黑米花色苷矢車(chē)菊素-3-O-β-葡萄糖苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人THP-1單核細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用

牙甫禮，李瑋琪，馬永潔，周昕榆，伍春婷，黃新惠

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，云南 大理 671000）

近年來(lái)，心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）已經(jīng)成為威脅我國(guó)居民健康的主要問(wèn)題和突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題，以動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）為典型特征的動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)和功能改變是心肌梗死、心力衰竭、腦卒中等CVD事件發(fā)生的共同病理生理學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。AS的發(fā)生發(fā)展涉及錯(cuò)綜復(fù)雜的病理生理學(xué)變化，其中，慢性炎性學(xué)說(shuō)一直受到高度認(rèn)可與關(guān)注，被普遍認(rèn)為是貫穿于AS各個(gè)時(shí)期的重要病理變化之一[3]。研究表明，由革蘭氏陰性細(xì)菌來(lái)源的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是參與AS過(guò)程中血管炎癥的重要成分之一，是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[4]。LPS可通過(guò)識(shí)別單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞表面的Toll-樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞多種炎癥因子的釋放，并參與AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[5]。研究證實(shí)，在LPS的作用下，單核細(xì)胞被異常激活，并黏附到損傷的血管內(nèi)皮下，浸潤(rùn)血管壁，分化成巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞。同時(shí)活化的單核細(xì)胞分泌的炎癥因子如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等以及趨化因子可加速AS進(jìn)展[6]。因此，抑制單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是防治AS發(fā)生發(fā)展的重要靶點(diǎn)之一[7]。

有研究證實(shí)，營(yíng)養(yǎng)干預(yù)是預(yù)防AS和心血管疾病的重要途徑之一[8-9]?；ㄉ帐且环N多酚類黃酮化合物，富含于各種深色的蔬菜、水果及谷類中，如紫甘藍(lán)、紫番薯、藍(lán)莓、桑葚、葡萄、黑米和紫玉米等[10]。矢車(chē)菊素-3-O-β-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy-3-g）是花色苷中重要的單體物質(zhì)，具有多種生物學(xué)活性[11]。流行病學(xué)、臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，花色苷Cy-3-g可通過(guò)抗炎、抗氧化以及改善糖脂代謝紊亂等機(jī)制發(fā)揮抗AS和保護(hù)心血管疾病的作用[12-13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Cy-3-g參與調(diào)控血小板功能，進(jìn)而發(fā)揮抗AS的作用。例如，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Cy-3-g可抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板聚集、活化和血栓形成[14]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，膳食補(bǔ)充桑葚來(lái)源的Cy-3-g可抑制高脂血癥小鼠血小板高反應(yīng)性[15]；人群干預(yù)研究提示膳食補(bǔ)充Cy-3-g能夠顯著抑制高脂血癥患者血小板顆粒物的釋放以及趨化因子的釋放[13,16]。此外，體外研究也表明，花色苷單體如錦葵色素和花葵素-3-葡萄糖苷等可抑制單核細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[17-19]。但是黑米來(lái)源的花色苷單體Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞損傷作用尚不清楚，本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討黑米花色苷Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1炎癥損傷的影響及其可能的分子機(jī)制，從膳食營(yíng)養(yǎng)或功能食品開(kāi)發(fā)角度為黑米Cy-3-g防治AS和CVDs提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用黑米（Oryza sativaL.indica）購(gòu)自本地超市，產(chǎn)地為東北。

人THP-1單核細(xì)胞 美國(guó)ATCC公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；雙抗（青霉素、鏈霉素） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；人IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 英國(guó)Abcam公司；LPS 北京索萊寶科技有限公司；Cy-3-g標(biāo)準(zhǔn)品 挪威Polyphenol AS公司；一抗TLR4、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p65、NF-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB）α、p-NF-κB p65（Ser536）、p-IκBα（Ser32）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）以及二抗羊抗兔 南京巴傲得（BioWorld）生物科技有限公司；NF-κB p65的抑制劑Bay11-7082 美國(guó)Selleck Chemical公司；mirVanaTMmiRNA分離試劑盒 美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H1650R低溫高速離心機(jī)、L500低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；BCD-618WGHSSEDBL低溫冰箱 青島海爾有限公司；CLARIOstar Plus多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)Bmg Labtech公司。

1.3 方法

1.3.1 黑米花色苷Cy-3-g的提取與純化

黑米花色苷Cy-3-g的提取與純化方法參照前期研究[20-21]。黑米糊粉層用磨粒脫殼機(jī)去除，糠皮用含0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）鹽酸的60%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液浸泡5 h（料液比為1∶10），共浸提3 次，然后將浸提液進(jìn)行抽濾，濾液于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)乙醇為止。將濃縮液與石油醚充分混勻并靜置5 h后進(jìn)行脂質(zhì)萃取，收集下層花色苷液體，收集液通過(guò)Amberlite XAD-7HP離子交換大孔吸附柱，吸附后用0.1%鹽酸清洗和80%乙醇溶液洗脫，收集深色洗脫液。收集到的洗脫液在40 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到花色苷濃縮液，凍于-80 ℃冰箱，冷凍干燥后，得到花色苷粗提物粉末。

取0.6 g花色苷粗提物粉末溶解到25 mL體積分?jǐn)?shù)5%鹽酸酸化甲醇溶液中，制備花色苷濃縮液，然后進(jìn)行中壓制備液相色譜系統(tǒng)（加裝有反相C18色譜柱）分析。以體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸（A液）和體積分?jǐn)?shù)99.5%甲醇（B液）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。線性梯度為6% B（0～10 min），20%～33% B（11～30 min），33%～40% B（31～90 min），40%～45% B（91～110 min），45%～100% B（110～115 min），100% B（115～135 min），50% B（135～150 min），流速設(shè)定為15 mL/min。最后用紫外檢測(cè)器（254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，280 nm為收集波長(zhǎng)）檢測(cè)洗出液，根據(jù)所得色譜圖收集黑米中花色苷Cy-3-g組分，并凍存于-20 ℃中備用[20]。

1.3.2 黑米花色苷Cy-3-g純度分析

采用高液相色譜二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行花色苷Cy-3-g純度的鑒定，具體方法參照前期研究[21]。將提取所得的花色苷Cy-3-g凍干粉重懸于酸性甲醇（V（1 mol/L HCl）∶V（甲醇）＝85∶15）中，負(fù)載Zorbax SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）。流動(dòng)相由洗脫液A（體積分?jǐn)?shù)10%甲酸水溶液）和洗脫液B（甲醇）組成，梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，2% B；1～5 min，10% B；5～20 min，10%～60% B。柱溫為25 ℃，流速為0.2 mL/min，光電二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定波長(zhǎng)為520 nm。將樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)分析，Cy-3-g的純度高于96.5%[21]。

1.3.3 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞用RPMI1640細(xì)胞完全培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗）于95%相對(duì)濕度、5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。于37 ℃、1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄去舊的培養(yǎng)液，用配好的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，用終質(zhì)量濃度為0.10、0.25 μg/mL和0.50 μg/mL的Cy-3-g分別與細(xì)胞共孵育4 h（溶劑對(duì)照組細(xì)胞中加入RPMI1640完全培養(yǎng)基），之后加入質(zhì)量濃度50 ng/mL LPS溶液與細(xì)胞繼續(xù)孵育48 h，收集細(xì)胞和上清液檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.3.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性

細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將不同質(zhì)量濃度Cy-3-g加入細(xì)胞懸液中，按5×104個(gè)/mL的密度接種于96 孔板中，放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4 h后，加入或不加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后將細(xì)胞于37 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液，每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide，MTT）溶液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后加入100 μL二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO），充分振蕩溶解后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處各組吸光度，用吸光度表征細(xì)胞毒性。陰性對(duì)照組中不加Cy-3-g和LPS處理，其他處理?xiàng)l件相同。

1.3.5 THP-1細(xì)胞釋放的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)Cy-3-g和LPS處理后，于37 ℃、1 000 r/min離心5 min，收集上清液，采用ELISA試劑盒對(duì)上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在探討NF-κB信號(hào)通路在Cy-3-g調(diào)控LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥損傷的作用時(shí)，在加入或不加入質(zhì)量濃度為10 μmol/L NF-κB特異性阻斷劑Bay11-7082的條件下，用質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL Cy-3-g與細(xì)胞共孵育4 h，之后加入質(zhì)量濃度50 ng/mL LPS溶液與細(xì)胞繼續(xù)孵育48 h，采用ELISA試劑盒對(duì)上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 THP-1細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TLR4和NF-κB p65mRNA表達(dá)水平測(cè)定

細(xì)胞經(jīng)Cy-3-g和LPS處理后，于37 ℃、1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）潤(rùn)洗3 次后，用mirVanaTMmiRNA分離試劑盒進(jìn)行總RNA提取。用1 μg RNA來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT方法計(jì)算，以β-actin作為管家基因。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 定量PCR所用引物序列Table 1 Primers used for quantitative PCR

1.3.7 Western blot蛋白免疫印跡分析

細(xì)胞經(jīng)Cy-3-g和LPS處理后，離心，收集細(xì)胞，用PBS潤(rùn)洗3 次后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，常規(guī)提取蛋白，經(jīng)測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度后，對(duì)樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜后，用5%的脫脂奶粉溶液封閉1.5 h，用含體積分?jǐn)?shù)1%吐溫-20的Tris-鹽緩沖液（Tris buffered solution with Tween-20，TBST）洗膜3 次后，于4 ℃避光孵育一抗TLR4、NF-κB p65、IκBα、p-NF-κB p65、p-IκBα（抗體與TBST體積比為1∶1 000）和GAPDH（抗體與TBST體積比為1∶10 000）過(guò)夜，洗膜后室溫避光孵育二抗羊抗兔（抗體與TBST體積比為1∶20 000）1.5 h，最后用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行曝光，以檢測(cè)蛋白水平。條帶灰度用Quantity One軟件進(jìn)行分析[22-23]，將目的蛋白的灰度與內(nèi)參蛋白的灰度相比，并將陰性對(duì)照組蛋白比值設(shè)定為1進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，每次實(shí)驗(yàn)的樣本均來(lái)自獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用單因素方差分析，差異顯著后采用Tukey法進(jìn)行組間兩兩比較，雙側(cè)P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米花色苷Cy-3-g對(duì)THP-1細(xì)胞毒性的影響

通過(guò)采用MTT比色法檢測(cè)黑米花色苷Cy-3-g對(duì)THP-1細(xì)胞毒性的影響。如圖1所示，與陰性對(duì)照組相比，Cy-3-g在質(zhì)量濃度0.10～10.00 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)THP-1細(xì)胞活性無(wú)顯著影響（P＞0.05）；此外，在質(zhì)量濃度50 ng/mL LPS的作用下，質(zhì)量濃度0.10～0.50 μg/mL范圍的Cy-3-g對(duì)THP-1細(xì)胞活性也無(wú)顯著影響（P＞0.05）。結(jié)合前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)和其他文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果，最終選擇質(zhì)量濃度0.10、0.25 μg/mL和0.50 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 黑米花色苷Cy-3-g對(duì)THP-1細(xì)胞毒性的影響Fig.1 Cytotoxic effect of black rice-derived Cy-3-g on THP-1 cells

2.2 黑米花色苷Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量和釋放水平的影響

如圖2所示，與陰性對(duì)照組相比，LPS可高度顯著促進(jìn)THP-1細(xì)胞IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α炎癥因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.001）；與溶劑對(duì)照組相比，Cy-3-g在質(zhì)量濃度0.10～0.50 μg/mL范圍內(nèi)均可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），質(zhì)量濃度0.25 μg/mL和0.50 μg/mL的Cy-3-g可顯著降低LPS誘導(dǎo)的IL-6和TNF-α炎癥因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05、P＜0.001），但是質(zhì)量濃度0.10 μg/mL Cy-3-g處理后則無(wú)顯著抑制作用（P＞0.05）。與溶劑對(duì)照組相比，各質(zhì)量濃度的Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-8mRNA相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著降低作用（P＞0.05）。此外，質(zhì)量濃度0.25、0.50 μg/mL的Cy-3-g較溶劑對(duì)照組，可極顯著或高度顯著提高IL-10mRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.01、P＜0.001）。如圖3所示，Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞上述炎癥因子釋放水平的影響與其對(duì)相應(yīng)炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響一致。

圖2 黑米花色苷Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of black rice-derived Cy-3-g on the mRNA expression levels of inflammatory factors in THP-1 cells induced by LPS

圖3 黑米花色苷Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子釋放水平的影響Fig.3 Effect of black rice-derived Cy-3-g on the release levels of inflammatory factors in THP-1 cells induced by LPS

2.3 黑米花色苷Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

如圖4A、D所示，與陰性對(duì)照組相比，LPS可高度顯著或顯著上調(diào)THP-1細(xì)胞TLR-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白相對(duì)表達(dá)量（P＜0.001、P＜0.05）；與溶劑對(duì)照組相比，TLR-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白相對(duì)表達(dá)量可被質(zhì)量濃度0.25、0.50 μg/mL Cy-3-g顯著下調(diào)（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.05）。此外，如圖4C、E、F所示，與陰性對(duì)照組相比，LPS可極顯著抑制IκBα的表達(dá)（P＜0.01），并促進(jìn)其磷酸化，質(zhì)量濃度0.25、0.50 μg/mL Cy-3-g可顯著逆轉(zhuǎn)LPS的效應(yīng)（P＜0.05、P＜0.01），說(shuō)明Cy-3-g可抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα降解和活化。同時(shí)，與陰性對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白相對(duì)表達(dá)量可被質(zhì)量濃度0.25、0.50 μg/mL Cy-3-g顯著下調(diào)（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.05）（圖4B、G），質(zhì)量濃度0.25、0.50 μg/mL Cy-3-g可顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65的磷酸化水平（P＜0.01、P＜0.001）（圖4H）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cy-3-g可抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化。

圖4 黑米花色苷Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響Fig.4 Effect of black rice-derived Cy-3-g on TLR4/NF-κB signaling pathway in LPS-induced THP-1 cells

2.4 NF-κB信號(hào)通路在黑米花色苷Cy-3-g調(diào)控LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥損傷中的作用

為了探討NF-κB信號(hào)通路在Cy-3-g調(diào)控LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥損傷中的作用，采用NF-κB的特異性阻斷劑Bay11-7082進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果如圖5所示，與溶劑對(duì)照組相比，10 μmol/L Bay11-7082可高度顯著降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α釋放水平（P＜0.001），但是Bay11-7082與Cy-3-g聯(lián)合使用時(shí)無(wú)協(xié)同效果（Bay11-7082組與Cy-3-g+Bay11-7082組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05））。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥損傷保護(hù)作用的機(jī)制可能是下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路。

圖5 NF-κB信號(hào)通路在黑米花色苷Cy-3-g調(diào)控LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥損傷中的作用Fig.5 Role of NF-κB signaling pathway in mediating LPS-induced inflammatory injury by black rice-derived Cy-3-g

3 討 論

AS是心血管疾病的重要病理變化之一，也是導(dǎo)致心血管疾病血栓形成的病理基礎(chǔ)。細(xì)菌來(lái)源的LPS所介導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用[5]。營(yíng)養(yǎng)膳食干預(yù)是防治AS形成的重要措施之一[8-9]。本研究首次證實(shí)黑米花色苷Cy-3-g可抑制LPS誘導(dǎo)的人THP-1細(xì)胞炎癥損傷，從膳食營(yíng)養(yǎng)或功能食品開(kāi)發(fā)角度為黑米Cy-3-g防治AS和心血管疾病提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

血管慢性炎癥是誘導(dǎo)AS發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在細(xì)菌感染如膿毒血癥的狀態(tài)下，主要由革蘭氏陰性細(xì)菌來(lái)源的LPS介導(dǎo)的血管慢性炎癥可誘導(dǎo)和加速AS的形成和發(fā)展[5]。在AS病變過(guò)程中，單核細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的主要來(lái)源，單核-巨噬細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[24]。LPS可識(shí)別單核細(xì)胞表面的TLR4受體，進(jìn)而介導(dǎo)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路，最終激活單核細(xì)胞，并促進(jìn)其分化為巨噬細(xì)胞，同時(shí)伴隨著炎癥因子的釋放[6]。研究表明，NF-κB信號(hào)通路在LPS-TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用，LPS通過(guò)TLR4可激活下游的κB抑制因子激酶α/β（inhibitor of κB kinase α/β，IKKα/β），進(jìn)一步促進(jìn)IκBα在Ser32發(fā)生磷酸化，繼而發(fā)生泛素化并逐漸被降解，使得IκBα與NF-κB p65的二聚體解聚，促進(jìn)NF-κB p65發(fā)生活化，同時(shí)其在Ser536發(fā)生磷酸化后，進(jìn)入細(xì)胞核，參與多種炎癥因子如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等mRNA轉(zhuǎn)錄，這些炎癥因子最終從胞內(nèi)釋放到胞外，參與血管的炎癥反應(yīng)[25]。這些炎癥因子進(jìn)一步促使單核細(xì)胞黏附到損傷的血管內(nèi)皮處，并向內(nèi)膜下遷移轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞，加劇AS的發(fā)生發(fā)展[24]。此外，LPS可直接促使M1型巨噬細(xì)胞釋放IL-1β和IL-18等多種炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)展[26]。同時(shí)，研究證實(shí)，LPS除了可以直接激活TLR4/NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路外，還參與調(diào)控TLR4和NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)。LPS促進(jìn)TLR4基因表達(dá)的機(jī)制可能是TLR4結(jié)合并識(shí)別LPS后，經(jīng)髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴途徑和MyD88非依賴途徑（主要由Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白介導(dǎo)）激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和NF-κB信號(hào)通路，最終激活特異性蛋白（specific protein 1，SP-1），活化的Sp-1結(jié)合到TLR4基因的啟動(dòng)子上并促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄活化[27]。LPS通過(guò)TLR4介導(dǎo)多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly(ADP-ribose) polymerase 1，PARP-1）發(fā)生活化，活化的PARP-1能夠催化DNA結(jié)合蛋白發(fā)生聚二磷酸腺苷核糖化，并通過(guò)其氨基末端的DNA結(jié)合區(qū)域與NF-κB p65基因的特定序列啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB p65基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[28-29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，黑米花色苷Cy-3-g可抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)和釋放，這與已報(bào)道的花色苷其他單體如錦葵色素和花葵素-3-葡萄糖苷等調(diào)控THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)結(jié)果一致[17-19]。IL-10對(duì)AS具有保護(hù)作用[30]，本研究發(fā)現(xiàn)黑米花色苷Cy-3-g可顯著促進(jìn)IL-10的mRNA表達(dá)和釋放。此外，本研究結(jié)果還表明黑米花色苷Cy-3-g調(diào)控LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥損傷的機(jī)制可能主要是抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，因?yàn)镹F-κB的特異性阻斷劑Bay11-7082與Cy-3-g聯(lián)用時(shí)，兩者沒(méi)有協(xié)同抑制作用，說(shuō)明Cy-3-g與Bay11-7082作用的靶蛋白（NF-κB）一致，進(jìn)而表明Cy-3-g主要通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗炎作用。但是不同質(zhì)量濃度Cy-3-g對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-8mRNA表達(dá)和釋放無(wú)顯著影響，說(shuō)明Cy-3-g對(duì)不同炎癥因子的調(diào)控機(jī)制可能不一樣，這需要在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。此外，有研究表明，LPS通過(guò)TLR4還可激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和腺苷酸活化蛋白激酶等信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[31-32]。因此，黑米花色苷Cy-3-g發(fā)揮抗炎作用是否還參與其他信號(hào)通路的調(diào)控，仍需要進(jìn)一步證實(shí)。

花色苷屬于植物化學(xué)物質(zhì)中的多酚類黃酮化合物，在自然界中廣泛存在于各種植物中，包括各種深色的蔬菜、水果及谷類。研究表明，膳食補(bǔ)充花色苷具有防治心血管疾病的作用[12-13]。然而，研究證明，膳食攝入Cy-3-g后，其原型在體內(nèi)吸收利用率很低（通常低于1%）[33]。以50 mg/kgmb給予小鼠補(bǔ)充Cy-3-g，其血液中Cy-3-g的最大濃度約為0.4 μmol/L[34]。本研究采用的黑米花色苷Cy-3-g質(zhì)量濃度范圍為0.10～0.50 μg/mL，相當(dāng)于0.2～1.0 μmol/L濃度，能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的Cy-3-g質(zhì)量濃度大多在0.25～0.50 μg/mL（0.5～1.0 μmol/L）之間，接近生理劑量，并且與其他報(bào)道的體外研究中所使用的花色苷單體濃度相一致[17]。之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，膳食補(bǔ)充黑米花色苷Cy-3-g可抑制ApoE-/-小鼠血小板趨化因子及白細(xì)胞表面受體的表達(dá)[20]。由于膳食補(bǔ)充花色苷后，血液中的花色苷原型濃度很低，大多數(shù)研究提示膳食補(bǔ)充Cy-3-g生物學(xué)功效的發(fā)揮可能大部分歸因于其腸道代謝物，如原兒茶酚酸等[33,35]。雖然本研究提示黑米花色苷Cy-3-g在體外實(shí)驗(yàn)中可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥損傷，但是其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)效應(yīng)尚不清楚，因此需要今后在膿毒血癥模型的小鼠實(shí)驗(yàn)中探討膳食補(bǔ)充Cy-3-g對(duì)單核細(xì)胞功能和炎癥的調(diào)控效應(yīng)。另外，研究表明Cy-3-g具有多種生物學(xué)功效，其作用特點(diǎn)存在多靶點(diǎn)效應(yīng)，目前尚缺乏Cy-3-g靶點(diǎn)篩選的研究工作，本研究結(jié)果表明，Cy-3-g可能主要通過(guò)下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)抗炎作用，但是其確切的作用靶點(diǎn)需要今后結(jié)合基因芯片和蛋白組學(xué)等技術(shù)進(jìn)行篩選?？傊?，本研究可從營(yíng)養(yǎng)膳食或功能食品開(kāi)發(fā)方面為黑米花色苷Cy-3-g防治心血管疾病提供一定的理論依據(jù)和應(yīng)用參考。