鐘國強(qiáng)，林巖 ，黃贊松，2，韋華

1 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色 533000；2 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心；3 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科

肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌最常見的病理類型，其發(fā)病率、病死率及死因分別占腫瘤疾病的第五、二及四位，且均有逐年上升趨勢。HCC起病隱匿且病情進(jìn)展迅速，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移多數(shù)患者確診時(shí)已處于病情中晚期，手術(shù)切除、肝移植、放化療、靶向治療等治療后的預(yù)后較差。早發(fā)現(xiàn)、早診治對(duì)改善HCC的預(yù)后具有重要意義。腫瘤標(biāo)志物是腫瘤診斷的臨床常用檢測指標(biāo)之一，是指與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)，可用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、探索腫瘤發(fā)生機(jī)制、監(jiān)測腫瘤治療效果及腫瘤復(fù)發(fā)的特異性物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物檢測具有創(chuàng)傷小、經(jīng)濟(jì)便捷、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于疾病的診斷中。目前臨床為明確早期HCC診斷，常采用血清腫瘤標(biāo)記物檢測聯(lián)合超聲、計(jì)算機(jī)X線斷層掃描（CT）及磁共振成像（MRI）等影像學(xué)檢查。近年來研究［1］發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA ， miRNA）、長鏈非編碼RNA及環(huán)狀RNA（circular RNA， circRNA）等可能作為HCC的潛在腫瘤標(biāo)記物，單獨(dú)或與常規(guī)腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測以及綜合評(píng)分模型的應(yīng)用或能進(jìn)一步提高早期HCC的診斷效率?，F(xiàn)將早期HCC診斷相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 臨床常用的相關(guān)腫瘤標(biāo)志物在早期HCC診斷中的應(yīng)用

目前臨床常用的HCC腫瘤標(biāo)志物主要有甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、 脫-γ-羧基凝血酶原（Des-γ-carboxy-prothrombin，DCP）、熱休克蛋白90α（heat shock protein 90 α，HSP90α）、高爾基體蛋白73（Golgi protein 73，GP73）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（glypican 3，GPC3）、骨橋蛋白（osteopontin ，OPN）及α-L巖藻糖苷酶（α-L-fucosidase，AFU）等。

1.1 AFP在早期HCC診斷中的應(yīng)用 AFP是一種胚胎抗原，是目前最經(jīng)典的肝癌標(biāo)志物之一，可作為HCC診斷標(biāo)志物中的“金標(biāo)準(zhǔn)”。AFP診斷HCC的靈敏度約為45%，特異度約為88%［2］。作為一種糖蛋白，AFP在HCC患者中的表達(dá)水平與腫瘤直徑相關(guān)，但其在某些良性肝病及其他胃腸惡性腫瘤中也可見表達(dá)升高。AFP異構(gòu)體AFP-L3常見于原發(fā)性肝癌，其診斷肝癌的靈敏度較高，對(duì)于早期HCC的診斷效能優(yōu)于 AFP［3］。

但AFP在HCC診斷中的應(yīng)用尚存在一定不足。AFP診斷HCC的特異度較高但靈敏度較低，臨床應(yīng)用過程中誤檢率、漏檢率均較高，且AFP對(duì)＜2 cm的原發(fā)性肝癌的診斷效能極低。為改善這一現(xiàn)狀，現(xiàn)世界范圍內(nèi)普遍采用AFP聯(lián)合腹部超聲或多標(biāo)志物聯(lián)合檢測來提高HCC的診斷效能。腹部彩超檢查聯(lián)合AFP檢測能提高非病毒肝炎相關(guān)肝硬化患者早期肝癌診斷的靈敏度［4］。有學(xué)者［5］研究發(fā)現(xiàn)，血清AFP與GP73聯(lián)合檢測早期HCC的靈敏度及特異度最高。但臨床診療過程中，AFP仍是在超聲診斷經(jīng)驗(yàn)缺乏或其他影像學(xué)檢查設(shè)備匱乏的地區(qū)最常用的HCC篩查標(biāo)志物。

1.2 DCP在早期HCC診斷中的應(yīng)用 DCP是不具正常功能的凝血酶原，也稱APT（human abnormal prothrombin），當(dāng)機(jī)體缺乏維生素K時(shí)，肝細(xì)胞不能合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ行使正常功能。由于HCC細(xì)胞對(duì)凝血酶原前體的合成發(fā)生異常，凝血酶原前體羧化不足而致使DCP大量生成［6］。

XING等［7］研究發(fā)現(xiàn)，DCP診斷HCC的特異度為89%、靈敏度為66%。一項(xiàng)多中心研究［8］發(fā)現(xiàn)，在包含521例HCC、肝轉(zhuǎn)移、肝硬化、肝血管瘤及健康對(duì)照受試者的研究中，DCP診斷HCC正確率相較于AFP高6.2%～9.7%，在447例HCC、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康對(duì)照受試者隊(duì)列中，DCP診斷HCC準(zhǔn)確率比AFP高12.30%～20.67%。由于AFP、DCP的來源及形成機(jī)制均不相同且不存在明顯相關(guān)性，故AFP、DCP檢測聯(lián)合影像學(xué)檢查可能進(jìn)一步提高早期HCC肝癌的診斷效能。

1.3 HSP90α在早期HCC診斷中的應(yīng)用 在原核和真核細(xì)胞中都有熱休克蛋白（HSP）表達(dá)，與細(xì)胞生長、凋亡及腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)或癌癥條件下發(fā)揮分子伴侶等作用。HSP90α也被稱作應(yīng)激性蛋白，是最活躍的HSP蛋白，是機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下分泌的一種保護(hù)性蛋白質(zhì)。乙肝相關(guān)性肝癌患者血清HSP90α表達(dá)水平明顯高于正常人，且存在性別差異，女性表達(dá)高于男性［9］。HSP90α高表達(dá)于HCC細(xì)胞中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，并能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面而易于被檢測，目前已普遍用于HCC的診斷中。研究［10］發(fā)現(xiàn)，血清HSP90α診斷HCC的曲線下面積（AUC）為0.836，與AFP聯(lián)合診斷HCC的AUC為0.943。

1.4 GP73在早期HCC診斷中的應(yīng)用 GP73是一種跨膜糖蛋白。GP73作為臨床應(yīng)用較多的早期肝癌標(biāo)志物，不受年齡、性別、病灶數(shù)以及血清AFP水平的影響，但與病灶直徑、血管浸潤以及腫瘤分化程度相關(guān)。GP73表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并提示患者預(yù)后不良。GP73在血清AFP陰性的HCC患者的篩查具有一定優(yōu)勢。LI等［11］在納入4 000例HCC患者后研究發(fā)現(xiàn)，血清GP73診斷早期HCC的靈敏度與特異度分別為74.6%、97.4%，均高于AFP。MARRERO等［12］認(rèn)為，血清GP73診斷早期HCC的效能優(yōu)于血清AFP。

1.5 GPC3在早期HCC診斷中的應(yīng)用 GPC3是膜性硫酸乙酰肝素類糖蛋白超家族成員之一，由糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)組成。HCC患者血清GPC3水平升高。GPC3被激活后可通過調(diào)控多條信號(hào)通路，促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和侵襲［13］。研究［14］表明，GPC3不僅是肝癌的診斷和預(yù)后預(yù)測指標(biāo)，還可能成為HCC的治療靶點(diǎn)。

1.6 OPN在早期HCC診斷中的應(yīng)用 OPN是一種分泌型磷酸化糖蛋白，參與組織修復(fù)及自身代謝。OPN主要由免疫系統(tǒng)和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，也可被腫瘤細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成骨細(xì)胞等釋放，是機(jī)體一種至關(guān)重要的黏附分子。OPN可介導(dǎo)腫瘤進(jìn)一步惡化及轉(zhuǎn)移，還能通過抑制HCC細(xì)胞NO產(chǎn)生，促進(jìn)轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞的存活。與血清AFP（0.639）比較，血清OPN（0.813）診斷早期HCC的靈敏度較高，且二者聯(lián)合檢測對(duì)早期HCC的診斷效能更高［15］，可進(jìn)一步提高檢查的準(zhǔn)確率。ZHU等［16］研究發(fā)現(xiàn)，血清OPN診斷肝癌的AUC（0.851）及靈敏度（79.21%）均優(yōu)于血清AFP（0.683，54.46%），特異度（79.64%）與 AFP（81.00%）接近。

1.7 AFU在早期HCC診斷中的應(yīng)用 AFU常見于哺乳動(dòng)物，本質(zhì)是一種水解酶，參與含巖藻糖基的大分子水解。HCC細(xì)胞可合成大量AFU并將其釋放入血，因此AFU是一種較為有效的肝癌標(biāo)志物。血清AFU對(duì)早期HCC診斷靈敏度和特異度分別為72%和78%，AUC為0.812 5［17］。血清AFU與AFP、GP73等聯(lián)合檢測可提高早期HCC確診率［18］。

2 新型腫瘤標(biāo)志物在早期HCC診斷中的應(yīng)用

《原發(fā)性肝癌診療指南（2022年版）》中指出：新型腫瘤標(biāo)志物在早期HCC診斷及治療后療效評(píng)價(jià)等方面有重要價(jià)值。近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可作為多種疾病的診斷及預(yù)后標(biāo)志物。外泌體來源的miRNA、lncRNA、 circRNA、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）及甲基化生物標(biāo)志物等可作為HCC診斷的生物標(biāo)志物。

2.1 miRNA在早期HCC診斷中的應(yīng)用 MiRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，多數(shù)來源于外泌體。miRNA可作為促癌基因或抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。最新研究認(rèn)為，miRNA可作為腫瘤標(biāo)志物用于早期肝癌篩查、預(yù)測預(yù)后。研究［19］發(fā)現(xiàn)，miRNA對(duì)血清AFP陰性HCC的診斷效能更高。PENG 等［20］發(fā)現(xiàn)，miR-130b、miR-150 等 miRNA 診斷HCC的靈敏度及特異度均大于80%。ZHOU等［21］研究發(fā)現(xiàn)，特定的 miRNA（miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、 miR-26a、 miR-27a及miR-801）試劑盒診斷早期HCC的AUC為0.888，靈敏度為81.8%，特異度為83.5%。miR-122已被確定為HCC標(biāo)志物，且外泌體來源miR-122較傳統(tǒng)診斷標(biāo)志物的診斷潛能更高［22］。因?yàn)閙iRNA來源于外泌體，不易獲得且可重復(fù)性較差，目前尚未在臨床診療中普及。

2.2 lncRNA在早期HCC診斷中的應(yīng)用 lncRNA是一類長度超過200個(gè)核苷酸且不具備蛋白編碼功能的RNA，參與調(diào)控表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［23］。HCC細(xì)胞lncRNA表達(dá)的失衡可能對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起抑制或促進(jìn)作用，故理論上lncRNA可作為HCC的診斷或預(yù)后標(biāo)志物。研究［24］發(fā)現(xiàn)，HCC 及正常細(xì)胞中 C005332.5、ELF3-AS1和LINC00665表達(dá)存在差異，且與HCC患者的生存預(yù)后相關(guān)，三種lncRNA聯(lián)合診斷HCC的AUC為 0.913，說明C005332.5、ELF3-AS1和 LINC00665可能作為HCC的診斷標(biāo)記物。

HCC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥可能與肝癌干細(xì)胞的自我更新有關(guān)，而lncRNA參與調(diào)節(jié)肝癌干細(xì)胞的自我更新能力。LncRNA-H19在人HCC細(xì)胞、HCC干細(xì)胞及小鼠模型中高表達(dá)且隨著疾病進(jìn)展及巴塞羅那分期（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）的增加而進(jìn)一步上調(diào)，提示lncRNA-H19可作為HCC診斷及預(yù)后的新的標(biāo)志物［25］。但血清lncRNA水平較低導(dǎo)致其臨床應(yīng)用尚存在一定不足。

2.3 circRNA在早期HCC診斷中的應(yīng)用 CircRNA具有獨(dú)特的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，廣泛存在于真核細(xì)胞中，具有多種生物學(xué)功能。CircRNA不含有5'及3'端且比線性RNA更穩(wěn)定，不易被核酸外切酶降解。CircRNA有一定保守性，具有組織、時(shí)序甚至細(xì)胞特異性，使它們具備作為生物標(biāo)志物的潛能。HCC患者中外泌體來源的circ_0006602表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)與乙型病毒肝炎及肝硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［26］。競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機(jī)制是環(huán)狀RNA發(fā)揮生物學(xué)功能的重要機(jī)制之一。環(huán)狀RNA可靶向競爭吸附下調(diào)對(duì)應(yīng)的miRNA表達(dá)，解除miRNA對(duì)下游靶基因的抑制，同時(shí)通過多條信號(hào)通路參與HCC的發(fā)生發(fā)展［27］。

2.4 CTCs在早期HCC診斷中的應(yīng)用 CTCs是指進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞。大部分CTCs在進(jìn)入外周血后會(huì)發(fā)生凋亡或被機(jī)體清除，少數(shù)能逃避免疫監(jiān)視而形成轉(zhuǎn)移灶。TAKAHASHI等［28］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性HCC患者血液CTCs濃度明顯高于局限性HCC患者，提示CTCs可用于預(yù)測HCC預(yù)后，并可能成為HCC進(jìn)展的新的標(biāo)志物。QI等［29］研究發(fā)現(xiàn)，112例HCC患者血液中CTCs陽性率為90.18%，提示CTCs可能用于早期HCC的篩查。有學(xué)者［30］開發(fā)了一種集成3D打印芯片外多源試劑平臺(tái)、氣泡保持器和單個(gè)CTC捕獲芯片的新的CTCs檢測系統(tǒng)，可縮短CTCs的檢驗(yàn)時(shí)間。但目前臨床CTCs的檢測和分離較為困難，檢驗(yàn)成本較為昂貴，導(dǎo)致CTCs在HCC診斷中的應(yīng)用存在一定困難。與CTCs類似的循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）等也有可能成為早期HCC診斷標(biāo)志物。

2.5 甲基化生物標(biāo)志物在早期HCC診斷中的應(yīng)用 甲基化是指經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶的催化，活性甲基化合物上的甲基被催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程，包括DNA或蛋白質(zhì)的甲基化。三個(gè)或三個(gè)以上miRNA基因的一致性高甲基化可能是檢測HCC和預(yù)后不良的高度特異度標(biāo)志物［31］。XU等［32］認(rèn)為，RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族蛋白1A （RASSF1A）啟動(dòng)子超甲基化可能作為HCC診斷標(biāo)志物，同時(shí)也可作為HCC治療的新靶點(diǎn)。

3 基于相關(guān)腫瘤標(biāo)記物的綜合評(píng)分在早期HCC診斷中的應(yīng)用

近年研究認(rèn)為，基于數(shù)種血清腫瘤標(biāo)志物推算得到的數(shù)據(jù)模型及算式得到的綜合評(píng)分可能有效提高疾病診斷的特異度及靈敏度，具有一定的臨床推廣價(jià)值。GALAD評(píng)分和APAC評(píng)分可用于HCC的早期診斷。

3.1 GALAD評(píng)分在早期HCC診斷中的應(yīng)用 GALAD評(píng)分由JOHNSON等［33］提出，主要包含的指標(biāo)為年齡（age）、性別（gender）、AFP、AFP-L3及DCP等。具體算法為GALAD評(píng)分= （0.09×age + 1.67×gender）+ （2.34×log10（AFP） + （0.04×AFP-L3） + （1.33×log10DCP ）-10.08，其中男性、女性賦值分別為0、1。JOHNSON等［33］在納入331例HCC、339例慢性肝病患者后發(fā)現(xiàn)，在選取切點(diǎn)值為-1.58時(shí)，GALAD評(píng)分診斷肝癌的特異度為80%，靈敏度為97%，后續(xù)內(nèi)部驗(yàn)證的靈敏度為98%，特異度為74%。進(jìn)一步研究［34］發(fā)現(xiàn)，GALAD評(píng)分對(duì)乙肝或丙肝患者早期HCC診斷的靈敏度較高?！睹绹鴩⒕C合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南（肝膽癌，2021年版）》中也指出，AFP、AFP-L3、DCP聯(lián)合年齡性別構(gòu)成的GALAD新型血清標(biāo)志物模型對(duì)慢性肝病或非酒精性脂肪肝中HCC的識(shí)別具有較高的準(zhǔn)確性［35］。

3.2 APAC評(píng)分在早期HCC診斷中的應(yīng)用 APAC評(píng)分是一種基于AFP及肌酐等指標(biāo)的評(píng)分工具，評(píng)分系統(tǒng)主要包含的指標(biāo)有：年齡（Age），可溶性血小板衍生生長因子受體β（sPDGFRβ），AFP及肌酐（Creatinine）。其具體算法為：APAC=（Age×0.204 80）-［log10（sPDGFRβ）×1.986 84］+ ［log10（AFP）×2.456 57］-（Creatinine ×2.468 91）-4.364 93。LAMBRECHT 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，在切點(diǎn)值為 0.796 9時(shí)，APAC評(píng)分診斷HCC的靈敏度81.7%、特異度95.4%，APAC評(píng)分診斷HCC的靈敏度、特異度均高于AFP。

綜上所述，AFP、AFP-L3、OPN、AFU等經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物仍是目前臨床常用的HCC腫瘤標(biāo)志物，但其均不能滿足臨床早期HCC的診斷需求。外泌體來源的miRNA、lncRNA、 circRNA、CTCs及甲基化生物標(biāo)志物等新型標(biāo)志物對(duì)早期HCC的診斷效能較高。同時(shí)對(duì)于臨床高度疑診為HCC的患者，在未出現(xiàn)影像學(xué)改變或HCC常規(guī)腫瘤標(biāo)志物升高不顯著時(shí)，新型血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測的檢出率更高。GALAD評(píng)分和APAC評(píng)分等綜合評(píng)分方法可進(jìn)一步明確早期HCC的診斷，改善HCC患者的預(yù)后。