張 凱,蘭素缺,金京京,張穎君,彭曉慧,李杏普,張業(yè)倫

(河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所/河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室,河北石家莊 050035)

利用矮稈基因調(diào)節(jié)株高是培育高產(chǎn)小麥品種的重要途徑[1],同時(shí),矮稈基因還可以提高小麥的抗倒伏能力、抗旱性和產(chǎn)量[2-3]。小麥矮稈基因大致分為三類:D-草叢型矮生基因、Us -單莖矮生基因和Rht基因[4]。目前,已被發(fā)掘并命名的矮稈基因有24個。其中,被廣泛應(yīng)用的矮稈基因主要是來自農(nóng)林10號和赤小麥的Rht1(Rht-B1b)、Rht2(Rht-D1b)和Rht8、Rht9[5-7]。Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因分別位于4BS、4DS和2DL染色體上[8]。Rht-B1b和Rht-D1b基因編碼的DELLA蛋白,主要抑制植物對赤霉素(GA)的響應(yīng),但該蛋白并不結(jié)合GA受體蛋白,因此對赤霉素表現(xiàn)為不敏感[9]。Rht8是赤霉素敏感基因,通過調(diào)節(jié)赤霉素合成相關(guān)基因的表達(dá),影響不同活性GA的含量比例,從而降低株高[10]。 Ellis等[11]研究表明,Rht-B1b和Rht-D1b是中等強(qiáng)度降稈基因,兩個基因同時(shí)存在時(shí),存在較強(qiáng)的累加效應(yīng),降稈效應(yīng)可達(dá)40%以上,這兩個基因的降稈效應(yīng)均強(qiáng)于Rht8基因。

矮稈基因的定位與克隆為分子標(biāo)記的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。Peng等[9]利用同源克隆的方法獲得小麥矮稈基因Rht-B1a和Rht-D1a。在此基礎(chǔ)上,Ellis等[11]開發(fā)了STS標(biāo)記BF/MR1、BF/WR1、DF1/MR2和DF2/WR2,分別用于檢測矮稈基因Rht-B1b、Rht-B1a、Rht-D1b和Rht-D1a。為了提高檢測效率,Rasheed等[12]和Wu等[13]分別開發(fā)了KASP和STARP標(biāo)記,用于檢測Rht-B1a和Rht-D1a基因型。Korzun等[14]和Debora等[10]分別開發(fā)了Rht8基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記Xgwm261和側(cè)翼標(biāo)記DG279、DG371,可用于檢測Rht8基因。熊宏春等[15]將Rht8基因精細(xì)定位于分子標(biāo)記 INDEL-2005 和 SSR-2650 之間,并開發(fā)了分子標(biāo)記CAPS-Rht8。分子標(biāo)記的開發(fā)為分子標(biāo)記輔助選擇育種以及矮稈基因的高效應(yīng)用提供了便利的檢測方法。

目前,中國北部冬麥區(qū)大部分小麥品種株高為75～80 cm,南部冬麥區(qū)為85～95 cm,已接近最適株高[16]。然而,矮稈基因在不同麥區(qū)分布多樣化且無規(guī)律性,不同麥區(qū)間生態(tài)環(huán)境和栽培條件也差異較大,小麥品種的矮稈基因類型及產(chǎn)量性狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)也不明確,給育種親本選配和矮稈基因的高效利用造成困擾。因此,本研究利用STS分子標(biāo)記BF/MR1、BF/WR1、DF1/MR2和DF2/WR2以及微衛(wèi)星標(biāo)記Xgwm261,對不同生態(tài)區(qū)近十年來育成的237份秋播冬小麥品種進(jìn)行Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因檢測,并分析三個基因的分布情況以及與株高和產(chǎn)量相關(guān)性狀的關(guān)系,以期為育種親本選配提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料共237份,其中黃淮冬麥區(qū)121份、北部冬麥區(qū)57份、西南冬麥區(qū)41份、長江中下游冬麥區(qū)17份、新疆冬春麥區(qū)1份,大部分為2010年后育成的品種。分別于2019-2020和2020-2021年度在河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所堤上試驗(yàn)站,按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每份材料種植5行,每行4 m,株距5 cm,行距25 cm。

1.2 基因組DNA的提取

每份材料選取兩粒具有代表性的種子,用鋼珠打碎后,參照TPS法[17]提取基因組DNA。用核酸定量儀(Nano Drop 2000)檢測DNA濃度,將DNA原液稀釋至100 ng·μL-1后,保存于 -20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 矮稈基因的分子標(biāo)記檢測

利用Ellis 等[11]設(shè)計(jì)的四對STS分子標(biāo)記BF/MR1、BF/WR1、DF1/MR2和DF2/WR2檢測Rht-B1和Rht-D1基因(表1),其中BF/MR1與BF/WR1為一對互補(bǔ)引物,分別用于檢測Rht-B1b和Rht-B1a;DF1/MR2與DF2/WR2也為一對互補(bǔ)引物,分別用于檢測Rht-D1b和Rht-D1a,以石4185(含有Rht-B1b基因)和鄭麥7698(含有Rht-D1b基因)為陽性對照。用Korzun等[10]設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星標(biāo)記Xgwm261檢測Rht8基因,以石4185為陽性對照。PCR反應(yīng)體系均為10 μL,包括模板DNA 2 μL,2×SanTaq PCR Mix 預(yù)混液5 μL,上、下游引物(濃度為0.025 nmol·μL-1)各0.3 μL,用滅菌雙蒸水補(bǔ)至 10 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55～63 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。Rht-B1和Rht-D1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠(含Gold View染料)進(jìn)行檢測,在凝膠成像儀下觀察并拍照記錄。Rht8基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行檢測,銀染顯色,拍照記錄。

表1 本研究所用的分子標(biāo)記信息

1.4 小麥株高和產(chǎn)量性狀調(diào)查

于2020和2021年小麥灌漿中后期,每份材料選取10個單株測量株高,同時(shí)隨機(jī)調(diào)查10個麥穗的穗長。于2020和2021年小麥成熟期,用萬深SC-G自動考種儀統(tǒng)計(jì)千粒重、粒長和粒寬;人工調(diào)查單位面積穗數(shù),收獲后稱重測產(chǎn);隨機(jī)選取10個麥穗,調(diào)查穗粒數(shù)。所有測量指標(biāo)均取2年的平均值作為最終調(diào)查結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rht-B1b、 Rht-D1b和 Rht8基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果及其分布頻率

檢測結(jié)果表明,發(fā)現(xiàn)237份供試材料中,僅含Rht-B1b(突變型)的材料有17份,占比7.2%;含Rht-B1b并同時(shí)含其他矮稈基因的材料有22份,占比9.3%(圖1和表2);僅含Rht-D1b(突變型)的材料有63份,占比26.6%;含Rht-D1b并同時(shí)含其他矮稈基因的材料有50份,占比21.1%(圖2和表2);僅含Rht8的材料有39份,含Rht8并同時(shí)含其他矮稈基因的材料有65份,分別占 16.5%和27.4%(圖3和表2)。

M:DL1200;a: Rht-B1a;b: Rht-B1b;1:冀麥449;2:農(nóng)大5695;3:濟(jì)麥32;4:榮華901;5:石4185(CK)。

M:DL1200;a: Rht-D1a;b: Rht-D1b;1:新麥36;2:鄭麥7698(CK);3:洛麥27;4:蜀麥1628;5:華1168。

從矮稈基因在不同冬麥區(qū)的分布頻率來看,Rht-B1b在西南冬麥區(qū)的分布頻率最高,其次是在北部冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū),在黃淮冬麥區(qū)分布頻率最低;Rht-D1b在長江中下游冬麥區(qū)的分布頻率最高,其次是在黃淮冬麥區(qū)和北部冬麥區(qū),在西南冬麥區(qū)分布頻率最低;Rht8在各冬麥區(qū)均有分布,在長江中下游冬麥區(qū)分布頻率最高,其次是在北部冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū),西南冬麥區(qū)分布頻率最低(表2和表3)。

(續(xù)表2 Continued table 2)

矮稈基因及其組合在所有麥區(qū)(由于新疆冬春麥區(qū)只有1份小麥材料,未進(jìn)行統(tǒng)計(jì))的分布頻率由高到低依次為Rht-D1b(26.7%);Rht-D1b+Rht8(18.2%);Rht8(16.5%);Rht-B1b(7.2%);Rht-B1b+Rht8(6.8%);Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8(2.1%);Rht-B1b+Rht-D1b(0.4%)。Rht-B1b在西南冬麥區(qū)的分布頻率最高,為 24.4%;Rht-D1b在黃淮冬麥區(qū)的分布頻率最高,為32.2%;Rht8在各麥區(qū)分布頻率相當(dāng),在14.9%～19.5%之間;Rht-B1b+Rht8在北部冬麥區(qū)分布頻率最高,為12.3%;Rht-B1b+Rht-D1b僅在黃淮冬麥區(qū)有分布,在其他麥區(qū)未檢測到該聚合類型。Rht-D1b+Rht8在長江中下游冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)分布頻率較高,分別為 23.5%和 22.3%;Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8在長江中下游冬麥區(qū)分布頻率最高,為5.9%,在西南冬麥區(qū)未檢測到該聚合類型。此外,供試材料中有22.0%的材料均未檢測到Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8,西南麥區(qū)的分布頻率最高,達(dá) 31.7%(表3)。

表3 矮稈基因 Rht-B1b、 Rht-D1b和 Rht8及其組合在不同麥區(qū)的分布頻率

2.2 Rht-B1b、 Rht-D1b和 Rht8與株高及產(chǎn)量性狀的相關(guān)性

不含目標(biāo)基因的小麥株高最高,與Rht-D1b+Rht8和Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8基因型小麥差異顯著;Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8基因型小麥的株高最低,與Rht-B1b+Rht8和Rht-D1b+Rht8基因型小麥差異不顯著。不同矮稈基因型的降稈效果表現(xiàn)為Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8;Rht-D1b+Rht8;Rht-B1b+Rht8;Rht-D1b;Rht-B1b;Rht8(表4和表5)。Rht-D1b+Rht8基因型小麥的穗長最短,與其他基因型以及不含目標(biāo)基因的小麥差異顯著。Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8基因型小麥的粒寬最大,顯著大于Rht-B1b、Rht-B1b+Rht8基因型以及不含目標(biāo)基因的小麥。Rht-B1b+(Rht-D1b+)Rht8基因型小麥的千粒重最大,顯著高于Rht-B1b、Rht-B1b+Rht8基因型小麥。所有基因型及不含目標(biāo)基因的小麥的粒長和穗粒數(shù)均無顯著差異(表4)。由于Rht-B1b+Rht-(D1b+Rht8)種質(zhì)只有5份,結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

表4 Rht-B1b、 Rht-D1b和 Rht8及其組合對株高及產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響

表5 矮稈基因 Rht-B1b、 Rht-D1b和 Rht8 及其組合的降稈效應(yīng)

3 討 論

3.1 矮稈基因的分布頻率

本研究供試237份材料中,含有Rht-D1b、Rht-B1b和Rht8基因的材料占所有供試材料的 78.0%,可見,Rht-D1b、Rht-B1b和Rht8雖占據(jù)中國冬小麥矮稈基因的主導(dǎo)地位,但仍有一些其他矮稈基因在生產(chǎn)中得到一定規(guī)模應(yīng)用。在本研究矮稈基因不明確的材料中,多數(shù)植株株高低于75 cm,屬于矮稈種質(zhì),說明含有其他矮稈基因。陳向東等[18]發(fā)現(xiàn)117份國內(nèi)推廣小麥品種及中間種質(zhì)中,矮稈基因的分布頻率為27.4%。周曉變[19]發(fā)現(xiàn)黃淮麥區(qū)主栽品種、歷史品種和農(nóng)家種中,Rht4、Rht9和Rht12基因的分布頻率分別為 66.7%、40.7%和34.6%?？梢?在中國主要冬麥區(qū)中,除了Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8外, 其他矮稈基因分布也較為廣泛。

本研究中Rht-D1b和Rht8基因的分布頻率分別為47.9%和44.1%,而Rht-B1b的分布頻率僅為16.5%,說明Rht-D1b和Rht8應(yīng)用更廣泛。楊松杰[4]和周 陽等[20]研究表明,Rht-D1b和Rht8基因在中國小麥的分布頻率分別為47.5%和 43.9%,與本研究研究結(jié)果基本一致。

3.2 不同麥區(qū)矮稈基因型的分布及其與產(chǎn)量性狀的關(guān)系

不同麥區(qū)間矮稈基因型的分布頻率存在明顯的差異。黃淮冬麥區(qū)主要以Rht-D1b(32.2%)、Rht8(14.9%)和Rht-D1b+Rht8(22.3%)為主?？梢?黃淮冬麥區(qū)更偏好使用Rht-D1b,其次是Rht8。周 陽等[21]和楊松杰[4]也發(fā)現(xiàn)該麥區(qū)Rht-D1b的分布頻率高。曹廷杰等[21]和慕美財(cái)?shù)萚22]認(rèn)為,這是由于Rht-D1b在黃淮冬麥區(qū)的小麥種質(zhì)中已被固定所致。北部冬麥區(qū)矮稈基因型主要以Rht-D1b(24.6%)、Rht8(15.8%)和Rht-D1b+Rht8(17.5%)為主,西南冬麥區(qū)主要以Rht-B1b(24.4%)、Rht-D1b(19.5%)和Rht8(19.5%)為主,長江中下游冬麥區(qū)主要以Rht-D1b(17.6%)、Rht8(17.6%)和Rht-D1b+Rht8(23.5%)為主。其中,西南冬麥區(qū)是所有麥區(qū)中種植密度最低的生態(tài)區(qū),植株個體發(fā)育健壯不易倒伏,不需要聚合多個矮稈基因降低株高來規(guī)避倒伏風(fēng)險(xiǎn),并且以此來獲得更高生物量和產(chǎn)量。此外,Rht-B1b基因在西南冬麥區(qū)的分布頻率明顯高于其他麥區(qū),且具有比其他基因型更高的穗粒數(shù)和較低的單位面積穗數(shù),這也正是西南冬麥區(qū)小麥群體的產(chǎn)量結(jié)構(gòu)特征。說明矮稈基因在不同生態(tài)區(qū)的分布與矮源產(chǎn)量結(jié)構(gòu)特征和生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)。

本課題組研究也發(fā)現(xiàn),黃淮冬麥區(qū)、西南冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)矮稈基因Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8野生型與突變型之間的產(chǎn)量因子差異均不顯著(數(shù)據(jù)未提供),表明不同矮稈基因與產(chǎn)量因子間并不存在相關(guān)性。顯著性分析發(fā)現(xiàn),黃淮冬麥區(qū)單位面積穗數(shù)最高,北部冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)千粒重較高,而這三個麥區(qū)Rht-D1b基因的分布頻率分別為57.0%、45.6%和47.0%,Rht8基因的分布頻率分布為43.0%、54.4%和58.8%;西南冬麥區(qū)的穗粒數(shù)最高,Rht-B1b基因的在該麥區(qū)的分布頻率為26.8%?？梢?小麥植株具有所在生態(tài)區(qū)的產(chǎn)量結(jié)構(gòu)特征,與矮稈基因本身無關(guān)。因此,各生態(tài)區(qū)矮稈基因的使用偏好性可能與矮稈基因被固定的先后順序有關(guān),越早在某個生態(tài)區(qū)被固定的矮稈基因,其攜帶者越早具有該生態(tài)區(qū)的產(chǎn)量結(jié)構(gòu)特征,故被利用的機(jī)率和分布頻率也就越高,從而造成矮稈基因與產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)的遺傳假象。

3.3 Rht-B1b、 Rht-B1b和 Rht8及其組合對株高的影響

不同矮稈基因型的降稈效果從強(qiáng)到弱依次為:Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8;Rht-D1b+Rht8;Rht-B1b+Rht8;Rht-D1b;Rht-B1b;Rht8。這與Tang 等[23]和馮 潔等[24]的研究結(jié)果一致。但Rht-B1b、Rht-B1b和Rht8單獨(dú)應(yīng)用時(shí),降稈效果不顯著。Rht8只有與Rht-D1b聚合(Rht-D1b+Rht8和Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8)株高才顯著降低,而與Rht-B1b聚合時(shí)差異不顯著。同時(shí),三個矮稈基因聚合類型(Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8)的株高顯著低于僅含單個基因的株高,表明不同矮稈基因聚合時(shí),降稈效果存在累加效應(yīng),并且Rht-D1b的降稈效果優(yōu)于Rht-B1b,這與Sheoran等[25]和Robbins等[26]的研究結(jié)果基本一致。

總之,Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8是中國小麥矮稈基因的主要類型。雖然Rht-D1b和Rht8基因型小麥總體上具有較高的千粒重和單位面積穗數(shù),Rht-B1b基因型小麥具有較高的穗粒數(shù),但矮稈基因本身與產(chǎn)量因子間無顯著相關(guān)性。矮稈基因聚合時(shí)降稈效果存在累加效應(yīng),且Rht-D1b的降稈效果優(yōu)于Rht-B1b。