韋楠 綜述 陳天平 劉洪軍 審校

（安徽省兒童醫(yī)院血液科，安徽合肥 230051）

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童期最常見的惡性腫瘤，隨著聯(lián)合化療和精準(zhǔn)分層治療的開展，兒童ALL的5年總生存（overall survival，OS）率明顯提高，但仍有近20%的ALL患者因化療耐藥而出現(xiàn)復(fù)發(fā)［1］。復(fù)發(fā)難治性ALL患兒的預(yù)后不容樂觀，5年OS率僅為19%~52%［2］。傳統(tǒng)的異基因造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT） 是ALL治療的重要手段，但復(fù)發(fā)難治性患兒在移植前難以達(dá)到緩解狀態(tài)，即使緩解后接受HSCT，患者的遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率仍高達(dá)20%~30%［3-4］。免疫治療是近年來腫瘤治療領(lǐng)域的重大突破，其中嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法發(fā)展最為迅速［5］。目前瑞士諾華制藥有限公司研發(fā)的靶向白細(xì)胞分化抗原19（cluster of differentiation 19， CD19） CAR-T 細(xì) 胞 產(chǎn) 品Tisagenlecleucel（商品名：Kymriah）已經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）審批上市，但國內(nèi)尚無針對(duì)兒童ALL的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品獲批。本文就CAR-T細(xì)胞在兒童復(fù)發(fā)難治性ALL中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)概述

CAR-T細(xì)胞主要包括3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，即細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由共刺激結(jié)構(gòu)域和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成，其中共刺激結(jié)構(gòu)域通常為白細(xì)胞分化抗原28（cluster of differentiation 28，CD28）或腫瘤壞死因子受體超家族成員9（recombinant tumor necrosis factor receptor superfamily，member 9，TNFRSF9），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域由T細(xì)胞受體 （T cell receptor，TCR）/CD3ζ鏈構(gòu)成［6-7］。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可將CAR-T細(xì)胞分為5代，截至2022年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)上市的6款CAR-T產(chǎn)品均為第二代CAR-T細(xì)胞。第三代CAR-T細(xì)胞包含2個(gè)或更多的刺激分子，在此基礎(chǔ)上引入自殺基因或免疫調(diào)控元件的CAR-T細(xì)胞，即重定向用于通用細(xì)胞因子介導(dǎo)殺傷的T細(xì)胞（T-cells redirected for universal cytokine killing，TRUCKs），它的提出意味著第4代CAR-T細(xì)胞的誕生。第5代CAR-T細(xì)胞插入了白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）受體鏈和共刺激結(jié)構(gòu)域，并通過激活蛋白酪氨酸激酶JAK（janus kinase）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activatior of transcriptor，STAT）途徑促進(jìn)細(xì)胞因子信號(hào)傳遞［8］。盡管在抗腫瘤能力和安全性方面還未得到臨床試驗(yàn)的證實(shí)，但新一代CAR-T細(xì)胞仍有望在血液腫瘤以外開辟新的治療領(lǐng)域，取得更多革命性進(jìn)展。

2 CAR-T細(xì)胞免疫治療兒童復(fù)發(fā)難治性ALL的優(yōu)勢(shì)

2013年，Grupp等［9］教授團(tuán)隊(duì)在New England Journal of Medicine雜志上發(fā)表了2例復(fù)發(fā)難治性ALL患兒接受CD19 CAR-T細(xì)胞免疫治療，其中1例患兒在治療后約2個(gè)月復(fù)發(fā)，免疫分型檢測(cè)表明其白血病細(xì)胞表面CD19抗原表達(dá)轉(zhuǎn)陰；而另1例患兒接受治療后約1個(gè)月實(shí)現(xiàn)白血病形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)的完全緩解（complete remission，CR），現(xiàn)已無病生存10年，成為首位受益于CAR-T細(xì)胞免疫治療的ALL患者。隨著Tisagenlecleucel的審批上市，全球首個(gè)兒科CAR-T細(xì)胞免疫療法Ⅱ期注冊(cè)試驗(yàn)ELIANA在全球25個(gè)醫(yī)學(xué)中心開展，共75名兒童和年輕成人患者入組接受了Tisagenlecleucel治療，3個(gè)月內(nèi)的總體緩解率（overall response rate，ORR）為81%，且微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）均為陰性［10］。6個(gè)月的無事件生存（event-free survival，EFS）率和OS率分別為73%（95%CI： 60%~82%） 和 90% （95%CI： 81%~95%），隨訪12個(gè)月EFS率和OS率分別為50%（95%CI： 35%~64%） 和 76% （95%CI： 63%~86%），所有患者均未出現(xiàn)治療相關(guān)死亡。Tan等［11］對(duì)12例合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病（central nervous system leukemia，CNSL）的急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙ cell-acute lymphoblastic leukemia，BALL）患兒予以CD19 CAR-T細(xì)胞治療，9例患兒獲得緩解，6個(gè)月無白血病生存（leukemia-free survival，LFS）率為81.8%（95%CI：59%~100%）。Chen等［12］報(bào)道了7例睪丸復(fù)發(fā)的ALL患兒接受CD19 CAR-T細(xì)胞免疫治療，所有患兒均達(dá)到CR，睪丸均恢復(fù)正常。隨訪12個(gè)月，所有患兒的EFS為83.3%±15.2%，表明CAR-T細(xì)胞免疫治療在髓外復(fù)發(fā)ALL患兒的治療中同樣發(fā)揮顯著效果。Stefanski等［13］對(duì)兒科真實(shí)世界CAR聯(lián)盟（Pediatric Real World CAR Consortium， PRWCC）成員機(jī)構(gòu)的185例輸注Tisagenlecleucel的患者數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，輸注CAR-T細(xì)胞的中位劑量為1.7×106細(xì)胞/kg，其中86例患者接受了更高劑量（1.701~5.100×106細(xì)胞/kg） 的CAR-T細(xì)胞輸注，結(jié)果接受更高劑量Tisagenlecleucel患者的OS、EFS和RFS均得到明顯改善（P=0.031，0.0079和0.0045），且更高劑量的Tisagenlecleucel與毒性增加無關(guān)。ZUMA-4是應(yīng)用靶向CD19的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品KTE-X19（商品名：Tecartus）治療兒童/青少年復(fù)發(fā)難治性B-ALL的Ⅱ期臨床研究，在可評(píng)估劑量限制性毒性的患者中并未觀察到劑量限制性毒性，而劑型為1×106CAR-T細(xì)胞/kg（40 mL）隊(duì)列中，患者的CR率及CR伴不完全血液學(xué)恢復(fù)（CR with incomplete count recovery，CRi） 率可達(dá)71%，MRD陰性率達(dá)100%［14］。另一項(xiàng)來自美國的單中心Ⅰ期劑量遞增研究［15］中，50例兒童和年輕B-ALL患者接受了CD19.28ζ-CART細(xì)胞治療，31例（62.0%）獲得CR，中位隨訪時(shí)間為4.8年，中位OS為10.5個(gè)月（95%CI：6.3~29.2個(gè)月）。在MRD陰性的28例患者中，有21例在CAR-T細(xì)胞輸注后橋接了HSCT，其中位OS為70.2個(gè)月（95%CI：10.4個(gè)月至無法評(píng)估），表明CD19.28ζ-CAR T細(xì)胞橋接HSCT序貫治療能使相當(dāng)一部分兒童和年輕B-ALL患者獲得疾病的持續(xù)緩解。

學(xué)術(shù)界仍在探索影響CAR-T細(xì)胞治療反應(yīng)性和持久性的相關(guān)因素。在一項(xiàng)多中心的回顧性研究［16］中發(fā)現(xiàn)，相比處于緩解狀態(tài)或者腫瘤負(fù)荷較低的患者，高腫瘤負(fù)荷患者（輸注前骨髓原始細(xì)胞超過5%、合并CNSL以及髓外病灶）在輸注CAR-T細(xì)胞后的OS和EFS明顯降低（P<0.001）。Zhang等［17］對(duì)254例應(yīng)用CD19 CAR-T細(xì)胞治療的B-ALL患者的隨訪結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TP53（tumor protein P53）突變和骨髓原始細(xì)胞>20%是影響患者CR率的兩個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而年齡、髓外疾病、復(fù)雜的細(xì)胞遺傳學(xué)、既往移植史、既往化療療程、CAR-T細(xì)胞劑量和細(xì)胞產(chǎn)品的制造來源并不影響患者的CR率。與未接受CAR-T治療的患者相比，在HSCT前接受CAR-T治療患者的OS和LFS更高。

3 CAR-T細(xì)胞治療兒童復(fù)發(fā)難治性ALL的不良反應(yīng)

3.1 細(xì)胞因子釋放綜合征

細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）是CAR-T細(xì)胞輸注后最常見的不良反應(yīng)，主要機(jī)制是淋巴細(xì)胞活化導(dǎo)致的大量細(xì)胞因子釋放［18］。與CRS最為密切的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、白細(xì)胞介素1（interleukin 1，IL-1）、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞黏附分子-1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A［19］。Maude等［20］對(duì)137例接受Tisagenlecleucel治療的難治復(fù)發(fā)性B-ALL患者的不良事件進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)77%的患者出現(xiàn)3~4級(jí)Tisagenlecleucel相關(guān)不良事件，在輸注后8周內(nèi)最常見的不良事件為CRS，其中22%患者為4級(jí)CRS。除了糖皮質(zhì)激素以外，以IL-6為靶點(diǎn)的抗細(xì)胞因子治療可顯著縮短CRS病程，且不影響CAR-T細(xì)胞作用和遠(yuǎn)期療效。托珠單抗和司妥昔單抗是兩種常用的抗IL-6生物制劑，Zhang等［21］研究顯示IL-6水平升高不到4倍的患者在接受托珠單抗治療后發(fā)生嚴(yán)重CRS的概率更高（P=0.0125），這為在IL-6指導(dǎo)下細(xì)化CRS干預(yù)策略提供了依據(jù)。

3.2 免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征

免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）是CAR-T細(xì)胞治療過程中的另一種嚴(yán)重不良反應(yīng)，發(fā)生率為20%~70%，可與CRS同時(shí)出現(xiàn)，也可在CRS改善后出現(xiàn)，其發(fā)生率隨CRS嚴(yán)重程度的增加而增加 （P<0.001）［20］。目前ICANS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，大量炎性因子釋放可能是ICANS的始動(dòng)環(huán)節(jié)，血清中炎性因子水平異常升高可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞并活化星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，引起血腦屏障通透性異常改變［22］。在一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究［23］中，3例骨髓復(fù)發(fā)且合并活動(dòng)性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患兒在輸注CD19 CAR-T細(xì)胞后，1例出現(xiàn)5級(jí)ICANS，表明高腫瘤負(fù)荷可能會(huì)增加嚴(yán)重神經(jīng)毒性的風(fēng)險(xiǎn)。神經(jīng)絲輕鏈（neurofilament light chain，NfL）作為神經(jīng)軸突損傷的標(biāo)志物，其血清水平與ICANS的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)ICANS發(fā)生及評(píng)估ICANS嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)［24］。ICANS的治療方案類似于CRS，主要是在基于毒性等級(jí)評(píng)估的基礎(chǔ)上予以積極的支持治療。IL-1受體拮抗劑阿那白滯素（Anakinra）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子抑制劑Lenzilumab（侖茲魯單抗）在ICANS動(dòng)物模型中顯示出一定的治療效果，未來有望在ICANS的治療中發(fā)揮作用［25］。

3.3 B細(xì)胞缺陷

由于CAR-T細(xì)胞在靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)清除表達(dá)CD19、白細(xì)胞分化抗原22（cluster of differentiation 22，CD22）等正常B細(xì)胞。B細(xì)胞缺陷持續(xù)時(shí)間從2個(gè)月到2年，其持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短可作為衡量CAR-T細(xì)胞持久性的重要指標(biāo)。在一項(xiàng)國際、多中心、回顧性隊(duì)列研究［26］中，35例B-ALL患者接受了Tisagenlecleucel輸注，隨訪12個(gè)月，B細(xì)胞免疫缺陷的發(fā)生率約為70%（95%CI：46%~84%）。CAR-T細(xì)胞輸注后的患者應(yīng)定期檢測(cè)B細(xì)胞數(shù)目和免疫球蛋白水平，對(duì)于嚴(yán)重或復(fù)發(fā)性細(xì)菌感染的患者，應(yīng)優(yōu)先考慮每月一次免疫球蛋白輸注［27］。

3.4 血液學(xué)毒性和其他并發(fā)癥

在輸注CAR-T細(xì)胞前采取的常規(guī)清除淋巴細(xì)胞預(yù)處理方案，以及CAR-T細(xì)胞輸注后的脫靶效應(yīng)是導(dǎo)致血液學(xué)毒性的主要原因。目前文獻(xiàn)報(bào)道的CD19 CAR-T細(xì)胞治療B-ALL后3~4級(jí)中性粒細(xì)胞減少發(fā)生率為53%~94%，3~4級(jí)貧血的發(fā)生率為51%~68%，3~4級(jí)血小板減少的發(fā)生率為41%~53%［28-31］。感染也是CAR-T細(xì)胞治療的重要并發(fā)癥，在CAR-T細(xì)胞輸注后28 d內(nèi)發(fā)生的感染定義為早期感染。在Hill等［32］的報(bào)道中，早期感染發(fā)生率約23%左右，且CRS的嚴(yán)重程度與感染密切相關(guān)。盡管超過半數(shù)患者為細(xì)菌感染，但中國人口基數(shù)大，乙型肝炎病毒攜帶率高，如何控制乙肝病毒激活的風(fēng)險(xiǎn)仍然需要引起重視。對(duì)于CART細(xì)胞輸注前腫瘤負(fù)荷高的患者而言，輸注后出現(xiàn)腫瘤溶解綜合征的風(fēng)險(xiǎn)更大，且比化療引起的腫瘤溶解綜合征更加嚴(yán)重。凝血功能異常與內(nèi)皮細(xì)胞的異常激活或損傷有關(guān)，但出現(xiàn)嚴(yán)重臟器出血導(dǎo)致死亡者罕見［33］。嗜血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥/巨噬細(xì)胞活化綜合征（hemophagocytic lymphohistiocytosis/macrophage activation syndrome，HLH/MAS）常繼發(fā)于重度CRS，在臨床癥狀方面也存在一定的重疊，目前報(bào)道其發(fā)生率低于1%，但死亡率極高。此外，CAR-T細(xì)胞輸注后的移植物抗宿主病、皮膚損害等也有少量報(bào)道。今后仍需要大量研究以精確管理及控制CAR-T細(xì)胞治療相關(guān)并發(fā)癥，對(duì)提高患者預(yù)后及生存質(zhì)量具有重要意義。

4 CAR-T細(xì)胞治療后的復(fù)發(fā)

越來越多的研究［34］表明，CAR-T細(xì)胞治療后的患者并不能獲得長(zhǎng)期緩解，近50%的患兒在1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。根據(jù)CD19抗原是否存在可分為CD19陽性復(fù)發(fā)和CD19陰性復(fù)發(fā)。CD19陽性復(fù)發(fā)的主要原因是CAR-T細(xì)胞的持久性差，在這種情況下，CD19抗原仍然保留在腫瘤細(xì)胞表面。但在CD19陰性復(fù)發(fā)的情況下，CD19抗原將不再存在，腫瘤將不能被CAR-T細(xì)胞識(shí)別和清除，稱為抗原逃逸［35］。但仍有一些患者的復(fù)發(fā)不一定表現(xiàn)為抗原完全喪失，提示存在其他潛在機(jī)制導(dǎo)致腫瘤逃避CAR-T細(xì)胞的攻擊，如抗原密度降低、抗原編碼基因突變、選擇性剪接、譜系轉(zhuǎn)換等［36-38］。此外，腫瘤抑制微環(huán)境中的各種代謝物、抑制性細(xì)胞因子、免疫抑制細(xì)胞也會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的活性［39-40］。CAR-T細(xì)胞上的某些抑制分子如程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）、T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白 3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyteassociated protein 4，CTLA-4）及淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）等的上調(diào)也會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞功能抑制和衰竭［41-42］。

5 減少復(fù)發(fā)和提高CAR-T細(xì)胞療效的策略

隨著CAR-T細(xì)胞適應(yīng)證的不斷增加，學(xué)術(shù)界開始將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向如何減少復(fù)發(fā)和提高CAR-T細(xì)胞的療效，針對(duì)CAR-T治療的全過程采取多種綜合措施有望降低復(fù)發(fā)率。首先需要建立T細(xì)胞供者篩選和采集后評(píng)價(jià)體系，并不斷完善標(biāo)準(zhǔn)化的CAR-T細(xì)胞制備生產(chǎn)流程以及質(zhì)量檢驗(yàn)控制標(biāo)準(zhǔn)。其次可以通過研發(fā)人源化CAR-T細(xì)胞、通用型CAR-T細(xì)胞、改進(jìn)基因編輯技術(shù)、優(yōu)化預(yù)處理方案等增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的功能并延長(zhǎng)其生存時(shí)間［43-44］。為了進(jìn)一步減少輸注后腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，有學(xué)者提出開發(fā)可作用于多個(gè)抗原靶點(diǎn)的CAR構(gòu)建物。目前報(bào)道的臨床前數(shù)據(jù)包括抗CD19和抗CD22靶向CAR-T、抗CD19和抗白細(xì)胞介素-3受體 α鏈（interleukin-3 receptor alpha chain，IL-3 Rα）組合CAR-T等。在CAR-T細(xì)胞治療同時(shí)聯(lián)合新藥如B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抑制劑、布魯頓酪氨酸激酶（Bruton” s tyrosine kinase，BTK）抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI） 等可顯著增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，但其具體機(jī)制及適應(yīng)證仍需要大量研究進(jìn)一步明確［48-49］。

6 總結(jié)及展望

目前CAR-T細(xì)胞在兒童復(fù)發(fā)難治性ALL的治療中顯示出良好前景，尤其是對(duì)于合并CNSL以及睪丸等髓外病灶的患者揭示了新的治療策略，但機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，在免疫治療的新時(shí)代，仍需要不斷改進(jìn)CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、制備工藝、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)以提高CAR-T細(xì)胞的有效性和安全性，而對(duì)于CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)特性以及腫瘤免疫逃避的機(jī)制，也還需要大量研究數(shù)據(jù)進(jìn)行探討。我們有理由相信，隨著對(duì)CAR-T細(xì)胞研究的不斷深入，制約其臨床大規(guī)模應(yīng)用和推廣的因素必將逐漸消失，CAR-T細(xì)胞將成為一種更加安全有效的細(xì)胞免疫療法，也必然會(huì)改變現(xiàn)有的治療模式，造福更多復(fù)發(fā)難治性ALL患兒。