曹建平

(江蘇省南通市海安市曲塘中學(xué))

高中生物學(xué)育種、基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程等教學(xué)內(nèi)容中都涉及“篩選”問題,高考題和模擬題也常以其作為命題素材,本文對(duì)“篩選”問題簡(jiǎn)要?dú)w納并結(jié)合例題進(jìn)行分析。

一、育種中的篩選

為獲得所需要的生物類型,在雜交育種、誘變育種、單倍體育種等過程中都要進(jìn)行篩選。在雜交育種過程中,為選育出符合要求的顯性純合子,可讓具有顯性性狀的個(gè)體連續(xù)自交,直到不再發(fā)生性狀分離為止。

【例題1】(2014年江蘇卷,T13)圖1是高產(chǎn)糖化酶菌株的育種過程,有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是

( )

圖1

A.通過圖1篩選過程獲得的高產(chǎn)菌株未必能作為生產(chǎn)菌株

B.X射線處理既可以引起基因突變也可能導(dǎo)致染色體變異

C.圖1篩選高產(chǎn)菌株的過程是定向選擇過程

D.每輪誘變相關(guān)基因的突變率都會(huì)明顯提高

【解析】由于X射線處理導(dǎo)致的基因突變具有隨機(jī)性,所以篩選獲得的高產(chǎn)菌株也可能存在其他的基因突變而不能作為生產(chǎn)菌株,選項(xiàng)A正確;X射線處理可以引起基因突變,也可能造成染色體結(jié)構(gòu)變異,選項(xiàng)B正確;題圖1是高產(chǎn)糖化酶菌株的育種過程,是定向篩選高產(chǎn)菌株的過程,選項(xiàng)C正確;因?yàn)榛蛲蛔兊碾S機(jī)性、低頻性以及不定向性,所以不是每輪誘變相關(guān)基因的突變率都會(huì)明顯提高,選項(xiàng)D錯(cuò)誤。

【答案】D

【例題2】(2018年江蘇卷,T8)花藥離體培養(yǎng)是重要的育種手段。圖2是某二倍體植物花藥育種過程的示意圖,下列敘述正確的是

( )

圖2

A.為了防止微生物污染,過程①所用的花藥需在70%乙醇中浸泡30 min

B.過程②的培養(yǎng)基中需添加較高濃度的細(xì)胞分裂素以利于根的分化

C.過程③逐步分化的植株中可篩選獲得純合的二倍體

D.過程④應(yīng)將煉苗后的植株移栽到含有蔗糖和多種植物激素的基質(zhì)上

【解析】為了防止微生物污染,培養(yǎng)所用的花藥(外植體)需在70%乙醇中浸泡30 s,立即用無菌水清洗2～3次。在70%的乙醇中浸泡30 min,細(xì)胞會(huì)死亡,選項(xiàng)A錯(cuò)誤;過程②是脫分化,培養(yǎng)基中應(yīng)加入比例適中的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素以達(dá)到脫分化的效果,選項(xiàng)B錯(cuò)誤;由于用秋水仙素可以誘導(dǎo)細(xì)胞中染色體數(shù)加倍,所以過程③逐步分化的植株中可篩選獲得純合的二倍體,選項(xiàng)C正確;煉苗的目的是使幼苗適應(yīng)外界的環(huán)境。煉苗后,應(yīng)洗去根部富含有機(jī)物的培養(yǎng)基,栽種到以無機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主的普通基質(zhì)上,選項(xiàng)D錯(cuò)誤。

【答案】C

二、微生物的篩選

自然界中微生物種類龐雜,有時(shí)候人們會(huì)發(fā)現(xiàn)一些特殊功能的微生物,為了將該類微生物分離出來并使用,就需要對(duì)其進(jìn)行篩選。借助選擇培養(yǎng)基,依據(jù)不同類型微生物的特性,通過改變培養(yǎng)基的成分等來實(shí)現(xiàn)篩選出人類需要的某種微生物。

【例題3】(2014年全國(guó)新課標(biāo)卷Ⅰ,T39,節(jié)選)植物秸稈中的纖維素可被某些微生物分解?；卮鹣铝袉栴}:

(3)為從富含纖維素的土壤中分離獲得纖維素分解菌的單菌落,某同學(xué)設(shè)計(jì)了甲、乙兩種培養(yǎng)基(成分如表):

酵母膏無機(jī)鹽淀粉纖維素粉瓊脂CR溶液水培養(yǎng)基甲++++-++培養(yǎng)基乙+++-+++

據(jù)表判斷,培養(yǎng)基甲________(填“能”或“不能”)用于分離和鑒別纖維素分解菌,原因是________;培養(yǎng)基乙________(填“能”或“不能”)用于分離和鑒別纖維素分解菌,原因是________。

【解析】(3)培養(yǎng)基甲中未添加瓊脂,為液體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基上不能形成單菌落,故不能用于分離和鑒別纖維素分解菌。培養(yǎng)基乙中未添加纖維素粉,不能和CR溶液形成紅色復(fù)合物,即使出現(xiàn)單菌落也不能確定為纖維素分解菌。

【答案】(3)不能 液體培養(yǎng)基不能用于分離單菌落 不能 培養(yǎng)基中沒有纖維素,不會(huì)形成CR-纖維素紅色復(fù)合物,即使出現(xiàn)單菌落也不能確定其為纖維素分解菌

三、細(xì)胞工程中的篩選

(一)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)中的篩選

植物體細(xì)胞雜交技術(shù)中涉及原生質(zhì)體的融合過程,在融合細(xì)胞中有同種和異種融合兩種類型,因此涉及對(duì)雜種細(xì)胞的篩選。

【例題4】(改編)實(shí)驗(yàn)人員利用矮牽牛(二倍體,2n=14)的紅色花瓣細(xì)胞(液泡呈紅色)與枸杞(四倍體,4n=48)葉肉細(xì)胞,制備相應(yīng)的原生質(zhì)體并誘導(dǎo)其融合,經(jīng)篩選、培養(yǎng)獲得雜種植株。下列有關(guān)敘述正確的是

( )

A.酶解法制備原生質(zhì)體的主要原理是酶的高效性

B.原生質(zhì)體培養(yǎng)在無菌水中可以避免雜菌污染

C.若原生質(zhì)體兩兩融合,融合細(xì)胞染色體數(shù)均為62條

D.可利用光學(xué)顯微鏡觀察,篩選出雜種細(xì)胞

【解析】誘導(dǎo)植物細(xì)胞融合前,先去除細(xì)胞壁,獲得原生質(zhì)體。因?yàn)橹参锛?xì)胞的細(xì)胞壁主要成分是纖維素和果膠,所以用纖維素酶和果膠酶處理,這里依據(jù)的是酶的專一性,選項(xiàng)A錯(cuò)誤;原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁,培養(yǎng)在低濃度溶液(無菌水)中會(huì)吸水漲破,應(yīng)該在等滲溶液中培養(yǎng),選項(xiàng)B錯(cuò)誤;若原生質(zhì)體兩兩融合,會(huì)形成3種細(xì)胞,即矮牽牛細(xì)胞自身融合的細(xì)胞、枸杞細(xì)胞自身融合的細(xì)胞以及雜種細(xì)胞,故融合細(xì)胞中染色體數(shù)目可能為28條、96條、62條,選項(xiàng)C錯(cuò)誤;因?yàn)殡s種細(xì)胞中既含有綠色的葉綠體(葉肉細(xì)胞含葉綠體),也含有紅色的液泡,所以可以用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的顏色進(jìn)而篩選出雜種細(xì)胞,選項(xiàng)D正確。

【答案】D

(二)單克隆抗體制備中的篩選

在單克隆抗體制備過程中,經(jīng)誘導(dǎo)融合劑處理后的細(xì)胞需要進(jìn)行兩次篩選。首先,B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在滅活的仙臺(tái)病毒或聚乙二醇(PEG)等方法的誘導(dǎo)下融合后,混合物中有多種類型的細(xì)胞,包括未融合的B淋巴細(xì)胞、未融合的骨髓瘤細(xì)胞、兩個(gè)B淋巴細(xì)胞融合形成的融合細(xì)胞、兩個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合形成的融合細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞,以及3個(gè)(含)以上細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。其中雜交瘤細(xì)胞是制備單克隆抗體所必需的,因此,需要進(jìn)行第一次篩選,從多種細(xì)胞中篩選出雜交瘤細(xì)胞。

又因?yàn)锽淋巴細(xì)胞是從動(dòng)物體內(nèi)提取的,有的可能是動(dòng)物體內(nèi)曾接觸過其他抗原刺激而分化產(chǎn)生的,只具有分泌其他抗體的能力;有的并未接受抗原刺激,未分泌抗體;只有一部分B淋巴細(xì)胞是接受了實(shí)驗(yàn)用的抗原刺激能分化產(chǎn)生漿細(xì)胞,能分泌目標(biāo)抗體。又因?yàn)楹芏嗫乖哂卸鄠€(gè)不同的抗原決定簇,所以這些接受了實(shí)驗(yàn)抗原刺激的B淋巴細(xì)胞分化產(chǎn)生的漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體也不是單一的,受該抗原刺激后的每個(gè)B淋巴細(xì)胞都能產(chǎn)生一種只針對(duì)某抗原決定簇的抗體。因此,需要進(jìn)行第二次篩選,即從眾多雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。

【例題5】(2020年全國(guó)卷Ⅰ,T38,節(jié)選)為研制抗病毒A的單克隆抗體,某同學(xué)以小鼠甲為實(shí)驗(yàn)材料設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)流程。

圖3

回答下列問題:

(3)為了得到能產(chǎn)生抗病毒A的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,需要進(jìn)行篩選。圖3中篩選1所采用的培養(yǎng)基屬于________,使用該培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果是____________。圖3中篩選2含多次篩選,篩選所依據(jù)的基本原理是____________。

【解析】圖3中篩選1采用特定的選擇培養(yǎng)基,在該培養(yǎng)基上,未融合的細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡,只有融合的雜種細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)才能生存。圖3中篩選2含多次篩選,利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,就可獲得能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。

【答案】(3)選擇培養(yǎng)基 只有雜交瘤細(xì)胞能夠生存 抗原與抗體的反應(yīng)具有特異性

【知識(shí)拓展】(1)HAT培養(yǎng)基:細(xì)胞DNA的合成有兩條途徑,一條途徑是生物合成途徑(D途徑),由糖和氨基酸合成核苷酸,進(jìn)而合成DNA,葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑(S途徑),在次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)存在的情況下,經(jīng)次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用下生成相應(yīng)的核苷酸,然后再合成DNA。

HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。未融合的淋巴細(xì)胞和2個(gè)B淋巴細(xì)胞相互融合形成的融合細(xì)胞雖S途徑正常,但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能力,一般10d左右死亡。對(duì)骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言,通常實(shí)驗(yàn)采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型細(xì)胞,由于自身沒有S途徑,且D途徑又被氨基喋呤阻斷,所以在HAT培養(yǎng)液中不能增殖而很快死亡。只有雜交瘤細(xì)胞,既具有B淋巴細(xì)胞的S途徑,又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液能無限增殖的特性,因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。

(2)有限稀釋法:二次篩選通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法,將雜交瘤細(xì)胞充分稀釋,接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,使每孔內(nèi)細(xì)胞不超過一個(gè),通過培養(yǎng)讓其增殖,然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體(常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法),上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞,繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋,一般重復(fù)3～4次,直至確定每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞株。

四、基因工程中的篩選

由于目的基因與載體正確連接效率、重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞的效率都不是百分之百,導(dǎo)致受體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化處理后,絕大部分仍是原來的細(xì)胞,或者是只含質(zhì)粒的細(xì)胞。為了分離出含目的基因的受體細(xì)胞,需要對(duì)處理過的大量受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。

【例題6】(2016年新課標(biāo)Ⅰ卷,T40,節(jié)選)某一質(zhì)粒載體如圖4所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因,Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后,與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合,加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng),用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化,有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種,分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}:

(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中,未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的,其原因是________;并且________和________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的,其原因是________。在上述篩選的基礎(chǔ)上,若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落,還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。

【解析】(2)依題意可知,目的基因插入后,導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因(Tetr)失活,而氨芐青霉素抗性基因(Ampr)仍能行使正常功能。用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞均不含氨芐青霉素抗性基因,在該培養(yǎng)基上都不能生長(zhǎng),所以是不能區(qū)分的;含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的細(xì)胞都含氨芐青霉素抗性基因,在該培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng),也是不能區(qū)分的。在上述篩選的基礎(chǔ)上,若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落,還需使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基;因目的基因插入后,導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因(Tetr)失活,含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌在該培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng),而含有質(zhì)粒載體的則能正常生長(zhǎng)。