田茂秀，高雅莉，岑小妹，田茂靖，黃國旅，莫子洪，蘭文明，吳麗娜

(1.廣西壯族自治區(qū)國有七坡林場，廣西 南寧 530000；2.廣西壯族自治區(qū)國有欽廉林場，廣西 欽州 535000)

1 引言

馬尾松作為我國主要造林樹種，對于馬尾松林的多目標經(jīng)營是當前林業(yè)可持續(xù)發(fā)展及林分質(zhì)量健康發(fā)展的關(guān)鍵。馬尾松成熟林具有豐富的林下植被以及一定的隱蔽度，馬尾松林下套種中草藥是實現(xiàn)其多目標經(jīng)營的重要途徑[1，2]。五指毛桃屬于桑科榕屬植物粗葉榕的干燥根，又被稱為南芪或五爪龍，是嶺南少數(shù)民族地區(qū)常見的一種民間用藥，為藥食同源佳品，具有“廣東人參”的美譽。五指毛條性平味甘，具有祛痰平喘、健脾補氣、舒筋利濕的效用，常用于肺癆咳嗽、無力少食、浮腫脾虛、肝膽濕熱等病癥[3]?，F(xiàn)今，我國五指毛桃人工種植尚未形成規(guī)模，五指毛桃的主要來源仍是野生采集。在五指毛桃市場需求量日益增長的背景下，野生五指毛桃受到掠奪式挖掘，致使野生資源出現(xiàn)枯竭，對自然生態(tài)環(huán)境帶來極大壓力。從生態(tài)角度來看，五指毛桃是小喬木，多生長在海拔500～1000 m的疏林、灌叢山谷、林源等溫暖濕潤的地方，具有一定的耐陰性。

林—藥種植模式要實現(xiàn)對林地資源的充分利用，通過多層次立體結(jié)構(gòu)提升空間利用率和光能利用率，改良土壤肥力及理化性質(zhì)，從而實現(xiàn)對生態(tài)環(huán)境的改善，構(gòu)成良性循環(huán)[4，5]。李娟[6]針對橡膠林下終止五指毛桃進行研究，通過科學(xué)是非的手段，不僅使五指毛桃得到良好生長，且有利于橡膠樹膠乳的增產(chǎn)。傅志真[7]針對馬尾松林下種植千年桐的存活率及幼苗生長指標進行分析，郁閉度在0.3時，苗木粗壯，有利于苗木的后續(xù)生長，可采用挖穴結(jié)合施肥的技術(shù)促進千年桐的生長。而倪樂[8]針對不同樹種套種模式下雷公藤甲素含量的動態(tài)變化、林地土壤養(yǎng)分分析等，得到厚樸林下套種雷公藤可使雷公藤葉和根中的雷公藤素得到增加，并提升林地土壤中的總氮含量。而目前有關(guān)馬尾松下種植五指毛桃的研究較少，馬尾松能夠為林下植被提供良好的蔭蔽環(huán)境，適宜五指毛桃的林下種植[9]。由此，對于馬尾松林下種植五指毛桃展開研究，可對不同年限五指毛桃的生長性狀和主要活性成分含量進行綜合分析，為馬尾松林下五指毛桃的規(guī)模種植提供最佳采收期指導(dǎo)。

2 材料與方法

2.1 試驗地概況

試驗地選擇為七彩七坡林下經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)示范區(qū)馬尾松天然林。研究地所在區(qū)域為亞熱帶季風(fēng)區(qū)，地理坐標為108°12′E，22°42′N，海拔100～300 m，降雨充足，日常充分，年均降雨量1472.3 mm，平均氣溫21.8 ℃。雨季主要集中在4～9月份，無霜期較長。試驗地是丘陵地貌，坡度25°，土層較厚，土壤多為紅壤，具有豐富的腐殖質(zhì)含量，肥力較好。

2.2 試驗材料

2.2.1 供試種苗

供試的五指毛桃種苗采購于廣西南藥康園投資有限責(zé)任公司。

2.2.2 儀器與設(shè)備

試驗主要用到的儀器與設(shè)備如下：昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-500DE超聲波清洗器和e2695高效液相色譜；waters Symmetry C18色譜柱；上海力辰邦西儀器科技有限公司生產(chǎn)循環(huán)水式多用真空泵，型號為SHZ-DⅢ；Milli-Q超純水制備儀，由美國Millipore公司生產(chǎn)；Basis Hei-VAP HL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，由德國海道爾夫公司生產(chǎn)[10～12]。

2.2.3 儀器與設(shè)備

試驗所用到的主要試劑包括：99.37%標準佛手柑內(nèi)酯，由馬斯特生物科技有限公司提供；99.6%標準品補骨酯素，由中國藥品生物制品鑒定所提供；水為超純水。

2.3 試驗設(shè)計

于2018～2021年每年3月份在試驗基地中劃區(qū)種植五指毛桃，以移栽時的小苗作為CK。采用的種植密度為60 cm×60 cm，離松2 m，開穴規(guī)格為15 cm×25 cm，并將2 kg充分腐熟的有機肥與細土混勻后作為基肥在穴內(nèi)施用。移栽過程要保證移栽地的生長環(huán)境、種植和管理方法均相同[13]。在2022年2月記錄五指毛桃生長情況，對其中佛手柑內(nèi)酯與補骨酯素的含量進行測定。

2.4 指標及方法

2.4.1 植物學(xué)性狀測定

各生長年限的五指毛桃選擇10株作為樣品進行測定，保證樣品的大小均勻、根莖葉齊備[14]。對于馬尾松林下種植五指毛桃植物學(xué)性狀的測定主要包括：株高、根長、基徑、最大根徑、側(cè)根數(shù)、地上部與地下部鮮(干)重等。地上部與地下部鮮(干)重的測定方法如下：將五指毛桃鮮樣放置在105 ℃的烘箱中進行30 min的殺青處理，后調(diào)整溫度至55 ℃烘干至恒重后進行稱重[15，16]。取測量平均值進行數(shù)據(jù)分析。

2.4.2 化學(xué)成分含量測定

將經(jīng)過烘干處理的五指毛桃樣品過40目篩，檢測其中的佛手柑內(nèi)酯及補骨酯素含量。

(1)標準品溶液的制備。稱取3.7 mg的佛手柑內(nèi)酯標準品與17.75 mg的補骨酯素標準品，在其中加入甲醇，利用超聲處理使其溶解，分別制備成1.775 mg/mL的補骨酯素標準品以及0.37 mg/mL的佛手柑內(nèi)酯標準品。

(2)樣品溶液的制備。將處理好的五指毛桃樣品粉末稱取出0.5 g，將其與10 mL甲醇共同放入50 mL的錐形瓶中，經(jīng)過30 min后的超聲提取，再定容至10 mL，利用0.45 μm的濾膜進行過濾操作。

(3)檢測波長的確定。將制備好的兩種標準品溶液經(jīng)過紫外全波長掃描，將最大吸收峰作為試驗檢測波長[17]。

(4)色譜條件。Waters Symmetry C18色譜柱為4.6 mm×250 mm，5 μm的規(guī)格；流動相為60∶40的甲醇—水；柱溫35 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。

(5)繪制標準曲線。用流動相溶液稀釋佛手柑內(nèi)酯和補骨酯素標準品溶液，分別制備出1.775、3.55、7.1、14.2、28.4與56.8 mg/L的梯度溶液，在上述色譜條件下進行測定。繪制標準曲線，橫縱坐標分別為標準品溶液濃度及峰面積[18]。

(6)檢驗穩(wěn)定性。完成樣品的制備后，分別在0、1、2、4、8、12 h取樣進行穩(wěn)定性檢驗。

(7)驗證試驗用檢測方法。稱取濃度相同的標準品溶液進行重復(fù)的5此檢測，保證檢測方法具有良好的精確程度。之后對同批次的樣品溶液進行稱取，制成待測樣品，測定其中主要活性成分，以此對檢測方法的重復(fù)性進行檢驗。最后，同樣稱取同批次的5份樣品，在其中加入0.1875 mg/mL的佛手柑內(nèi)酯標準品及0.8875 mg/mL的補骨酯素標準品各1 mL，制備樣品溶液，對佛手柑內(nèi)酯及補骨酯素的含量進行測定，計算加標回收率。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品中五指毛桃藥用活性成分的測定方法確定

試驗結(jié)果如圖1顯示，佛手柑內(nèi)酯在222 nm處達到較強吸收，補骨酯素在245和222 nm處達到較強吸收，選擇222 nm作為試驗檢測波長。在此波長處對2種標準品分別進行25.556 min和16.705 min的保留，而在樣品中二者的保留時間分別為25.353 min和16.566 min，確保具有良好的分離度。采用外標法對樣品中2種活性成分含量進行計算，繪制標準曲線。結(jié)果顯示，制備0～12 h樣品中佛手柑內(nèi)酯與補骨酯素的峰面積相對標準偏差分別為0.96%和0.85%，證明樣品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。同時，對檢測方法的重復(fù)性和精密程度驗證結(jié)果為，試驗檢測的兩種五指毛桃活性成分的峰面積RSD均比1.5%小，證明檢測方法在重復(fù)性和精密程度方面經(jīng)得起檢驗。

圖1 五指毛桃中佛手柑內(nèi)酯與補骨酯素高效液相色譜結(jié)果

3.2 馬尾松林下種植五指毛桃不同生長年限下的植物學(xué)性狀比較

馬尾松林下種植五指毛桃不同生長年限下植物學(xué)性狀情況如表1所示。

表1 不同生長年限下五指毛桃植物學(xué)性狀(平均值±標準差)

表1結(jié)果顯示，在相同的生態(tài)環(huán)境下，生長年限的增長會影響五指毛桃的植物學(xué)性狀。

不同生長年限下五指毛桃在株高方面表現(xiàn)出明顯的差異，2年生五指毛桃的株高與1年生相比增加有217.19%，3年生比2年生增長41.79%，4年生比3年生增長3.60%。能夠看出，五指毛桃在移栽后的1～2年內(nèi)株高增加最為迅速，屬于速生階段，其次為3年生，4年生的株高長勢最為緩慢。

不同生長年限五指毛桃的基徑差異顯著。2年生比1年生增粗77.34%，3年生比2年生增粗36.12%，4年生比3年生增粗8.41%。能夠看出，2年生和3年生基徑增粗率十分顯著，4年生的差異有所減少，證明增粗速度逐漸放緩。

不同生長年限五指毛桃的根長差異顯著，2年生比1年生增長229.42%，3年生比2年生增長11.36%，4年生比3年生增長7.67%。能夠看出，2年生五指毛桃側(cè)根增長速度最快，之后是3年生，4年生最后。根長的生長動態(tài)與株高相似，同樣能夠說明移栽后1～2年是五指毛桃的速生期。

不同生長年限五指毛桃的最大根莖差異顯著，2年生比1年生增粗108.96%，3年生比2年生增粗51.43%，4年生比3年生增粗24.06%。可見，在試驗的幾個生長年限中，2年生與3年生的基徑增粗最明顯，而4年生的差異相對不明顯。

而側(cè)根數(shù)在試驗結(jié)果中并未表現(xiàn)出顯著性差異，故對此不分析。

3.3 馬尾松林下種植五指毛桃不同生長年限下的生物量變化動態(tài)

馬尾松林下種植五指毛桃不同生長年限下的生物量變化動態(tài)如表2所示。

表2 不同生長年限下五指毛桃生物量變化動態(tài) g/株

由表2可知，不同生長年限五指毛桃的鮮重和干重均表現(xiàn)出顯著差異，呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系。1～4年生五指毛桃平均各株鮮生物總量分別為781.33、2520.54、3567.9、3989.17，平均各株干生物總量分別為245.89、1047.38、1565.78、2020.96。同時從總生物量的增長上能夠看出五指毛桃的生物量會隨著生長年限的增長而有增加，2年生增長率最大，為325.74%；其次為3年生增長率為49.50%；最后為4年生29.13%，可以發(fā)現(xiàn)五指毛桃的生物量增長速率呈現(xiàn)為逐漸降低的趨勢。

五指毛桃的藥用主要以根莖為主，地下部分是主要的收獲目標，根莖作為五指毛桃儲存光合產(chǎn)物的主要器官，根部生物量的多少決定著五指毛桃的產(chǎn)量[19]。因1年生五指毛桃屬于幼苗，地上部的生物量較少，在光合作用上相對較弱，對其生長速率有所限制，從而導(dǎo)致長勢緩慢。而2年生五指毛桃進入速生期，能夠大量積累光合產(chǎn)物，生物量迅速增加，具有最大的增長量，而在之后則會隨著生長年限的增加而逐漸降低。

3.4 不同生長年限對五指毛桃活性成分含量的影響

從佛手柑內(nèi)酯和補骨酯素兩種活性成分來看，生長年限會對五指毛桃中的活性成分具有差異影響，這說明生長年限會直接影響五指毛桃的收獲質(zhì)量。測定結(jié)果如表3所示。

表3 不同生長年限下五指毛桃佛手柑內(nèi)酯和 補骨酯素的含量比較 mh/g

由表3的結(jié)果不難看出，在同一生長年限下，五指毛桃中佛手柑內(nèi)酯和補骨酯素相比，后者含量要高于前者。3年生五指毛桃中佛手柑內(nèi)酯和補骨酯素的含量最高。依照由高到低的順序排列，佛手柑內(nèi)酯含量：1年生>3年生>4年生>2年生；補骨酯素含量：1年生>3年生>2年生>4年生。

4 結(jié)論與討論

在五指毛桃的生長過程中，其主根會自然向下生長，當長至一定程度后，生長速度逐漸放緩，開始從根莖處向斜下或橫向長出側(cè)根，側(cè)根數(shù)量較多且生長速度較快。而側(cè)根數(shù)量、根長、直徑等指標則直接影響五指毛桃的產(chǎn)量。因此，主要以五指毛桃側(cè)根作為試驗對象。試驗結(jié)果證明，馬尾松林下種植五指毛桃，在生長年限為兩年時進入速生期，其次為3年生。可見，五指毛桃在馬尾松林下種植是可行的。

從測定結(jié)果中能夠看出，1年生五指毛桃的佛手柑內(nèi)酯及補骨酯素的含量最高，分析其原因，可能是由于1年生五指毛桃的根系較小，且以根皮為主，根莖量相對較少。同時梳理現(xiàn)有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，佛手柑內(nèi)酯和補骨酯素在五指毛桃根皮中的含量要比根莖中的含量高，且補骨酯素的含量要高于佛手柑內(nèi)酯。

林下種植藥材作為人工林多目標經(jīng)營中重要項目，必須對中藥材的產(chǎn)量及經(jīng)濟效益進行充分的考慮。林下中藥材的種植普遍采用粗放式的種植模式，不需要再施用化肥，屬于一種仿野生的種植方式?？紤]在野生環(huán)境中無法明確得知藥材的具體生長年份，導(dǎo)致采收的藥材在質(zhì)量上具有一定差異[20]。而林下種植這一模式則能有效彌補上述弊端，可根據(jù)藥材的最佳采收期采收相應(yīng)年限的藥材，不僅能夠保證采收到的藥材質(zhì)量統(tǒng)一，還能保證藥材的藥用效果達到最高。對于五指毛桃而言，佛手柑內(nèi)酯和補骨酯素是衡量其質(zhì)量的關(guān)鍵依據(jù)，倘若采收過早，藥材中積累的藥用活性成分較少，無法保證藥材產(chǎn)量和質(zhì)量；如果采收過晚，則會導(dǎo)致藥材老化，品相較差。根據(jù)研究結(jié)果顯示，這兩種藥用活性成分在一年生的五指毛桃中含量最高，之后隨著生長年限的增加開始下降，三年生又比二年生的含量要高。這一點說明五指毛桃中的藥用活性成分并非隨著生長年限的增長一直提高，而是在生長至一定年限后不再增加，開始降低。所以，必須對五指毛桃的最佳采收期進行合理的確定，以確保采收品質(zhì)。結(jié)合不同年限五指毛桃生長性狀、生物量變化以及活性成分含量，最終確定五指毛桃的最佳采收期為三年，建議選取三年生的五指毛桃入藥。