王靜怡，佐長(zhǎng)賡，牛新湘，楊紅梅，楚 敏，王 寧，林 青，王有武，婁 愷，史應(yīng)武,

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830052; 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091;3.新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091; 4 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所，烏魯木齊 830091; 5 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棉花黃萎病已成為新疆棉花種植和生產(chǎn)的主要障礙[1,2]。棉花黃萎病是一種土傳病害，由大麗輪枝菌通過(guò)侵染根部定殖于維管束引起，生物防治在近幾年取得了很好的效果，不易使病原菌產(chǎn)生抗病性的特征使生物防治成為了近幾年防治方法[3-5]。生防菌能否很好的發(fā)揮防病效果受多種因素影響，主要有其施加后在植株或土壤中的適應(yīng)能力、定殖能力、拮抗物質(zhì)的產(chǎn)生能力及拮抗基因的表達(dá)水平[6]，而生防菌的定殖能力是決定其發(fā)揮生防效果的前提[7-10]。棉花黃萎病是一種土傳病害，由大麗輪枝菌通過(guò)侵染根部定殖于維管束引起。生物防治作為最有前景的防治方法，內(nèi)生和根際細(xì)菌被認(rèn)為是生防細(xì)菌中最有潛力的微生物菌群。研究生防菌在棉田土壤中的定殖數(shù)量及其與防病作用相關(guān)性，對(duì)生防菌在棉花黃萎病的防效具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】WANG等[11]在草莓采收后將拮抗菌接種到草莓果實(shí)上，檢測(cè)到拮抗菌菌群短時(shí)間內(nèi)在草莓果實(shí)表面大量富集，病原菌數(shù)量明顯下降，可能是果實(shí)表面有限的空間被拮抗菌生長(zhǎng)繁殖所占據(jù)，伴隨著抑菌功能，病原菌在果實(shí)傷口處和表面的生長(zhǎng)繁殖被抑制，最終抑制果實(shí)的發(fā)病 。棉田條件復(fù)雜且多變，棉花黃萎病生防菌在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)大麗輪枝菌有很好的抑制作用，而在大田中不一定能發(fā)揮相同的效果。生防菌劑應(yīng)用于大田能否起作用主要取決于所施生防菌劑能否在植株根際定殖并增殖[12-13]。其中杜鵑等[14]報(bào)道了施加生防菌后根際土壤的細(xì)菌數(shù)量顯著增加，真菌數(shù)量顯著減少，棉花根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)向有利于作物生長(zhǎng)的細(xì)菌型轉(zhuǎn)變。婁善偉等[15]也得出相似結(jié)論，微生物菌劑滴施后對(duì)棉花黃萎病產(chǎn)生了較為明顯的抑制作用，發(fā)病指數(shù)降低，棉花產(chǎn)量隨施加藥量的增加而增加?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前大部分研究放在生防菌與病原菌之間的相互作用使其提高防效上，對(duì)生防菌實(shí)際應(yīng)用在土壤中時(shí)的定殖與防病相關(guān)的研究報(bào)道還很少。對(duì)于生防菌施入后，棉花黃萎病發(fā)病情況與生防菌定殖量的相關(guān)性分析還很少見(jiàn)報(bào)道，大多都是生防菌和土壤微生物群落的研究。需研究生防菌施入棉田土壤后生防菌的數(shù)量變化和棉花黃萎病的發(fā)病情況。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選擇4株棉花內(nèi)生和根際拮抗菌進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，使用平板計(jì)數(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量分析細(xì)菌和病原菌，分析生防菌的定殖與防病的相互關(guān)系，為生物防治保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土 樣

土樣取自烏魯木齊安寧渠試驗(yàn)場(chǎng)灰漠土，土壤理化性質(zhì)由中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所胡明芳測(cè)定。其中有機(jī)質(zhì)15.2 g/kg，全氮0.868 g/kg，全磷0.667 g/kg，全鉀19.8 g/kg，堿解氮0.055 g/kg，速效鉀0.288 g/kg，速效磷0.003 g/kg，pH 8.1。

1.1.2 供試病原菌

大麗輪枝菌[16](Verticilliumdahliae)，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所饋贈(zèng)。

1.1.3 供試拮抗菌

4個(gè)菌株：分離自博樂(lè)和石河子花期棉株體內(nèi)的BacillusvelezensisBHZ-29、BacillusatrophaeusSHZ-24；分離自石河子花期和苗期棉株根際的BacillussubtilisSHT-15和BacillusvanilleaSMT-24。

1.1.4 棉花品種

新陸早36號(hào)由新疆石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所饋贈(zèng)。

1.1.5 供試培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH (7.2±0.2)。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH (7.3±0.1)。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，孟加拉紅0.033 3 g，氯霉素0.1 g。

Czapek’s培養(yǎng)基：NaNO33 g，K2HPO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.01 g，蔗糖30 g，蒸餾水1 000 mL，pH6.5。

1.1.6 主要試劑

DNeasy PowerSoil Kit(QIAGEN公司)；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生物工程股份有限公司)；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(生物工程股份有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 棉苗盆栽種植

將長(zhǎng)8 cm,寬6 cm紙片做成紙筒，將經(jīng)過(guò)滅菌處理的土樣裝至紙筒2/3處，在每個(gè)紙筒中種植一粒顆粒飽滿的棉種，覆土壓實(shí)后放置智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常溫室溫培養(yǎng)，晝/夜光照與溫度分別：13 h/11 h，26℃/24℃，相對(duì)濕度：80%，光照強(qiáng)度60 klx。待接種病原菌后將棉苗移植于大花盆中，每盆移植8株棉苗。

1.2.2 拮抗細(xì)菌接種和大麗輪枝菌接種

播種后 18 d左右棉苗一片真葉初現(xiàn)時(shí)將SMT-24，BHZ-29，SHT-15，SHZ-24菌株發(fā)酵液以10 mL/株(108CFU/mL)均勻灌溉棉苗，對(duì)照CK(僅接種大麗輪枝菌)接種同體積滅菌NB培養(yǎng)基，接種后放回智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第1次接種接抗菌7 d后接種大麗輪枝菌，接種量為10 mL/株(107個(gè)孢子/mL)。接種大麗輪枝菌5 d后，第2次接種拮抗細(xì)菌發(fā)酵液10 mL/株。5 d后第3次接種拮抗細(xì)菌發(fā)酵液10 mL/株。

1.2.3 拮抗細(xì)菌在土壤中定殖數(shù)量檢測(cè)

棉苗土壤第3次接種拮抗細(xì)菌10 d后，每10天每種拮抗菌取3份棉苗根部土，混勻后稱(chēng)量5 g的土壤放入裝有45 mL滅菌生理鹽水的250 mL三角瓶中，25℃，180 r/min震蕩2 h，10-4和10-5稀釋梯度涂布于NA固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d。計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)在30～300 CFU的平板，每次處理設(shè)置3組平行，每組平行計(jì)數(shù)5次。

1.2.4 qPCR定量大麗輪枝菌

1.2.4.1 大麗輪枝菌DNA的提取

大麗輪枝菌DNA的提取利用真菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行提取。提取后的樣品保存在-20℃冰箱中待測(cè)。

1.2.4.2 qPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

參考黨文芳等[17]的方法，應(yīng)用大麗輪枝菌引物Vd-F929-947(5`-CGTTTCCCGTTACTCTTC-3`)和Vd-R1076-1094(5`-GGATTTCGGCCCAGAAACT-3`)對(duì)土壤基因組總DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.4.3 大麗輪枝菌重組質(zhì)粒的制備與鑒定

參考黨文芳等[17]的方法。

1.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參考黨文芳和張濤等的方法[17,18]。

1.2.4.5 樣品的qPCR檢測(cè)

用qPCR對(duì)擴(kuò)增后的大麗輪枝菌定量檢測(cè)，將得到的每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的Ct值帶入上述重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算棉花根際土壤中大麗輪枝菌的含量(copies/g FRW)。

1.2.5 病情調(diào)查

調(diào)查第3次拮抗菌接種2 d后發(fā)病情況，以棵為單位，統(tǒng)計(jì)發(fā)病葉片數(shù)與每株總?cè)~片數(shù)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：外表無(wú)癥狀；1級(jí)：病葉占總?cè)~片數(shù)25%以下；2級(jí)：病葉占總?cè)~片數(shù)25%～50%；3級(jí)：病葉占總?cè)~片數(shù)50%～75%；4級(jí)：病葉占總?cè)~片數(shù) 75%以上。

病情指數(shù)=∑(級(jí)值×株數(shù) /(最高級(jí)值×總株數(shù))×100。

防治效果=(大麗輪枝菌對(duì)照組病情指數(shù)-拮抗菌處理后的病情指數(shù))/大麗輪枝菌對(duì)照組病情指數(shù)×100%。

1.2.6 生防菌定殖數(shù)量與防病效果相關(guān)性

利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(PCC)分析生防菌定殖數(shù)量與防病效果之間的相關(guān)性，PCC分析在SPSS 26軟件中進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

繪圖和分析利用Origin 2018和SPSS 26軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌和大麗輪枝菌在棉花根際土壤定殖數(shù)量

研究表明，菌株SHZ-24和BHZ-29在土壤中適應(yīng)性良好，呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)；菌株SMT-24和SHT-15在土壤中呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在50 d時(shí)，4株菌的定殖數(shù)量從高到低的順序依次為SHZ-24, BHZ-29，SMT-24，SHT-15，在土壤中的數(shù)量分別為5.13×107、3.63×107、3.97×107和2.53×107copies/g，且4株菌的數(shù)量都大于10 d時(shí)的數(shù)量。圖1

經(jīng)拮抗細(xì)菌處理的土壤中大麗輪枝菌數(shù)量均小于CK對(duì)照組。在CK組中，土壤中大麗輪枝菌呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。4組拮抗細(xì)菌處理的土壤中，大麗輪枝菌數(shù)量由高到低分別是：BHZ-29，SMT-24，SHT-15，SHZ-24。圖2

注:滅菌土壤

2.2 拮抗細(xì)菌對(duì)棉花黃萎病的防病作用

研究表明，土壤中4株拮抗細(xì)菌處理組的病情指數(shù)變化均小于CK對(duì)照組，且4株菌處理組在整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)病情指數(shù)呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，增長(zhǎng)速度小于CK對(duì)照組。50 d時(shí)，CK對(duì)照、SHZ-24、SMT-24、SHT-15和BHZ-29菌各處理的病情指數(shù)分別為22.44，11.7，11.36，12.06和11.39。 圖3

注:滅菌土壤A:ck; B:SHZ-24; C:SMT-24; D:SHT-15; E:BHZ-29

2.3 拮抗細(xì)菌數(shù)量與防病效果的相關(guān)性

研究表明，經(jīng)4株拮抗細(xì)菌處理后，SHZ-24、SHT-15、SMT-24和BHZ-29菌株的定殖數(shù)量與大麗輪枝菌數(shù)量的PCC分別為-0.945、-0.982、-0.963和-0.961(P<0.01)，4株拮抗細(xì)菌定殖數(shù)量與大麗輪枝菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)且為高度相關(guān)。4株拮抗細(xì)菌定殖數(shù)量與防病效果的PCC值分別為0.938、0.983、0.801和0.851(P<0.01)，4株拮抗細(xì)菌定殖數(shù)量與防病效果呈正相關(guān)且為高度相關(guān)。表1

注:滅菌土壤

3 討 論

土壤中的微生物數(shù)量繁多、種類(lèi)豐富，其中微生物的多樣性對(duì)土壤的成分組成、土壤中的養(yǎng)分利用情況和植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用[19-21]。林巧玲等[22]采用灌根和涂葉的方法對(duì)盆栽大豆中海洋細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌的定殖動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究，指出灌根方法可使該菌株在大豆體內(nèi)穩(wěn)定定殖一段時(shí)期。祁超等[23]利用GFP標(biāo)記法測(cè)定生防菌在黃瓜體內(nèi)的定殖情況，得出生防菌可在黃瓜體內(nèi)穩(wěn)定定殖且維持在一定數(shù)量。王濤等[24-25]通過(guò)盆栽試驗(yàn)分析了棉花黃萎病拮抗細(xì)菌在土壤、棉花根際和根內(nèi)的定殖情況，指出拮抗細(xì)菌在滅菌土中的定殖數(shù)量高于自然土中。

研究中當(dāng)拮抗細(xì)菌施入棉株根部土壤中時(shí)，拮抗細(xì)菌可在土壤中定殖并增殖。4株菌中SHZ-24菌株在土壤中定殖能力最好，且在生長(zhǎng)后期防病效果在4株菌中較好，定殖能力是發(fā)揮其防病效果的前提，與前人研究結(jié)論相符。經(jīng)拮抗細(xì)菌處理的土壤中大麗輪枝菌數(shù)量均小于CK對(duì)照組。拮抗細(xì)菌施入土壤中后通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)和拮抗物質(zhì)的產(chǎn)生等抑制了大麗輪枝菌的生長(zhǎng)。土壤中大麗輪枝菌呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。拮抗細(xì)菌定殖數(shù)量與防病效果相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)4株拮抗細(xì)菌定殖數(shù)量與防病效果呈顯著正相關(guān)，拮抗細(xì)菌的施加量顯著影響其在土壤中防病效果的發(fā)揮。而生防細(xì)菌能否大田應(yīng)用涉及生防菌的施用方式、施用量、對(duì)土壤環(huán)境的適應(yīng)能力、在土壤中抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生能力及與土壤環(huán)境中各生物之間的互作能力等。生防菌的大田應(yīng)用涉及范圍廣，在土壤中的存活能力只是影響其能否大田應(yīng)用的其中一個(gè)因素，讓生防菌應(yīng)用于大田，還須進(jìn)行影響其應(yīng)用全部因素的研究。

4 結(jié) 論

構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光定量拮抗菌和大麗輪枝菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)棉花根際拮抗菌和大麗輪枝菌進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量。4株菌在滅菌土壤中存活數(shù)量變化趨勢(shì)相同，50 d時(shí)的存活數(shù)量從高到低分別為SHZ-24、BHZ-29、SMT-24和SHT-15，拮抗細(xì)菌處理的土壤中大麗輪枝菌數(shù)量均小于CK對(duì)照組。4株拮抗細(xì)菌均降低棉苗的病情指數(shù)，其中BHZ-29的防病效果最好。SHZ-24、SHT-15、SMT-24和BHZ-29菌株在土壤中的數(shù)量與大麗輪枝菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，PCC值分別為-0.945、-0.982、-0.963和-0.961。與防病效果的PCC值分別為0.938、0.983、0.801和0.851，4株拮抗細(xì)菌在土壤中的定殖數(shù)量與防病效果呈顯著正相關(guān)。