宓 偉,尹淑英,高麗霞,李 寧,石塔拉
(1.濱州醫(yī)學院公共衛(wèi)生與管理學院,山東 煙臺 264003;2.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科,山東 濱州 256603)
肝細胞性肝癌(hepatocellular carcioma,HCC)起源于肝臟的上皮或間葉組織,具有易發(fā)生早期轉移和播散、惡性程度高的特點,傳統(tǒng)的化療和放療未見生存獲益[1-3]。我國每年約11萬人死于肝癌,占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%[4]。HCC是受環(huán)境因素和飲食因素雙重影響的發(fā)病過程復雜的惡性腫瘤,目前確切的分子發(fā)病機制尚不完全清楚。隨著分子生物學的深入研究和發(fā)展,在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中,發(fā)現(xiàn)有多條分子信號通路,如磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphattidylinositol 3-kinase/serine threonine protein kinase/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR)、沉默調節(jié)蛋白6/核轉錄因子-κB(recombinant sirtuin 6/nuclear factor kappa-B,SIRT6/NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、血管內皮生長因子受體和血小板衍生生長因子受體等信號通路,其參與肝癌細胞的增殖、分化、侵襲和轉移[5-14]。
山楂原花青素(hawthorn procyanidins,HPC)是一類由表兒茶素和兒茶素縮合而成的一種比來源于葡萄籽高聚體原花青素生物活性高的低聚體多酚化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、抗微生物等生理活性[15-18]。腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6,Traf6)是一種銜接蛋白家族成員,可以介導腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)受體、白細胞介素1(interleukin 1,IL-1)受體、NF-κB等信號通路[19-24]。NF-κB介導黏附分子、趨化因子和細胞因子等介質的轉錄。在靜息狀態(tài)下,NF-κB抑制蛋白(inhibitory subunit of NF-κB,IκB)與NF-κB p65結合在細胞漿中調節(jié)細胞的正常生理功能,當癌癥刺激時,IκB激酶復合體磷酸化IκB被蛋白酶降解,NF-κB p65轉運到細胞核與特定的DNA序列結合,抑制細胞凋亡基因Bax、Caspase-3的表達,加速癌細胞增殖[25-28]。但HPC能否下調Traf6/NF-κB信號通路誘導肝癌細胞凋亡的分子機制尚鮮見報道。本研究旨在探討HPC靶向作用于Traf6/NF-κB信號通路誘導肝癌細胞凋亡的效果,為肝細胞肝癌的分子靶向治療提供實驗基礎和新的途徑,亦為開發(fā)食品中的抗腫瘤成分提供實驗依據(jù)。
肝癌細胞株(Huh-7)購于上海康郎科學生物有限公司。
HPC(純度≥99%)(批號:20200418) 杭州綠盛生物技術有限公司;杜氏高糖培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM) 美國Life Technology公司;胎牛血清(fatal bovine serum,F(xiàn)BS)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA) 美國Gbico公司;細胞計數(shù)(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)試劑盒 武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術研究所;Super ECL Plus發(fā)光液 北京普利萊基因科技有限公司;Cas9-Puro慢病毒 廣州源井生物科技有限公司;嘌呤霉素 上海賽默飛世爾科技有限公司;β-actin多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體 武漢恒生科技生物公司;Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3一抗、二抗羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G英國Abcam公司;總RNA提取試劑盒、SYBR green試劑盒日本Takara Bio公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒美國Caltag公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
CO2恒溫培養(yǎng)箱 德國Heraeus公司;熒光實時定量聚合酶鏈式反應儀 澳大利亞Corbett公司;Varioskan LUX多功能酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司;TDL-40B臺式離心機、DYY-12型凝膠電泳儀 北京六一儀器廠;FACSCalibur流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司;凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司。
1.3.1 Huh-7細胞傳代培養(yǎng)
Huh-7細胞培養(yǎng)于含10% FBS、鏈霉素和青霉素各100 U/mL的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,然后棄去培養(yǎng)上清液,用10%磷酸鹽緩沖液潤洗細胞1~2 次,加2 mL 1 mol/L EDTA溶液于培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化1~2 min,待細胞密度達80%進行傳代。
1.3.2 CCK-8檢測HPC處理后Huh-7細胞增殖情況
取一定量的HPC以甲醇為溶劑配制質量濃度分別為0、5、10、20、40、80 μg/mL的系列溶液[29],用DMEM培養(yǎng)基將Huh-7細胞制成細胞懸液并調整細胞濃度為1×109個/L,以每孔100 μL接種于96 孔板中,待細胞貼壁生長到50%~60%時后,加入不同質量濃度的HPC,設10 個平行孔,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)基,每孔加入CCK-8試劑10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后振蕩1 min,在450 nm波長處測定各孔吸光度A。細胞存活率按下式[30]計算。
1.3.3 Huh-7細胞Traf6的轉染
在慢病毒介導下將Traf6重組質粒轉染Huh-7細胞,然后在培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素,對穩(wěn)定轉染的Huh-7細胞株進行篩選,獲得過表達Traf6的Huh-7細胞,并檢測穩(wěn)定轉染的Huh-7細胞中Traf6的表達情況。
1.3.4 實時定量聚合酶鏈反應檢測Huh-7細胞中Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3mRNA表達水平
當Huh-7細胞處于對數(shù)生長期時,以0.5×106個/孔接種于6 孔板中,細胞貼壁生長到50%~60%后,棄去舊培養(yǎng)基,HPC細胞組和HPC+Traf6過表達組加入2 mL 40 μg/mL HPC處理細胞,空白對照組和Traf6過表達組用等體積DMSO處理,在37 ℃、飽和濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按試劑盒說明提取Huh-7細胞總RNA,采用SYBR green試劑盒進行熒光定量檢測,按試劑盒說明操作,并選擇GAPDH作為內參,通過熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性。引物序列見表1。
表1 引物序列Table 1 List of primer sequences used this study
1.3.5 免疫印跡法檢測Huh-7細胞中Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3蛋白表達水平
實驗分組同1.3.4節(jié)。收集HPC處理后的Huh-7細胞和Traf6過表達的Huh-7細胞,用BCA法檢測RIPA裂解液提取的蛋白質量濃度。在提取蛋白液中加入質量分數(shù)6% SDS緩沖液,沸水變性5 min,SDS-PAGE后濕移至聚偏二氟乙烯膜上,37 ℃封閉2 h,依次加入羊抗兔Traf6、NF-κB p65、Bax、Caspase-3抗體和β-actin多克隆抗體,4 ℃過夜,滴加ECL發(fā)光試劑進行檢測,采用Quanlity One軟件掃描各條帶,獲取目的蛋白灰度[31]。
1.3.6 Annexin V-FITC/PI 檢測Huh-7細胞凋亡情況
實驗分組同1.3.4節(jié)。制備Huh-7細胞懸液,濃度為1×106個/L,每孔100 μL接種于6 孔板,培養(yǎng)過夜,細胞貼壁后在HPC細胞組和HPC+Traf6過表達組中加入質量濃度為40 μg/mL HPC 2 mL,空白對照組和Traf6過表達組加入等體積DMSO,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞樣品檢測,按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書利用流式細胞儀上機檢測。
如圖1所示,當HPC質量濃度小于10 μg/mL時對Huh-7細胞的增殖無明顯抑制作用,0、5、10 μg/mL HPC處理組相對存活率分別為100%、98%、96%。而當HPC質量濃度大于20 μg/mL時對Huh-7細胞的增殖有明顯的抑制作用,20、40、80 μg/mL HPC處理組相對存活率分別為84%、75%、62%,且隨HPC質量濃度升高Huh-7細胞的相對存活率顯著降低(P<0.05)。
圖1 HPC對Huh-7細胞增殖的影響(±s,n=6)Fig.1 Effect of HPC on the proliferation of Huh-7 cells (x± s, n = 6)
如圖2所示,實驗中采用質量濃度為40 μg/mL的HPC處理細胞,結果顯示HPC組中Huh-7細胞的相對存活率為73%,顯著低于空白對照組相對存活率(100%)(P<0.05);HPC+Traf6過表達細胞組中Huh-7細胞的相對存活率為82%,顯著高于HPC細胞組相對存活率(73%)(P<0.05)。
圖2 Traf6過表達對HPC抑制Huh-7細胞增殖的影響(±s,n=6)Fig.2 Effect of Traf6 overexpression on inhibitory effect of HPC on the proliferation of Huh-7 cells (x ± s, n = 6)
如圖3所示,HPC處理的Huh-7細胞中Traf6和NF-κB p65mRNA表達水平顯著低于空白對照組(P<0.05),Bax和Caspase-3的mRNA表達水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。HPC+Traf6過表達細胞組中Traf6和NF-κB p65mRNA表達水平顯著低于Traf6過表達細胞組(P<0.05),Bax和Caspase-3的mRNA表達水平顯著高于Traf6過表達細胞組(P<0.05)。
圖3 HPC對Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3 mRNA表達的影響(±s,n=6)Fig.3 Effect of HPC on the mRNA expression of Traf6, NF-κB p65,Bax and Caspase-3 (x± s, n = 6)
如圖4所示,HPC組中Traf6和NF-κB p65蛋白表達水平顯著低于空白對照組(P<0.05),Bax和Caspase-3的蛋白表達水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。HPC+Traf6過表達細胞組中Traf6和NF-κB p65的蛋白表達水平顯著低于Traf6過表達細胞組(P<0.05),Bax和Caspase-3的蛋白表達水平顯著高于Traf6過表達細胞組(P<0.05)。
圖4 HPC對Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3蛋白表達的影響(±s,n=6)Fig.4 Effect of HPC on the protein expression of Traf6, NF-κB p65,Bax and Caspase-3 (x± s, n = 6)
如圖5所示,空白對照組、HPC組、Traf6過表達組和HPC+Traf6過表達組Huh-7細胞的凋亡率分別為29%、48.1%、15.5%和41.7%。HPC組的Huh-7細胞凋亡率顯著高于空白對照組(P<0.05),Traf6過表達組的Huh-7細胞凋亡率顯著低于空白對照組(P<0.05),HPC+Traf6過表達組的Huh-7細胞凋亡率顯著高于Traf6過表達組(P<0.05)。
圖5 HPC對Huh-7細胞凋亡的影響(±s,n=6)Fig.5 Effect of HPC on apoptosis of Huh-7 cells (x ± s, n = 6)
HPC是具有開發(fā)價值的食品和藥物成分[32]。很多流行病學實驗、動物實驗、細胞實驗和臨床研究證實HPC具有廣譜抗腫瘤作用,HPC可通過多條信號通路作用于癌細胞的凋亡,并影響腫瘤血管的形成[33-36]。手術和化療是肝癌的常用臨床治療手段,但患者對其耐受性差[37-39]。因此,探索毒副作用小的天然植物藥對肝癌的治療和預后十分重要[40]。本研究從細胞水平和基因水平初步證實HPC具有靶向抗肝癌細胞增殖的作用,期望為研究食品成分作為開發(fā)藥物方面提供理論參考。
NF-κB信號通路可調節(jié)多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,癌癥發(fā)生時往往Traf6蛋白表達量會增加,肝癌細胞中過表達的Traf6蛋白可以上調NF-κB信號通路,使其細胞質中的IκB磷酸化并被降解,釋放的NF-κB p65轉運到細胞核與靶點結合,能使促進細胞凋亡的Bax和Caspase-3蛋白表達量降低,促進肝癌細胞增殖并抑制癌細胞凋亡[41-42]。本實驗探討了不同質量濃度HPC對Huh-7細胞增殖的影響,結果顯示當HPC質量濃度大于20 μg/mL時對Huh-7細胞的增殖有明顯的抑制作用,且該作用存在劑量依賴性,與孫思明等[43]研究發(fā)現(xiàn)HPC抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖具有劑量依賴性結果一致。利用40 μg/mL的HPC處理Huh-7細胞,結果表明HPC可以通過下調Traf6的表達起到抑制肝癌細胞的作用。Roy等[44]的研究證明,葡萄籽原花青素通過p53、Bax和Caspase 3誘導細胞凋亡,本研究結果顯示,HPC處理的Huh-7細胞中Traf6和NF-κB p65mRNA表達水平下降,同時Traf6和NF-κB p65蛋白表達水平亦下降,HPC可以通過NF-κB信號通路調控p65的基因和蛋白表達,誘導肝癌細胞凋亡。Jeelani等[45]研究表明Caspase-3蛋白與癌細胞凋亡有關,本研究結果表明HPC可通過下調Traf6/NF-κB信號通路、活化Caspase-3從而抑制Huh-7細胞增殖,同時促進Huh-7細胞凋亡。
綜上所述,HPC可以下調Traf6/NF-κB信號通路、抑制肝癌細胞增殖和促進肝癌細胞凋亡,但本實驗沒有研究HPC是否通過阻止Huh-7細胞周期來抑制其增殖并促進其細胞凋亡,后續(xù)尚需進一步研究。同時,實驗質量濃度40 μg/mL HPC真正進入機體后,是否會被機體免疫系統(tǒng)或內分泌系統(tǒng)弱化,能否在機體內發(fā)揮抗腫瘤作用,也需進一步的臨床試驗來驗證。
本研究結果初步表明,NF-κB信號通路是HPC作用的潛在靶點,HPC通過下調Traf6/NF-κB信號通路,抑制Traf6和NF-κB p65的表達,促進Bax和Caspase-3的表達,誘導Huh-7肝癌細胞凋亡,HPC為食物中的植物活性成分,可經(jīng)小腸黏膜細胞直接吸收進入血液循環(huán),且無毒副作用,值得進一步開發(fā)利用。