王富蕓，趙 丹，劉 宇，2，馬 成，朱宇珂，李 莉*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010020；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害鼠害綜合治理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

桃（Amygdalus persicaL.）屬薔薇科李屬桃亞屬，為多年生落葉果樹(shù)[1]，在我國(guó)栽培歷史悠久[2]。桃營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的藥用和食用價(jià)值[3]，然而在實(shí)際生產(chǎn)栽培過(guò)程中，常有穿孔病、炭疽病和灰霉病等病害的發(fā)生[4]。研究表明，使用殺菌劑是防治病蟲(chóng)害最為有效的手段之一[5]。

苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole）是一種三唑類(lèi)殺菌劑，因其具有高效、低毒、廣譜、對(duì)非靶標(biāo)生物安全和持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用[6]。苯醚甲環(huán)唑可用于防治桃軟腐病[7]、炭疽病[8]、蘋(píng)果、山核桃及杏樹(shù)瘡痂病[9]等病害，但其在作物上以及水體中的殘留對(duì)生態(tài)系統(tǒng)、水生生物乃至人類(lèi)都具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)[10]。因此，我們需要對(duì)苯醚甲環(huán)唑進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)測(cè)，以評(píng)估其對(duì)人類(lèi)和環(huán)境帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)。

目前，關(guān)于苯醚甲環(huán)唑的殘留分析與膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的報(bào)道集中在火龍果[11]、西瓜[12]、香蕉[13]和稻米[14]等作物上，而對(duì)桃的報(bào)道相對(duì)較少。本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留分析方法，通過(guò)規(guī)范殘留田間試驗(yàn)，得到桃主要種植地區(qū)的樣品中苯醚甲環(huán)唑殘留消解規(guī)律及最終殘留量，并結(jié)合我國(guó)不同消費(fèi)群體的桃膳食消費(fèi)量進(jìn)行了急性和慢性膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，旨在為該農(nóng)藥在桃上的科學(xué)合理使用提供基礎(chǔ)性建議。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)儀器：Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQD 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)沃特世公司；SC-3612臺(tái)式離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HM294均質(zhì)機(jī)，福斯華（北京）科貿(mào)有限公司；KQ-600超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；S30UV純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司。

試驗(yàn)試劑：苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品（純度96.3%），先正達(dá)公司；乙腈（色譜純），美國(guó)賽默飛化學(xué)品公司；甲酸（色譜純），上海安譜科學(xué)儀器有限公司；氯化鈉（分析純），北京市通廣精細(xì)化工公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究依據(jù)NY/T 788—2018《農(nóng)作物農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[15]，于2018年6月—2020年8月在北京市、河南駐馬店市、安徽省宿州市、遼寧省大連市、山西省晉中市、河南省濟(jì)源市、山東省濰坊市和河北省保定市8地進(jìn)行40%苯醚甲環(huán)唑乳油在桃上的消解及最終殘留試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)計(jì)1個(gè)處理小區(qū)和1個(gè)對(duì)照小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植桃樹(shù)不少于4株，小區(qū)間設(shè)保護(hù)帶。試驗(yàn)地基本概況見(jiàn)表1。

表1 田間試驗(yàn)地基本概況

1.2.2 最終殘留試驗(yàn)

按照有效劑量133.3 mg/kg于桃樹(shù)褐斑病穿孔病發(fā)病初期噴霧施藥2次，間隔7 d。采樣時(shí)間分別為末次施藥后21、28 d和35 d，每個(gè)處理2次重復(fù)，對(duì)照小區(qū)于末次施藥后21、35 d采集樣品。

1.2.3 殘留消解試驗(yàn)

按照有效劑量133.3 mg/kg于桃樹(shù)發(fā)病初期噴霧施藥2次，間隔7 d。采樣時(shí)間為末次施藥后0（2 h）、7、14、21、28 d和35 d，每個(gè)處理2次重復(fù)，對(duì)照小區(qū)于末次施藥后0（2 h）、35 d采集樣品。

1.2.4 樣品采集

按設(shè)計(jì)方案中采集時(shí)間要求，隨機(jī)在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)采集12個(gè)生長(zhǎng)正常、無(wú)病害和成熟的桃果實(shí)，重量在2 kg以上。處理小區(qū)每次采集2個(gè)樣品，對(duì)照小區(qū)每次采集1個(gè)樣品。采集的樣品去除果核，用不銹鋼刀切成1～2 cm2大小碎塊，在不銹鋼盆中將其充分混勻，用四分法縮分樣品，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分析方法

1.3.1 儀器條件

色譜條件。Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量：3 μL；柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

表2 液相色譜檢測(cè)桃果實(shí)中苯醚甲環(huán)唑殘留梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件。掃描方式：電噴霧離子源ESI+，毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；錐孔氣流量：50 L/h；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 質(zhì)譜檢測(cè)桃果實(shí)中苯醚甲環(huán)唑殘留多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定參數(shù)

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00 g粉碎后的桃樣品，將其置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈混合均勻，超聲波振蕩提取15 min，隨后加入6 g氯化鈉，劇烈搖動(dòng)1.5 min，于3 000 r/min離心5 min。過(guò)0.22 μm濾膜后吸取1 mL上清液至進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制質(zhì)量濃度為1 013 mg/L苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)母液，并逐級(jí)稀釋成0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10 mg/L和25 mg/L標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，樣品測(cè)定時(shí)稀釋至0.010、0.025、0.050、0.10、0.25、0.50、1.0 mg/L和2.5 mg/L進(jìn)行測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5 添加回收試驗(yàn)

分別在桃空白樣品中添加0.020、0.050、0.50 mg/kg和1.0 mg/kg 4個(gè)水平的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個(gè)水平重復(fù)5次。依據(jù)1.4節(jié)所述方法進(jìn)行處理與分析測(cè)定，分別計(jì)算添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 消解動(dòng)力學(xué)分析

苯醚甲環(huán)唑在桃上的消解規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，按照式（1）進(jìn)行擬合，按照式（2）計(jì)算半衰期。

式中:Ct為施藥后第td的農(nóng)藥殘留量，mg/kg；C0為原始沉積量，mg/kg；k為消解系數(shù)，t為施藥后間隔時(shí)間，d；t1/2為半衰期，d。

1.6.2 慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

采用JMPR推薦的方法[16]按式（3）（4）計(jì)算國(guó)家估算每日攝入量（NEDI）和慢性風(fēng)險(xiǎn)商（RQc）。

式中：STMRi為規(guī)范殘留試驗(yàn)中值，mg/kg；Fi為膳食消費(fèi)量，g/d；ADI為每日允許攝入量，mg/(kg bw)，bw為消費(fèi)人群平均體重，kg。

由于目前缺乏苯醚甲環(huán)唑在其他登記作物上的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值，故不能計(jì)算包含所有登記作物在內(nèi)的膳食暴露量NEDI值，因此本文只計(jì)算桃中苯醚甲環(huán)唑殘留膳食暴露占NEDI的份額，以及對(duì)RQc的貢獻(xiàn)率，%。當(dāng)RQc≤100%時(shí)，表示其慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)可以接受；當(dāng)RQc＞100%時(shí)，表示其慢性膳食風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

1.6.3 急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

采用JMPR推薦的方法[17]按式（5）（6）計(jì)算國(guó)際估算短期攝入量（IESTI）和急性風(fēng)險(xiǎn)商（RQa）。

式中：Ue為單個(gè)桃果重量，kg；HR為農(nóng)藥最高殘留量，mg/kg；v為變異因子；LP為大份餐，即居民對(duì)桃的大份額消費(fèi)量，kg/d；bw為消費(fèi)人群平均體重，kg。ARfD為急性參考劑量，mg/(kg bw)。急性風(fēng)險(xiǎn)商（RQa）以IESTI占ARfD的百分比（%ARfD）來(lái)表示，當(dāng)%ARfD≤100%時(shí)，表示急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)可以接受；當(dāng)%ARfD＞100%時(shí)，表示其急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)不可接受，數(shù)值越大，風(fēng)險(xiǎn)越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法有效性評(píng)價(jià)

試驗(yàn)首先建立了桃中苯醚甲環(huán)唑殘留分析方法，并對(duì)方法的準(zhǔn)確度、精密度、定量限和重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在0.010～2.5 mg/L范圍內(nèi)，苯醚甲環(huán)唑在乙腈中的回歸方程為y=382 726x+6 902.5，R2=0.999 6。如表4所示，當(dāng)添加水平在0.020、0.050、0.50 mg/kg和1.0 mg/kg時(shí)，平均回收率在75%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.9%～4.8%，定量限均為0.02 mg/kg。試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的線(xiàn)性、準(zhǔn)確度和精密度等均符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

表4 苯醚甲環(huán)唑在桃上的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

2.2 殘留消解試驗(yàn)結(jié)果

按1.2.1和1.2.3節(jié)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，在北京市大興區(qū)、河南省駐馬店市和安徽省宿州市、遼寧省大連市進(jìn)行施藥和采樣，獲得其在桃上的消解趨勢(shì)。如表5所示，苯醚甲環(huán)唑在4地桃上的消解規(guī)律均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)施藥后2 h時(shí)，苯醚甲環(huán)唑在桃上的初始沉積量分別為0.32 mg/kg（北京市大興區(qū)）、0.25 mg/kg（河南省駐馬店市）、0.40 mg/kg（安徽省宿州市）和0.44 mg/kg（遼寧省大連市），河南原始沉積量低于其余3地。隨時(shí)間延長(zhǎng)，苯醚甲環(huán)唑在4地桃上的殘留量逐漸降低，呈負(fù)指數(shù)函數(shù)變化。苯醚甲環(huán)唑在桃中的半衰期為6.60～13.08 d，4地消解趨勢(shì)基本一致，但其在河南駐馬店消解速度最快，北京最慢，這可能與各地氣候條件、溫濕度和pH等因素有關(guān)。

表5 苯醚甲環(huán)唑在桃上的消解參數(shù)

2.3 最終殘留試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)規(guī)范殘留田間試驗(yàn)得到2種農(nóng)藥在8個(gè)主要桃產(chǎn)區(qū)中的殘留量。如表6所示，隨著采收間隔期的延長(zhǎng)，苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留量、殘留中值以及最高殘留量均逐漸降低。其中，距末次施藥21 d時(shí)采集桃樣品，苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留量小于0.02～0.41 mg/kg，規(guī)范殘留試驗(yàn)中值（STMR）為0.065 mg/kg，最高殘留量（HR）為0.41 mg/kg。根據(jù)我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：苯醚甲環(huán)唑在桃上的最大殘留限量（MRL）為0.5 mg/kg[18]；歐盟、日本、美國(guó)和CAC規(guī)定：苯醚甲環(huán)唑在桃上的MRL值分別為0.5、1、2.5 mg/kg和0.5 mg/kg[19]。因此，該農(nóng)藥在不同地區(qū)桃上的殘留量均低于我國(guó)或國(guó)外現(xiàn)有規(guī)定的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

表6 苯醚甲環(huán)唑在桃上的最終殘留結(jié)果

2.4 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

2.4.1 慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定：苯醚甲環(huán)唑的ADI值為0.01 mg/kg bw[18]，采用推薦有效劑量133.3 mg/kg，施用苯醚甲環(huán)唑2次，于末次施藥后21、28 d和35 d時(shí)采樣，桃中苯醚甲環(huán)唑規(guī)范殘留試驗(yàn)中值（STMR）分別為0.065、0.041 mg/kg和0.023 mg/kg。以我國(guó)一般人群平均體重為53.23 kg[20]、3～5歲兒童平均體重為17.63 kg[21]計(jì)，結(jié)合WHO中國(guó)各年齡組居民不同百分位點(diǎn)的膳食消費(fèi)量/體重調(diào)查數(shù)據(jù)，采用1.6.2節(jié)公式計(jì)算在不同百分位點(diǎn)膳食消費(fèi)量情況下苯醚甲環(huán)唑?qū)β燥L(fēng)險(xiǎn)商的貢獻(xiàn)率（RQc），結(jié)果如表7所示。

由表7可以看出，將我國(guó)人群分為一般人群和3～5 歲兒童時(shí)，桃中苯醚甲環(huán)唑殘留量對(duì)風(fēng)險(xiǎn)商的貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于100%，為0.007%～0.380%。同一消費(fèi)群體，風(fēng)險(xiǎn)商貢獻(xiàn)率隨著消費(fèi)位點(diǎn)的增大而增大，隨著采收間隔期的延長(zhǎng)而降低。本研究試驗(yàn)結(jié)果與其他作物上的評(píng)估結(jié)果基本一致[11-14,22]。綜上，苯醚甲環(huán)唑在桃上殘留的風(fēng)險(xiǎn)商貢獻(xiàn)率較低，即從膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估角度來(lái)看，其在桃上的使用是安全的。同時(shí)，從表中數(shù)據(jù)可以看出3～5歲兒童的膳食評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)商貢獻(xiàn)率均比一般人群高，這可能是由于兒童與一般人群的體重存在差異所致。因此，相關(guān)部門(mén)在開(kāi)展膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作時(shí)應(yīng)多注重兒童膳食安全。

表7 苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留的慢性膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

2.4.2 急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)JMPR的相關(guān)規(guī)定，苯醚甲環(huán)唑的急性參考劑量（ARfD）為0.3 mg/kg bw[23]?；谧罱K殘留試驗(yàn)，其在桃上的最高殘留量（HR）為0.41 mg/kg，桃果單重為0.255 kg，變異因子為3[22]。本研究根據(jù)1.6.3節(jié)的公式計(jì)算了在中國(guó)不同年齡段消費(fèi)者群體中苯醚甲環(huán)唑的IESTI和RQa，相關(guān)研究結(jié)果見(jiàn)表8和圖1。

根據(jù)表8所示，無(wú)論男性還是女性，其急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)商均隨著年齡的增加而降低。其中，女性高于男性，兒童較其他人群高，其在桃中的急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)商在1.50%～5.97%，表明風(fēng)險(xiǎn)處于可接受水平。

表8 不同消費(fèi)人群對(duì)桃上苯醚甲環(huán)唑的急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

如圖1所示，不同消費(fèi)人群的急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)均存在差異，RQa值隨著年齡的增加而降低，這表明以有效成分和最短收獲間隔期對(duì)桃施用40%苯醚甲環(huán)唑乳油后，其急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較低，不會(huì)對(duì)中國(guó)不同消費(fèi)群體造成潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

圖1 不同消費(fèi)人群對(duì)桃上苯醚甲環(huán)唑的急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估示意圖

3 結(jié)論

本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，對(duì)苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留水平進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果顯示，所用方法的穩(wěn)定性好、靈敏度高，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求，能夠準(zhǔn)確評(píng)估其安全性。

本研究用40%苯醚甲環(huán)唑乳油，以有效劑量133.3 mg/kg于桃褐斑穿孔病發(fā)病初期噴霧施藥2次，施藥間隔7 d進(jìn)行殘留消解試驗(yàn)。結(jié)果顯示，苯醚甲環(huán)唑在桃上的消解規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，半衰期為6.60～13.08 d，但在不同試驗(yàn)地區(qū)的消解速度有所差異。農(nóng)藥殘留消解受到很多因素的影響，包括溫度、濕度、光照、降水量、pH、土壤狀況和作物種類(lèi)等[25]。Dong等[26]于2015、2016年在上海地區(qū)進(jìn)行殘留消解試驗(yàn)，得出苯醚甲環(huán)唑在桃上的半衰期分別為25 d和9.0 d，與本次試驗(yàn)結(jié)果不一致，說(shuō)明苯醚甲環(huán)唑在不同環(huán)境下的消解速度會(huì)有所不同。此外，相關(guān)研究表明，苯醚甲環(huán)唑在香蕉、芒果、三七植株、葡萄、大白菜、菜豆、芹菜中的半衰期分別為20.4 d[13]、10.6～13.2 d[27]、12.3～12.8 d[28]、5.6～16.4 d[29]、6.6～7.8 d[30]、8.3～9.7 d[30]和5.2～8.8 d[31]，說(shuō)明苯醚甲環(huán)唑在不同作物種類(lèi)之間的消解速度也存在差異。綜上，各地不同的環(huán)境條件及作物種類(lèi)等因素均可能導(dǎo)致苯醚甲環(huán)唑的殘留消解行為具有差異。

根據(jù)本次最終殘留試驗(yàn)結(jié)果，參照WHO桃膳食消費(fèi)量以及我國(guó)不同年齡消費(fèi)人群的平均體重進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，得出桃中苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ煌挲g消費(fèi)人群的慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)商的貢獻(xiàn)率為0.007%～0.38%，按照風(fēng)險(xiǎn)最大化原則，推薦使用97.5%膳食消費(fèi)位點(diǎn)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析；其急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)商在1.50%～5.97%。以上結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑在桃上的殘留不會(huì)對(duì)中國(guó)不同消費(fèi)人群造成潛在的風(fēng)險(xiǎn)。然而，在此風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，兒童的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于成人，這可能是由于兒童體重遠(yuǎn)小于成人。研究表明，兒童是弱勢(shì)群體，他們易受到農(nóng)藥殘留所造成的危害[32]，故建議相關(guān)部門(mén)應(yīng)盡快完善我國(guó)膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法，并充分考慮低齡兒童的膳食安全。