楊蕾，韓彥莎，儀慧蘭

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

二氧化硫（SO2）是普遍存在的大氣污染物，主要來源于煤炭、石油等化石燃料的燃燒和含硫礦物的加工［1］。大氣SO2污染會(huì)抑制植物光合作用，干擾呼吸過程，引起葉面損傷，甚至植株死亡［2-3］。研究表明，高濃度的SO2可誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2?·）、過氧化氫（H2O2）等的大量產(chǎn)生［3-4］，提高胞內(nèi)ROS水平。一定量的ROS可誘發(fā)植物抗逆基因表達(dá)，提高植株逆境適應(yīng)能力，但過量ROS會(huì)引發(fā)氧化脅迫和氧化損傷［5］。

SO2主要由氣孔進(jìn)入植物體，經(jīng)水解生成SO32?。胞內(nèi) SO32-可氧化為 SO42?后儲(chǔ)存，SO32?和SO42?可經(jīng)硫同化途徑產(chǎn)生半胱氨酸（Cys）。植物硫同化過程從SO42?開始，根部從土壤中吸收的SO42?可被ATP硫酸化酶（APS）還原為SO32?，SO32?經(jīng)亞硫酸鹽還原酶（SiR）催化生成硫化氫，而后在O-乙酰絲氨酸裂解酶（OASTL）作用下合成有機(jī)硫化合物Cys。Cys是甲硫氨酸、谷胱甘肽和其他含巰基多肽與蛋白質(zhì)的前體，這些胞內(nèi)巰基通過多種途徑參與維持細(xì)胞的氧化還原平衡［6］。逆境脅迫時(shí)硫同化途徑增強(qiáng)，胞內(nèi)含硫抗氧化物水平提高，有益于植物的抗氧化防御［7-8］。其中，谷胱甘肽是普遍存在于植物細(xì)胞中的抗氧化小分子，還原型谷胱甘肽（GSH）可直接還原O2?·、羥基自由基（·OH?）等ROS分子，還能與谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）等一起，清除胞內(nèi)活性氧、協(xié)助細(xì)胞解毒［9］；谷胱甘肽還原酶（GR）可將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為GSH，維持較高水平的GSH［10］。

谷子是我國(guó)北方地區(qū)廣泛種植的糧食作物。近年來，因其具有耐瘠薄、抗旱、高光效及基因組小、生命周期短等優(yōu)勢(shì)，谷子已逐漸成為研究C4植物生理特性的新模式物種［11］。前期研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的SO2熏氣可激活谷子幼苗抗氧化系統(tǒng)，提高植株滲透調(diào)節(jié)能力［12］，但谷子對(duì)SO2脅迫的適應(yīng)機(jī)制尚不清楚。本文以谷子幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，從生理生化和基因表達(dá)等方面研究SO2暴露對(duì)谷子硫同化作用的影響，為揭示谷子逆境響應(yīng)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物培養(yǎng)

將谷子（Setaria italica L.）“長(zhǎng)農(nóng) 44號(hào)”的種子在2.5%次氯酸鈉溶液中消毒5 min，無菌蒸餾水沖洗3次。濕紗布包裹催芽后，播種于長(zhǎng)、寬、高均為10 cm的育苗盆中，每盆10顆種子，置培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度（23±1） ℃，相對(duì)濕度 50%～60%，光/暗周期16 h/8 h，光照強(qiáng)度 150 μmol·m?2·s?1。

1.2 SO2暴露

根據(jù)我們前期的研究結(jié)果［12］，選用10 mg·m?3和30 mg·m?3的SO2濃度。將苗齡 15 d的谷子幼苗10盆置于體積1 m3（長(zhǎng)、寬、高均為1 m）的密閉箱中，依據(jù)K2S2O5+2HCl→2KCl+H2O+2SO2原理產(chǎn)生SO2，并利用甲醛吸收-副玫瑰苯胺分光光度法測(cè)定SO2濃度，維持熏氣箱內(nèi)SO2濃度穩(wěn)定［13］。對(duì)照組箱體內(nèi)為自然空氣，放置相同的植株數(shù)量。

1.3 生物量和生理生化指標(biāo)檢測(cè)

SO2處理一定時(shí)間后，取谷子幼苗20株，測(cè)定幼苗地上部分生物量及葉組織中的相關(guān)生理和分子指標(biāo)。

1.3.1 葉綠素含量測(cè)定

取谷子葉片用96%的乙醇提取葉綠素，分光光度法測(cè)定葉綠素a/b的含量，以葉綠素a和葉綠素b之和表示葉綠素含量［14］。

1.3.2 抗氧化酶活性測(cè)定

取谷子葉片加入50 mmol·L?1的磷酸鹽緩沖液，研磨制漿，12 000 g離心后取上清，檢測(cè)其中的酶活性。采用Brychkova等的方法［15］檢測(cè) SiR 酶活性，用 Müller-Schüssele等的方法［16］測(cè)定 GR 酶活性，以 1 min內(nèi)氧化 1 mmol·L?1NADPH所需的酶量記為一個(gè)酶活力單位（U）；采用CDNB比色法測(cè)定GST酶活性［17］，以1 min內(nèi)吸光值降低0.1所需的酶量作為一個(gè)酶活力單位（U）；參照 Wendel［18］的方法測(cè)定GPX酶活性，以1 min內(nèi)分解1 μmol GSH所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

取谷子葉片加入 20 mmol·L?1的 Tris-HCl研磨，12 000 g離心，取上清，參照 Hasan等［19］的方法測(cè)定OASTL酶活性，將1 min內(nèi)生成1 μmol Cys所需的酶量作為一個(gè)酶活力單位（U）。

取不同提取液，采用Pierce BCA Protein As?say Kit（Thermo，USA）檢測(cè)各測(cè)試樣品中的蛋白質(zhì)含量，用于酶活力計(jì)算。

1.3.3 Cys、GSH和GSSG含量測(cè)定

取谷子葉片，加入 25 mmol·L?1Tris-HCl研磨勻漿，12 000 g離心后取上清，用酸性茚三酮法測(cè)定Cys含量［20］，用谷胱甘肽試劑盒（A061-1，南京建成生物工程研究所）測(cè)定GSH和GSSG含量。

1.4 基因表達(dá)水平檢測(cè)

用植物總RNA快速提取試劑盒（Dakewe，China）提取新鮮葉組織總RNA，采用Prime?Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，Japan）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq? II PCR Kit（Takara， Japan）對(duì)目的基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，3 min；95 ℃，5 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s。以 Si?Actin 為內(nèi)參，采取 2–ΔΔCt方法計(jì)算處理組與對(duì)照組基因表達(dá)的差異［21］。所用引物序列如表1所示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來自3次獨(dú)立的取材測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為均值（X）±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE），采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析處理組和對(duì)照組的差異顯著性，用*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 SO2對(duì)谷子幼苗生物量和葉綠素含量的影響

谷 子 幼苗暴露于 10 mg·m?3的 SO2時(shí)，植株地上部分生物量與對(duì)照組無明顯差異（P>0.05；圖1（a）），葉綠素含量在暴露72 h時(shí)顯著降低（P<0.05；圖 1（b））。暴露于 30 mg·m?3的SO2時(shí)，植株地上部分生物量在暴露前期與對(duì)照無明顯變化（P>0.05；圖1（a）），暴露72 h后顯著下降（P<0.05；圖 1（a））；葉綠素含量呈相同趨勢(shì)（圖1（b））。以上結(jié)果表明，SO2對(duì)谷子幼苗的影響與濃度和作用時(shí)間有關(guān)，30 mg·m?3SO2短期暴露抑制植株生長(zhǎng)，因此，后續(xù)選用 30 mg·m?3SO2研究谷子幼苗對(duì) SO2脅迫的響應(yīng)。

2.2 SO2對(duì)谷子幼苗硫同化作用的影響

幼苗暴露于30 mg·m?3的 SO2后，硫同化途徑關(guān)鍵酶OASTL和SiR的酶活性提高，OASTL酶活性在暴露24 h后顯著提高，SiR酶活性在暴露72 h時(shí)顯著高于對(duì)照（P<0.01；圖2（a）、2（b））。硫同化產(chǎn)物 Cys的含量在 SO2暴露24 h和72 h時(shí)顯著增加24.1%和46.7%（P<0.01；圖 2（c）），與 OASTL 酶活性改變呈相同趨勢(shì)。硫同化途徑關(guān)鍵基因SiOASTL、Si?SiR和SiAPS的轉(zhuǎn)錄水平在SO2暴露組發(fā)生改變，SiOASTL轉(zhuǎn)錄上調(diào)（P<0.01；圖 2（e）），Si?SiR在暴露72 h時(shí)明顯上調(diào)（P<0.01；圖2（d）），而SiAPS在SO2暴露24 h和72 h時(shí)表達(dá)下降（P<0.05；圖 2（f））。以上結(jié)果表明，SO2暴露能使谷子幼苗硫同化作用增強(qiáng)，含硫抗氧化物含量提高；而同期SiAPS表達(dá)下調(diào)，可能抑制 SO42?轉(zhuǎn)化為 SO32?，減少 SO32?積累。

2.3 SO2對(duì)谷子幼苗谷胱甘肽循環(huán)的影響

暴露于 30 mg·m?3的 SO2后，谷子葉片總GSH含量顯著高于對(duì)照（P<0.05；圖3（a））；還原型GSH和GSSG的含量在熏氣前期與對(duì)照組無明顯差異（P>0.05），熏氣72 h后GSH的含量顯著高于對(duì)照（P<0.01；圖 3（b）），GSSG的含量顯著降低（P<0.05；圖 3（c）），致使GSH/GSSG比值顯著升高（P<0.01；圖3（d））。與此同時(shí)，GR酶活性在SO2暴露期間顯著高于對(duì)照（P<0.05；圖3（e））；GST酶活性在熏氣前期與對(duì)照組無明顯差異（P>0.05），熏氣72 h后顯著提高（P<0.01；圖 3（f））；GPX酶活性在暴露期間與對(duì)照無明顯變化（P>0.05；圖3（g））。SO2暴露組總GSH含量提高說明SO2暴露組谷子幼葉GSH合成增加，而GR活性增加能促進(jìn)谷胱甘肽循環(huán)中GSSG還原為GSH，維持胞內(nèi)較高水平的還原型GSH，有益于脅迫條件下細(xì)胞的氧化還原平衡和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

3 討 論

SO2進(jìn)入植物體后水合生成 SO32?，SO32?可經(jīng)硫同化途徑生成Cys，也可被氧化為SO42?，同時(shí)產(chǎn)生ROS［22］。氧化脅迫是SO2暴露影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要原因，谷子幼苗經(jīng)30 mg·m?3SO2暴露72 h時(shí)植株地上部分生物量下降，與SO2暴露誘導(dǎo)葉面氣孔關(guān)閉［12］、葉綠素含量下降繼而影響光合作用有關(guān)，也是植株氧化脅迫的反映。植物暴露于高濃度SO2時(shí)組織細(xì)胞中ROS 水平提高，抗氧化防御體系被激活［6，22］。SO2暴露時(shí)擬南芥植株硫同化作用增強(qiáng)，同化產(chǎn)物Cys增加，GSH含量、GPX和GST活性提高，參與植株抗氧化應(yīng)答［7-8］，本研究在谷子幼苗中得到了相似結(jié)果，并證實(shí)SO2熏氣組谷子幼苗硫同化基因SiSiR、SiOASTL表達(dá)上調(diào)。本結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的干旱、重金屬脅迫誘導(dǎo)小麥和擬南芥植株硫同化作用增強(qiáng)，GSH合成增加［23-24］相一致，表明非生物脅迫能夠誘導(dǎo)植物硫同化作用增強(qiáng)，激活的硫同化作用在植物逆境適應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。其中，細(xì)胞內(nèi)的Cys、GSH及含巰基的多肽和蛋白質(zhì)，在細(xì)胞氧化還原平衡中有無可替代的作用［25］。

谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化小分子，可直接清除ROS分子，或通過GSH-ASA循環(huán)和 GSH-GSSG 循 環(huán) 清 除 ROS［26］。 在 GSHGSSG循環(huán)中，GST將脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)化成無毒醇，GPX將H2O2還原成水［27］，同時(shí)GSH被氧化為GSSG；而GSSG可經(jīng)GR催化還原為GSH。在GSH-GSSG循環(huán)過程中，活性氧自由基被清除，循環(huán)相關(guān)酶的活性提高可加速胞內(nèi)活性氧的清除。此外，GST作為一種細(xì)胞解毒酶，可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的有毒代謝產(chǎn)物，并協(xié)助其從胞內(nèi)排出，從而使細(xì)胞解毒。SO2誘導(dǎo)谷子GST活性增高，能夠促進(jìn)脅迫期間胞內(nèi)有害物質(zhì)的排出；GR活性增高可加速細(xì)胞的谷胱甘肽循環(huán)，進(jìn)而提高GSH含量，維持較高GSH/GSSG比值，高效清除ROS。SO2脅迫促進(jìn)擬南芥組織中Cys、GSH及游離巰基增加［7］，與本文結(jié)果一致，說明植物可通過調(diào)整硫還原作用提高細(xì)胞抗氧化能力，增強(qiáng)植株的逆境適應(yīng)性。

研究還發(fā)現(xiàn)，SO2脅迫可誘導(dǎo)谷子葉片中SiAPS基因表達(dá)下調(diào)（圖2（f）），從而抑制硫同化過程中SO42?還原成SO32?，這是葉綠體內(nèi)SO32?過量形成的反饋抑制，能減少SO32?的積累，使胞內(nèi)更多的無機(jī)硫以SO42?形式存在。SO42?對(duì)細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)小于 SO32?，因此 SO42?還原的抑制對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有積極的作用，可增強(qiáng)谷子幼苗對(duì)SO2脅迫的耐受性。

本文報(bào)道了谷子硫同化過程對(duì)SO2脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了SO2對(duì)硫同化產(chǎn)物形成的促進(jìn)作用，即SO2暴露可激活谷子植株硫同化途徑，提高硫同化產(chǎn)物Cys和含硫抗氧化物GSH的水平，有助于提升組織細(xì)胞的抗氧化能力；與此同時(shí)，SO2暴露抑制了 SO42?還原為 SO32?的過程，可減少有害性分子SO32?的積累，保護(hù)細(xì)胞免于傷害（圖4）。