]。水稻中常會發(fā)生脆性突變引起莖稈的機械強度降低, 發(fā)生突變的植株一方面表現(xiàn)出莖稈厚壁組織細胞壁變薄, 另一方面植株細胞壁中的成分占比會發(fā)生改變[2]。挖掘和鑒定新的脆性突變體, 不僅有助于更深層次地解析莖稈強度的調(diào)控機制, 還能為培育抗倒伏植株方面的相關(guān)研究提供材料支撐。

目前, 已發(fā)現(xiàn)20個以bc (brittle culm)命名的水稻脆性突變體:～、～、, 其中12個基因已被克隆。、、、、都編碼植物纖維素合酶催化亞基, 直接參與細胞壁合成。、和為等位基因, 位于9號染色體上, 編碼纖維素合成酶催化亞基OsCesA9[3-5]。和為等位基因, 位于第1染色體上, 編碼纖維素合成酶催化亞基OsCesA4[6-7]。、、、、、和間接參與細胞壁合成。其中位于3號染色體, 編碼類COBRA蛋白, 其在根、莖、葉中均有表達, 調(diào)控細胞壁纖維素的沉積[8]。位于2號染色體, 編碼1個動力蛋白OsDRP2B, 該蛋白對次級細胞壁合成至關(guān)重要[9]。位于5號染色體, 編碼II型膜蛋白, 該蛋白定位于高爾基體中, 作為一種糖基轉(zhuǎn)移酶參與纖維素的合成[10]。位于9號染色體, 編碼一種與細胞周期相關(guān)的驅(qū)動蛋白,突變導(dǎo)致莖稈的細胞數(shù)量減少, 厚壁組織結(jié)構(gòu)改變[11]。位于2號染色體, 編碼核糖轉(zhuǎn)運蛋白OsNST1, 參與細胞壁多糖的合成[12]。位于9號染色體, 編碼膜相關(guān)的類幾丁質(zhì)酶蛋白, 介導(dǎo)纖維素的生物合成[13]。位于5號染色體, 編碼氧-乙?；D(zhuǎn)移酶, 使蛋白正確定位到細胞膜和細胞壁上[14]。

本實驗室利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變秈稻Kasalath,篩選其后代表型, 發(fā)現(xiàn)一個莖稈和葉片均易折斷的突變體。一方面對突變體莖稈進行機械強度測定、細胞學(xué)觀察及細胞壁組分含量測定, 分析莖稈產(chǎn)生的原因; 另一方面對突變體進行遺傳分析和基因定位, 為進一步克隆基因和揭示水稻莖稈機械強度調(diào)控的遺傳機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以EMS誘變秈稻Kasalath, 獲得一個脆稈突變體, 將其連續(xù)多代自交得到純合體。將純合體與粳稻Nipponbare雜交, 根據(jù)F1和F2代群體表型進行遺傳分析, 并構(gòu)建F2代群體用于基因定位。

1.2 表型觀察

選擇谷粒飽滿的秈稻Kasalath及突變體的種子, 經(jīng)0.6%稀硝酸溶液避光過夜處理后, 放進37℃恒溫箱中萌發(fā)。先根據(jù)種子數(shù)量制作相應(yīng)大小的尼龍網(wǎng)紗板, 再配制水稻培養(yǎng)液, 調(diào)pH至5.5左右, 將尼龍網(wǎng)紗板置于水稻培養(yǎng)液上, 用鑷子夾取露白的種子于尼龍網(wǎng)紗上。人工氣候室設(shè)置參數(shù)為: 白天30℃、夜間22℃、光照12 h。觀察水稻全生育期表型, 在成熟期, 利用手工折斷法觀察野生型及突變體同一部位莖稈與葉片的折斷情況, 并照相記錄。

1.3 莖稈機械強度測定

1.3.1 莖稈抗折力的測定 在成熟期, 剪取第2節(jié)間的野生型及突變體莖稈, 剪成10 cm, 放置在相距7.5 cm的支架上, 測量時將莖稈與地面平行, 將數(shù)顯式推拉力計置于莖稈中部位置, 垂直向下移動至莖稈折斷, 讀取施壓力的峰值, 測定3次重復(fù)[15]。

1.3.2 莖稈拉伸力的測定 取成熟期突變體和野生型的第2節(jié)間莖稈各10個, 長度統(tǒng)一剪成10 cm, 莖稈垂直于地面, 用萬能力學(xué)試驗機夾住莖稈兩端, 設(shè)置參數(shù)為:= 0.05 g m–2、夾距 = 50 mm、速度= 10 mm min–1、斷裂值= 255 (0.1 N), 在顯示器上讀取數(shù)值, 記錄數(shù)據(jù)[16]。

1.4 細胞學(xué)觀察

1.4.1 樹脂切片觀察 在成熟期, 剪取突變體莖稈, 同一節(jié)間的野生型莖稈作為對照, 用刀片垂直切成3～5 mm的小段, 快速夾進2.5%戊二醛(0.2 mol L–1磷酸緩沖液配制)中固定, 4℃中放置48 h后, 再將樣品浸入1%鋨酸(0.2 mol L–1磷酸緩沖液配制)固定12～16 h。將固定后的樣品取出, 用0.08 mol L–1磷酸緩沖液(pH 7.2)漂洗3次, 每次置于搖床上搖15 min。充分漂洗后用10%、20%、40%、60%和80%的乙醇梯度各處理30 min脫水, 再用100%乙醇處理2次各30 min, 100%丙酮處理2次各5 min, 均在搖床上完成。脫水后的樣品用丙酮樹脂體積比為2∶1、1∶1和1∶2依次進行滲透, 再用純樹脂滲透過夜, 最后將各個樣品包埋于PCR管中, 70℃恒溫箱中聚合。用半超薄切片機對組織進行切片, 樣片置于0.1%硼沙甲苯胺藍染液中染色, 蒸餾水清洗掉樣片表面浮色后, 置于烤片機上烘干水分, 最后在顯微鏡下觀察照相[10]。

1.4.2 掃描電鏡觀察 樣品固定及脫水步驟同樹脂切片, 脫水后的莖段經(jīng)烘干后垂直放置于貼有導(dǎo)電膠的樣品臺上, 將樣品臺放進離子濺射儀中噴金60 s, 使莖稈橫切面均勻噴上金粉, 最后用掃描電鏡觀察照相[17]。

1.5 細胞壁組分含量測定

取田間栽培成熟期的野生型及突變體莖稈, 剪下相同節(jié)間, 將葉鞘剝離, 放入干凈的封口袋中, 每個材料測定3次重復(fù)。將樣品寄送蘇州格銳思生物科技有限公司, 測定莖稈細胞壁中纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的含量, 并進行結(jié)果分析。

1.6 遺傳分析與定位群體的構(gòu)建

將純合體與粳稻Nipponbare進行人工雜交, 在成熟期用人工折斷的方式判斷F1代植株脆性, 分析基因顯隱性。將F1代個體自交獲得F2代群體, 鑒定F2代群體表型, 選擇具有脆性表型的群體用于基因定位。在F2代長到成熟階段, 分別記錄下野生型和突變體表型個體的數(shù)量, 并對其進行連續(xù)性卡方分析, 以判斷脆稈表型是否由單基因控制, 最終確定其遺傳模式。

1.7 突變基因的定位分析

按照突變體表型篩選出30個F2代脆稈突變體, 分別提取基因組DNA, 等量混合成1管, 作為突變基因池。用SSR (simple sequence repeat)標(biāo)記同時對突變基因池、親本(Nipponbare和Kasalath)和F1的DNA進行PCR擴增, PCR產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳, 進一步確定連鎖關(guān)系。在粗定位的基礎(chǔ)上, 擴大樣品數(shù), 并將每3株突變體打包處理, 混合抽提DNA。在定位區(qū)間內(nèi)通過Nipponbare和秈稻9311全基因組序列比對, 在有差異的兩側(cè)發(fā)展新標(biāo)記, 篩選出親本條帶間有差異的STS (sequence-tagged site)標(biāo)記進行的進一步定位。通過水稻基因組注釋網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)分析該區(qū)間內(nèi)的候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 bc21的表型特征

在成熟期通過手工折斷野生型與突變體相同位置的莖稈與葉片發(fā)現(xiàn), 野生型水稻的莖稈和葉片只有折痕而沒有斷裂, 而突變體的莖稈與葉片均易被折斷, 且斷裂口清晰, 說明突變體的莖稈與葉片的脆性大于野生型, 其機械強度發(fā)生改變(圖1)。

2.2 bc21莖稈機械強度分析

在成熟期測定野生型及突變體莖稈的抗折力和拉伸力。結(jié)果表明,莖稈第2節(jié)間的抗折力為0.61 N, 與野生型同一節(jié)間的抗折力相比有顯著性差異,莖稈抗折力僅為野生型的31.44%, 這與兩者莖稈手工折斷的結(jié)果相符(圖2-A)。相似的是, 第2節(jié)間突變體的拉伸力相對于野生型也降低了81.44%, 達到極顯著水平(圖2-B)。因此, 脆性突變顯著降低了的機械強度。

圖1 成熟期野生型與突變體bc21莖稈及葉片的折斷表型

A: 莖稈折斷表型; B: 葉片折斷表型。

A: the broken phenotypes of stems; B: the broken phenotypes of leaves. WT: Kasalath;:.

2.3 bc21的細胞學(xué)觀察

植物機械強度的降低通常是由于細胞壁結(jié)構(gòu)的改變所致, 因此利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察了野生型和莖稈的細胞壁結(jié)構(gòu)。在光學(xué)顯微鏡下,的厚壁組織的細胞空隙增多, 細胞壁厚度明顯變薄(圖3-A, B); 在掃描電鏡下,的厚壁組織呈中空的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 且厚壁組織的細胞壁厚度相對于野生型也明顯變薄(圖3-C, D)。

圖2 野生型與突變體bc21莖稈第2節(jié)間抗折力(A)與拉伸力(B)分析

*表示顯著差異(< 0.05); **表示極顯著差異(< 0.01)。

* represents significant difference at the 0.05 probability level; **represents significant differences at the 0.01 probability level. WT:Kasalath;:.

圖3 野生型與突變體bc21的莖稈橫截面觀察

A: 野生型莖稈橫切面樹脂切片觀察; B:莖稈橫切面樹脂切片觀察; C: 野生型莖稈橫切面掃描電鏡觀察; D:莖稈橫切面掃描電鏡觀察; 標(biāo)尺: 100mm (A和B)、20mm (C和D)。

A: the observation on resin slices of wild type stem cross section (bar:100mm); B: the observation on resin slices ofstem cross section (bar: 100mm); C: the scanning electron microscope observation of wild type stem cross section (bar: 20mm); D: the scanning electron microscope observation ofstem cross section (bar: 20mm).

2.4 bc21細胞壁組分含量分析

為了分析莖稈細胞壁變薄的原因, 測定了野生型和莖稈的細胞壁中主要成分的含量。結(jié)果表明,每克莖稈中含有纖維素73.56 mg, 野生型含115.96 mg, 相比野生型,降低了36.56%, 達到顯著水平, 而的半纖維素與木質(zhì)素含量分別升高了23.08%和26.06% (圖4)。

2.5 突變體bc21的遺傳分析

將脆稈突變體與粳稻Nipponbare正反交得到F1, F1代表型正常, 說明脆稈表型受隱性核基因控制。209株F2個體出現(xiàn)表型分離, 正常表型為169株, 脆稈表型為40株, 呈現(xiàn)典型的3∶1的分離比, 表明的脆稈特性符合1對隱性基因控制的遺傳方式。

2.6 BC21的基因定位

對基因進行定位, 便于解析突變體表型的分子機制。先利用均勻分布在水稻12條染色體上的98對具多態(tài)性的SSR標(biāo)記進行初步定位, 將基因定位到第6號染色體上的RM6734和RM253之間。之后擴大群體并發(fā)展新標(biāo)記(表1), 最終將基因鎖定在STS2和STS3之間的一個52.9 kb區(qū)域(圖5)。在該定位區(qū)間內(nèi)有8個預(yù)測基因(表2), 其中沒有已報道的水稻脆性相關(guān)基因, 因此推測該基因為一個新的水稻脆稈基因。

3 討論

在已發(fā)現(xiàn)的水稻脆稈突變體中, 多數(shù)都表現(xiàn)為全生育期整株脆性, 少數(shù)在抽穗后才出現(xiàn)脆性或只有莖稈節(jié)點才表現(xiàn)脆性, Aohara等[18]檢測了水稻植株不同部位由突變引起的脆性表型, 發(fā)現(xiàn)只在莖稈節(jié)點上表現(xiàn)脆性且在抽穗后脆性表型更顯著。Wang等[19]也發(fā)現(xiàn)一種僅莖稈節(jié)點有脆性的突變體(), 并且脆性節(jié)點表型在抽穗后出現(xiàn), 隨著植株的成熟更加明顯。本研究發(fā)現(xiàn)的脆稈突變體是全生育期都呈現(xiàn)脆性, 其莖稈及葉片均易折斷, 且該脆性表型在苗期開始表現(xiàn), 至成熟期時最顯著。并且與野生型相比,莖稈第2間的抗折力和拉伸力分別減小了68.56%和81.44%, 說明脆性性狀極大地降低了它的機械強度。

圖4 野生型與突變體bc21莖稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量

*表示顯著差異(< 0.05)。

* represents significant differences at the 0.05 probability level.

WT: Kasalath;:.

表1 用于定位的SSR及STS標(biāo)記

圖5 BC21基因在6號染色體上的精細定位

表2 定位區(qū)間內(nèi)基因及其推測功能

細胞壁決定植株的機械強度, 當(dāng)細胞壁的關(guān)鍵成分改變后植株的機械強度就會發(fā)生變化, 同時細胞壁次生加厚形成的厚壁組織在支撐植株方面也具有關(guān)鍵作用[20-22]。有研究表明, 脆性突變體的莖稈細胞壁組成占比和厚壁組織細胞壁結(jié)構(gòu)與野生型不同, 如姜鴻瑞等[23]發(fā)現(xiàn)的脆稈突變體, 與野生型相比, 其莖稈的纖維素含量降低22.70%, 半纖維素含量升高45.76%, 厚壁組織細胞數(shù)目減少, 細胞壁明顯變薄。Ye等[24]發(fā)現(xiàn)脆稈突變體莖稈第2節(jié)間的纖維素含量比野生型降低了30%, 而半纖維素組分如果膠糖及木糖的含量顯著升高, 厚壁組織細胞壁厚度減小。與其他表型類似的脆稈突變體的研究結(jié)果相符, 在本研究中,莖稈的纖維素含量降低了36.56%,半纖維素含量升高了23.08%。并且利用樹脂切片和掃描電鏡技術(shù)分析了野生型和莖稈的細胞壁結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)莖稈的厚壁組織細胞空隙增多, 細胞壁明顯變薄, 這表明基因可能在莖稈厚壁組織細胞壁的形成中發(fā)揮作用。

水稻脆稈突變體中的纖維素占比減小, 更易消化, 可回收利用作為動物飼料。Su等[25]對一個水稻脆稈突變體植株進行了化學(xué)組分分析, 研究發(fā)現(xiàn)植株秸稈中的粗蛋白, 半纖維素和酸性不溶性灰分含量顯著升高, 說明脆性突變可以提高稻草的營養(yǎng)價值。此外, 有研究顯示脆稈突變植株的纖維素含量較低, 稻稈脆化, 經(jīng)微生物作用后容易降解, 釋放營養(yǎng)物質(zhì), 提高土壤養(yǎng)分, 有助于解決稻稈還田的難題[26]。因此,的脆性突變能為谷稈兩用型水稻品種的選育提供材料, 進一步促進農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展。

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Identification and gene mapping of brittle culm mutantin rice

DAI Wen-Hui1,2, ZHU Qi1,2, ZHANG Xiao-Fang1,2, LYU Shen-Yang1, XIANG Xian-Bo3, MA Tao1, CHEN Yu-Jie1, ZHU Shi-Hua1, and DING Wo-Na1,*

1College of Science and Technology, Ningbo University, Ningbo 315212, Zhejiang, China;2School of Marine Science,Ningbo University, Ningbo 315211, Zhejiang, China;3Pingyang Administration for Market Regulation, Wenzhou 325400, Zhejiang, China

A brittle culm mutantwasobtained by mutagenesis of indica rice Kasalath with ethyl methanesulfonate (EMS). Phenotypic analysis revealed that the mutant displayed both brittle culm and leaf phenotypes, which began to manifest at seedling stage and were most pronounced at mature stage. The mechanical strength analysis showed that the breaking resistance and tensile force ofstems decreased significantly. Resin sections and scanning electron microscope observation showed that the sclerenchyma cells ofculms had increased voids and thinner cell walls. Compared with the wild type, the cell wall component of stems revealed that the cellulose content ofdecreased by 36.60%, and the hemicellulose and lignin contents increased by 23.08% and 26.06%, respectively. Genetic analysis indicated that the brittle trait ofwas controlled by a single recessive gene. Using SSR markers and self-designed STS markers,was located in a 52.9 kb region between the markers STS2 and STS3 on chromosome 6, and there was no previously reported rice brittleness-related gene within this region, indicating thatmight be a new brittle culm gene in rice. This study will provide material support for further dissection of the regulation mechanism of mechanical strength of rice stems.

rice; brittle culm mutant; cell wall; cellulose; gene mapping

10.3724/SP.J.1006.2023.22025

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(32071981)和寧波市自然科學(xué)基金重點項目(202003N4016)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32071981) and the Key Project of Ningbo Natural Science Foundation (202003N4016).

丁沃娜, E-mail: dwn@zju.edu.cn

E-mail: daiwenhui1114@163.com

2022-04-27;

2022-07-22;

2022-08-12.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220811.1955.006.html

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