徐 藝，姚 月，余 良*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肝膽胰外科，黑龍江 哈爾濱 150001；2.香港大學(xué) 病理學(xué)系，香港 999077)

外泌體是由細(xì)胞分泌至胞外的納米級(jí)囊泡。近年來(lái)，隨著研究逐漸深入，外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞生命活動(dòng)中的“多余物質(zhì)”的偏見(jiàn)逐漸消除[1]。目前，有關(guān)外泌體的“信使”作用、疾病進(jìn)展作用、生物標(biāo)志物作用以及載藥工具等的研究逐漸興起。然而，這些探索是以完成穩(wěn)定、高效、高純度的外泌體分離提取為前提的。這也是當(dāng)前制約該領(lǐng)域進(jìn)展的重要技術(shù)難題。Tang等[2]對(duì)同一樣品實(shí)施不同的提取方案，得到的外泌體中有588個(gè)共存交集的miRNA和200個(gè)僅在各自方案中存在的miRNA，說(shuō)明不同的提取方案所得的外泌體存在純度差異?？陀^上，外泌體的平均直徑、內(nèi)容物、功能及來(lái)源也增加了外泌體提取工作的難度[3]。

目前，普遍認(rèn)為外泌體是通過(guò)內(nèi)體途徑形成的細(xì)胞外囊泡的一個(gè)亞類，直徑約30～150 nm[4]。在電鏡下，外泌體由于在樣本制備過(guò)程中脫水塌陷而呈現(xiàn)出典型的茶托樣形態(tài)，呈扁球狀[4-5]。其表面存在獨(dú)特的跨膜標(biāo)志蛋白CD63，CD9等常用于對(duì)所提取的外泌體進(jìn)行鑒定[6]。依據(jù)外泌體的大小、形態(tài)、表面標(biāo)志物等特征，超速離心法、超濾法、親合法等外泌體提取方法被應(yīng)用在不同研究場(chǎng)景中。本文對(duì)目前主要的外泌體提取方法的基本原理、優(yōu)勢(shì)及缺陷、技術(shù)進(jìn)展等進(jìn)行歸納與總結(jié)，旨在為研究者提供參考借鑒。

1 超速離心法

Johnstone等[7]首次在網(wǎng)織紅細(xì)胞培養(yǎng)基中提取外泌體時(shí)采用了超速離心法。經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，目前超過(guò)80%的研究者選擇超速離心法提取外泌體[8]。超速離心法以不同的離心力或離心時(shí)間循環(huán)，逐步淘汰較大的顆粒，最終得到底部沉淀的外泌體，主要分為2個(gè)步驟，首先以中低速離心去除死亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片、大型囊泡的沉淀，然后以100 000 g離心分離得到外泌體沉淀[9]。超速離心法因不受分離試劑污染，外泌體獲取量較大，方法相對(duì)成熟而受青睞。但是此方法的重復(fù)性較差，外泌體易結(jié)塊，且可能造成外泌體損傷[10]。增加離心時(shí)間會(huì)顯著增加外泌體的獲取量，但當(dāng)時(shí)間超過(guò)4 h后，外泌體的完整性會(huì)被破壞，并且可溶性蛋白雜質(zhì)含量會(huì)升高[11]。

2 密度梯度離心法

密度梯度離心法可視為更精確的超速離心法。當(dāng)沉降系數(shù)差別不顯著時(shí)，超速離心法效果不好，此時(shí)密度梯度離心法的優(yōu)勢(shì)突顯。通常以蔗糖為介質(zhì)構(gòu)建由上層液面到底部逐漸增加的密度梯度層，外泌體在離心力作用下最終會(huì)駐留在與之相似的密度層面，一般介于1.10～1.18 g/mL[12]。該方法的優(yōu)勢(shì)在于所得外泌體幾乎不含干擾蛋白，但其原理決定了篩選結(jié)果為某一類密度近似的囊泡，不可避免地會(huì)降低純度[13]。此外，該方法與超速離心法同樣存在設(shè)備昂貴、長(zhǎng)時(shí)間的離心作用影響外泌體的結(jié)構(gòu)與功能等缺點(diǎn)。

3 超濾法/切向流過(guò)濾法

考慮上述提取方法的應(yīng)用限制，超濾法有望起到部分替代作用，即通過(guò)膜孔截留直徑大于200 nm的粒子，漏過(guò)直徑小于20 nm的微小囊泡，并通過(guò)加壓或短時(shí)間低速離心等方式加速此過(guò)程。該方法在處理大量樣本時(shí)有優(yōu)勢(shì)，可通過(guò)設(shè)計(jì)膜孔的直徑來(lái)選擇特定大小的囊泡，常應(yīng)用于超速離心法的輔助環(huán)節(jié)[9,14]，但難以避免外泌體通過(guò)膜孔時(shí)遭受到切割擠壓損傷。切向流過(guò)濾法改進(jìn)了超濾技術(shù)的結(jié)構(gòu)，將樣本液體的主要流動(dòng)方向由垂直于濾過(guò)膜改為平行于濾過(guò)膜，避免了外泌體損傷，同時(shí)最大程度降低了膜孔堵塞，增加了濾膜的使用壽命[15]。通過(guò)循環(huán)反復(fù)過(guò)濾可獲得更高純度的外泌體，可應(yīng)用于外泌體的工業(yè)化制備。Gao等[16]對(duì)比了超濾法與ExoQuick-TC(以聚合物沉淀法為原理的外泌體提取試劑盒)提取脂肪組織的外泌體的質(zhì)量參數(shù)，發(fā)現(xiàn)二者在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖遷移能力方面沒(méi)有明顯區(qū)別，但超濾法所得的外泌體蛋白質(zhì)含量更高。Shu等[17]將超濾法和尺寸排阻色譜聯(lián)合用于色素細(xì)胞瘤細(xì)胞系中提取外泌體。Xiang等[18]為解決尿液外泌體提取時(shí)樣本量稀疏的難題，采用了超濾聯(lián)合親合法(TiO2)，可以在20 min內(nèi)收集高質(zhì)量的外泌體?？傊瑸V法最初由于簡(jiǎn)便快速而受到研究者的關(guān)注，又由于過(guò)濾孔直徑的可設(shè)計(jì)性被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

4 體積排阻色譜

體積排阻色譜法(Size-exclusion Chromatography，SEC)同樣是依據(jù)外泌體的尺徑/體積特性通過(guò)分離基質(zhì)分離不同體積的顆粒，即經(jīng)PBS洗脫后，大體積的分子或顆粒無(wú)法進(jìn)入分離基質(zhì)而直接從快速通道提前流出，而外泌體因體積小可以進(jìn)入既定設(shè)計(jì)的固相分離基質(zhì)中，并在其中移動(dòng)更長(zhǎng)的距離發(fā)生相對(duì)滯留，因而與前者存在流出時(shí)間差，以此分離提取外泌體[19]。其原理已相對(duì)成熟，更新的技術(shù)點(diǎn)主要在于分離基質(zhì)的選擇。Xu等[20]評(píng)估了若干商用SEC分離株提取外泌體的效率，發(fā)現(xiàn)SepharoseCL-4B基質(zhì)的分離效率與分離質(zhì)量最佳。Guo等[21]證實(shí)了SepharoseCL-6B基質(zhì)分離蛋白血清外切體的效果優(yōu)于CL-4B和CL-2B基質(zhì)。此外，值得關(guān)注的是，SEC在提取脂肪細(xì)胞來(lái)源外泌體方面表現(xiàn)突出。由于脂肪細(xì)胞的組織或細(xì)胞上清液富含脂質(zhì)而影響外泌體的密度，常規(guī)的提取方案往往不甚理想，SEV聯(lián)合超速離心可高效率提取脂肪組織或細(xì)胞來(lái)源外泌體[22]。SEV僅受重力作用而移動(dòng)，外泌體結(jié)構(gòu)幾乎不受損傷，所得產(chǎn)物純度高且不受雜質(zhì)影響，最先進(jìn)入外泌體提取試劑盒的商業(yè)化領(lǐng)域。但是，該方法可能摻雜一些尺寸類似的囊泡[23]，同時(shí)也面臨洗脫液對(duì)樣品的稀釋效應(yīng)，需要使用者關(guān)注。

5 親和法

親和法針對(duì)外泌體表面特有的抗原，通常選擇外膜表面的高豐度蛋白(如四跨膜蛋白超家族、ESCRT復(fù)合體相關(guān)蛋白等[24])以固相抗體吸附外泌體表面抗原提取外泌體。從原理上來(lái)看，此方法獲取外泌體的特異性最強(qiáng)[25]，甚至可通過(guò)選擇特殊的抗體對(duì)不同來(lái)源的外泌體加以分選，因此在基于外泌體的疾病診斷平臺(tái)中具有廣闊應(yīng)用前景[26]。Ning等[27]使用該方法通過(guò)抗體與外泌體表面蛋白CD81相互作用，直接從血漿中提取外泌體，在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)在SARS-CoV-2 感染1 d后即可通過(guò)血漿外泌體檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果。Nakai等[28]利用親合法以外泌體結(jié)合分子Tim4蛋白分離外泌體，將固定在磁珠上的Tim4與外泌體表面的磷脂酰絲氨酸從樣品中提取出來(lái)。該方案的提取效率顯著高于超速離心法。研究表明，在提取血清外泌體時(shí)可獲取同樣的RNA量[29]。相對(duì)于超速離心法，親合法只需要其總樣本量的1/6，耗時(shí)僅為其1/16[30]。但是，外泌體的生物學(xué)功能是否受抗體影響有待進(jìn)一步探討，且獲取的外泌體的保存條件比較苛刻，限制了其廣泛應(yīng)用。

6 聚合物的共沉淀法

聚合物的共沉淀法又稱“沉淀法”，其原理為通過(guò)聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)“劫持”外泌體表面的水分子，降低外泌體溶解度，從而易于沉降分離[31]。該方法最早用于提取病毒，因外泌體與病毒大小相似而沿用至今[32]。樣品需首先與分子量為8 000 Da的PEG在4 ℃下孵育8～16 h，然后以低速離心或者過(guò)濾的方式完成提取。該方法操作簡(jiǎn)單，獲取率非常高，對(duì)樣本的體積量幾乎沒(méi)有要求，因此在各類研究中的適用性高[29]。Coughlan等[33]探究了超速離心法和聚合物共沉淀法提取人血漿外泌體的效率，發(fā)現(xiàn)后者的速度為前者的6倍，等體積下產(chǎn)量為前者的2.5倍。許多商業(yè)化的外泌體提取試劑盒采用該原理進(jìn)行外泌體收集，如System Biosciences (Palo Alto, CA, USA)公司的外泌體快速提取試劑盒(ExoQuickTM)等。沉淀法所得外泌體的純度較低，原因是一些可溶蛋白以及其他的細(xì)胞外囊泡的表面也存在水分子，在該技術(shù)路線下可能污染最終提取的外泌體。Martínez-Greene J等[34]創(chuàng)建了共沉淀法與SEC聯(lián)合應(yīng)用的工作流程，提高了外泌體提取的純度與數(shù)量，說(shuō)明共沉淀法聯(lián)合其他方案具備更好的臨床應(yīng)用前景。

7 結(jié)束語(yǔ)

外泌體活躍于細(xì)胞間，廣泛參與病理生理過(guò)程。目前，外泌體的生成、靶細(xì)胞攝取外泌體等過(guò)程尚未完全揭示，已知的外泌體的功能與調(diào)控機(jī)制可能僅是“冰山一角”。甚至在稍早一些的研究中，“外泌體”這一名詞的使用存在不規(guī)范之處，并未與凋亡小體等囊泡完全區(qū)分。與其他領(lǐng)域研究不同的是，外泌體研究的第一步——提取外泌體必須穩(wěn)定、精確，但尚無(wú)一種可以勝任所有研究或應(yīng)用場(chǎng)景的外泌體提取方案。最理想的技術(shù)方案應(yīng)該是高純度、無(wú)損傷、低成本的，甚至能滿足不同種類細(xì)胞外囊泡的篩選。顯然，目前的技術(shù)方案仍在朝著這個(gè)方向努力，外泌體的標(biāo)準(zhǔn)化提取流程仍在不斷改進(jìn)。這對(duì)穩(wěn)定控制外泌體質(zhì)量以及精準(zhǔn)計(jì)算外泌體的定量，確切分析外泌體在細(xì)胞間通信的作用至關(guān)重要。