解宸一 楊亞楠 王碩 趙萬東 呂志遠(yuǎn) 宋靜宜 何寧寧

［摘要］ 目的 探討生長因子受體結(jié)合蛋白2（GRB2）基因在腎癌中的表達(dá)及其對患者預(yù)后的影響。方法挖掘ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中腎癌GRB2基因相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)分析，結(jié)合在TCGA數(shù)據(jù)庫中挖掘的GRB2基因在腎癌組織和正常組織中的表達(dá)差異，獲得GRB2基因的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。并通過STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建GRB2基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。采取實(shí)時熒光定量PCR的方法檢測6例腎癌組織及其癌旁正常組織中GRB2基因的相對表達(dá)量。結(jié)果 與正常腎組織相比，GRB2基因在腎癌組織中的表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.21，P<0.05），GRB2基因在腎癌組織中的表達(dá)升高與腎癌患者預(yù)后相關(guān)（z=2.71，P<0.05）。進(jìn)一步對GRB2相關(guān)的14個相互作用蛋白進(jìn)行分析顯示，GRB2主要參與了細(xì)胞的增殖和凋亡過程。腎癌組織中GRB2基因相對表達(dá)量顯著高于其癌旁正常組織（t=6.98，P<0.001）。結(jié)論 GRB2基因在腎癌組織中高表達(dá)，且其基因表達(dá)水平與腎癌患者的預(yù)后明顯相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 腎腫瘤；GRB2銜接蛋白質(zhì)；預(yù)后；基因表達(dá)譜；蛋白質(zhì)相互作用圖；數(shù)據(jù)庫，遺傳學(xué)；數(shù)據(jù)挖掘

［中圖分類號］ R737.11? ? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［ABSTRACT］ Objective To investigate the expression of the growth factor receptor-bound protein-2 （GRB2） gene in renal carcinoma and its influence on prognosis.? Methods The ONCOMINE database was used to obtain the data on the expression of the GRB2 gene in renal carcinoma， and the TCGA database was used to analyze the difference in the expression of the GRB2 gene between renal carcinoma tissue and normal tissue， as well as the association between the expression of the GRB2 gene and the prognosis of patients. The STRING database was used to construct the protein-protein interaction network of the GRB2 gene. Quantitative real-time PCR was used to measure the relative expression level of the GRB2 gene in six renal carcinoma tissue samples and corresponding adjacent normal tissue samples.? Results The expression of the GRB2 gene in renal carcinoma tissue was significantly higher than that in normal renal tissue （t=8.21，P<0.05）， and the increased expression of the GRB2 gene in renal carcinoma tissue was associated with the prognosis of renal carcinoma （z=2.71，P<0.05）. Further analysis of the 14 GRB2-related interacting proteins showed that GRB2 was mainly involved in cell proliferation and apoptosis. The relative expression level of the GRB2 gene in renal carcinoma tissue was significantly higher than that in the corresponding adjacent normal tissue （t=6.98，P<0.001）.? Conclusion The GRB2 gene is highly expressed in renal carcinoma tissue， and its expression level is significantly asso-ciated with the prognosis of patients with renal carcinoma.

［KEY WORDS］ Kidney neoplasms; GRB2 adaptor protein; Prognosis; Gene expression profiling; Protein interaction maps; Databases， genetic; Data mining

腎癌是一種常見的致死性泌尿系統(tǒng)疾病[1]，發(fā)病人群主要集中在50～60歲[2]，并且男性更為多發(fā)，約為女性發(fā)病率的2倍[3]。由于多數(shù)腎癌被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于晚期，失去了最佳的治療時機(jī)，故而早期發(fā)現(xiàn)、早期治療非常重要。

生長因子受體結(jié)合蛋白2（GRB2）是一種在細(xì)胞中廣泛表達(dá)的銜接蛋白，作為細(xì)胞信號通路的重要節(jié)點(diǎn)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的眾多信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4-5]。GRB2高表達(dá)可影響生長因子家族成員的激活，促進(jìn)癌細(xì)胞 DNA 擴(kuò)增，導(dǎo)致患者癌細(xì)胞擴(kuò)散或者轉(zhuǎn)移風(fēng)險的增加[6-7]。研究證明，GRB2主要在MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起作用，通過級聯(lián)Ras-Raf-MAPKK-MAPK通路，調(diào)控細(xì)胞增殖和分化[8-11]。這些信號通路的活動對正常個體發(fā)育及成熟穩(wěn)定是至關(guān)重要的，當(dāng)這些通路存在異?；蚴艿礁蓴_時易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12-13]。既往研究顯示GRB2基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]，但關(guān)于GRB2基因在腎癌中表達(dá)的情況尚不清楚。

本研究利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫分析人GRB2基因在腎癌患者中的表達(dá)情況，通過建立GRB2的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，挖掘與腎癌密切相關(guān)的重要蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步研究GRB2基因在腎癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制提供線索和思路。

1 材料和方法

1.1 檢索GRB2基因在所有腫瘤類型中表達(dá)情況

利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫（https：//www.oncomine.org，版本4.5）檢索GRB2基因在腫瘤患者中表達(dá)的研究數(shù)據(jù)，檢索條件設(shè)定為：①P<0.05;②倍數(shù)變化≥1.5;③使用全部的基因排序，記錄GRB2在20種腫瘤中的表達(dá)情況。

1.2 比較GRB2基因在正常組織和腎癌組織中的差異表達(dá)情況

利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫檢索GRB2在正常腎組織和腎癌組織中表達(dá)的所有研究數(shù)據(jù)，進(jìn)行匯總分析后，篩選出GRB2在正常組織和腎癌組織中的差異表達(dá)情況。

1.3 分析GRB2表達(dá)與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系

登錄cBioportal在線分析工具（www.cBioportal.org）中的TCGA數(shù)據(jù)庫，研究類型選擇為“腎癌”，基因資料（閾值設(shè)定為2.0）為“mRNA Expression z-score”，檢索詞為“基因GRB2”，結(jié)果輸出時選擇“Survival”，繪制Kaplan-Meier生存曲線。根據(jù)Kaplan-Meier分析中基因表達(dá)量的中位數(shù)進(jìn)行分組，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，用以分析GRB2基因表達(dá)和腎癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.4 構(gòu)建GRB2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫STRING（https：//string-db.org/），以“實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)”作為證據(jù)來源，構(gòu)建GRB2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。對篩選出的互作蛋白再通過KEGG通路分析預(yù)測其生物學(xué)功能。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測腎癌及其癌旁正常組織中GRB2的表達(dá)

選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院2020年1月—2022年12月確診為腎癌的6例患者手術(shù)切除的癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本各100 mg，加入1 mL的Trizol試劑，研磨成組織勻漿以后提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取cDNA，GRB2基因以及內(nèi)參照基因GAPDH的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（GRB2正向引物：5′-CCTGGACTTAGC-ATTGTGAG-3′，反向引物：5′-TTATCATCAGC-AGGGAGAGC-3′；GAPDH正向引物：5′-GGTT-GTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向引物：5′-TGGT-CCAGGGTTTCTTACTCC-3′）。利用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用2－△△CT法計算基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取均值。本研究通過了青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會審批（QDU-HEC-2022250）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

正常組織與腎癌組織GRB2基因表達(dá)比較采用t檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法計算GRB2基因表達(dá)與腎癌預(yù)后的關(guān)系。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 GRB2基因在所有類型腫瘤中的表達(dá)情況

在ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中共檢索到GRB2基因在不同類型腫瘤中表達(dá)情況的研究結(jié)果446個，其中有80個研究結(jié)果顯示GRB2基因在乳腺癌、白血病、淋巴癌、頭頸部癌等腫瘤組織中高表達(dá)，29個結(jié)果顯示GRB2基因在白血病和淋巴癌等腫瘤組織中低表達(dá)（圖1）。圖中藍(lán)色方框中數(shù)字表示顯著低表達(dá)的研究結(jié)果數(shù)量，紅色方框中數(shù)字表示顯著高表達(dá)研究結(jié)果數(shù)量。在ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中，檢索到9個關(guān)于GRB2在正常組織和腎癌組織表達(dá)的研究結(jié)果，共包含376例樣本。其中在腎癌的統(tǒng)計結(jié)果中，有7個結(jié)果顯示GRB2基因在腎癌組織中高表達(dá)（R2=2.65，P<0.05）。見圖1。

2.2 GRB2在正常組織和腎癌組織中的表達(dá)情況比較

進(jìn)一步對ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中的GRB2基因在正常腎組織和腎癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。其中腎癌（腎乳頭狀腎細(xì)胞癌）組織中GRB2基因的表達(dá)水平明顯高于正常腎組織（胎兒腎組織或者正常腎組織），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（差異倍數(shù)為1.857，t=8.21，P<0.05）。腎癌（腎透明細(xì)胞癌）組織中的GRB2基因表達(dá)水平也明顯高于正常腎臟組織，且其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（差異倍數(shù)為1.593，t=9.54，P<0.05）。

2.3 GRB2表達(dá)與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系

通過cBioportal在線分析工具中的TCGA數(shù)據(jù)庫，利用Kaplan-Meier生存曲線驗(yàn)證GRB2表達(dá)水平與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，GRB2高表達(dá)組（n=133）患者的生存率低于GRB2低表達(dá)組（n=398），差異具有顯著性（z=2.71，P<0.05）。

2.4 構(gòu)建GRB2的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建GRB2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B類蛋白質(zhì)（CBL）、表皮生長因子受體（EGFR）、人SHC-轉(zhuǎn)化蛋白1（SHC1）、son of sevenless 1（SOS1）和GRB2關(guān)聯(lián)結(jié)合蛋白2（GAB2）5種蛋白與GRB2直接相關(guān)（圖2）。進(jìn)一步對圖2中的GRB2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作蛋白進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與了細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控相關(guān)的通路（ERBB信號通路和EGFR信號通路）。

2.5 GRB2基因在腎癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)量比較

實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，GRB2基因在腎癌組織和癌旁正常組織的相對表達(dá)量分別為3.18±0.55和0.98±0.31，兩者比較差異具有顯著性（t=6.98，P<0.001）。

3 討? 論

腎癌是起源于腎小管上皮的一種惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占成人惡性腫瘤的2%～3%[15]，其最常見的組織病理類型為腎透明細(xì)胞癌[16]，其次為乳頭狀腎細(xì)胞癌[17]。腎癌一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。早期腎癌患者無明顯的癥狀并缺乏經(jīng)典可靠的分子診斷標(biāo)志物，20%～30%的患者就診時已經(jīng)出現(xiàn)癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即晚期腎癌[18]。早期發(fā)現(xiàn)和確診是治療腎癌的關(guān)鍵，特別是對腎癌患者的提前預(yù)測，一直是目前的研究重點(diǎn)。ATKINS等[19]指出腎癌標(biāo)志物的鑒定和驗(yàn)證對于一線治療的選擇和優(yōu)化至關(guān)重要，雖然目前已發(fā)現(xiàn)了包括PD-L1在內(nèi)的多種腎癌標(biāo)志物[20]，但仍有其臨床局限性，如因?yàn)閭€體間的差異，單純的指標(biāo)升高并不能進(jìn)行確診，需要結(jié)合其他相關(guān)檢查與臨床癥狀進(jìn)行全面綜合考慮。因此，發(fā)現(xiàn)有價值的腎癌標(biāo)志物對探討腫瘤成因及評估患者預(yù)后至關(guān)重要。

本研究通過對ONCOMINE數(shù)據(jù)庫的挖掘發(fā)現(xiàn)，GRB2基因在腎癌組織中顯著高表達(dá)。通過對ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中的GRB2基因在正常腎組織和腎癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析顯示，腎癌組織中GRB2基因的表達(dá)水平明顯高于正常腎組織。同時本研究又通過實(shí)時熒光定量PCR方法，對我院的6例腎癌患者的癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行了GRB2基因的檢測，結(jié)果顯示，GRB2基因在腎癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，與ONCOMINE數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果一致，進(jìn)一步提示了GRB2基因與腎癌發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系。

通過TCGA數(shù)據(jù)庫收集GRB2基因表達(dá)水平與腎癌預(yù)后的相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示人GRB2基因高表達(dá)組患者與低表達(dá)組患者的生存率差異具有顯著性。為進(jìn)一步了解GRB2的生物學(xué)功能，我們利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了GRB2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，與GRB2具有直接相互作用關(guān)系的蛋白有GAB2、CBL、EGFR、SHC1和SOS1。其中GAB2在卵巢腫瘤中出現(xiàn)高表達(dá)，并且GAB2在卵巢癌細(xì)胞中通過激活P13K途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移行為[21]。CBL是泛素連接酶CBL家族的重要成員之一，可使靶蛋白泛素化及降解從而調(diào)節(jié)靶蛋白功能。CBL可誘導(dǎo)受體及非受體酪氨酸激酶降解，參與細(xì)胞內(nèi)信號通路的負(fù)調(diào)控，有抑癌作用[22]。EGFR是一種跨膜糖蛋白，是構(gòu)成酪氨酸激酶受體ErbB家族的四個成員之一[23]。研究表明EGFR的生理功能是促進(jìn)上皮組織的發(fā)育和調(diào)節(jié)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。在病理情況下，在多種實(shí)體腫瘤（肺癌、乳腺癌和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤）中存在EGFR基因突變以及EGFR蛋白水平的高表達(dá)或異常表達(dá)，因此可以推測，EGFR可能是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動因素[24]。SHCl又稱SHCA或SHC，屬于SHC蛋白家族，該家族的蛋白在傳遞來自活化的酪氨酸激酶受體信號到下游信號分子中起著極其重要作用[25]。本研究再進(jìn)一步對與GRB2蛋白具有相互作用關(guān)系的蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能分析后發(fā)現(xiàn)，GRB2具有對細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用，參與了ERBB信號通路和EGFR信號通路，與目前的研究結(jié)果一致[26]。

綜上所述，本研究通過對ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中腫瘤基因表達(dá)的深入挖掘，發(fā)現(xiàn)GRB2基因在腎癌中高表達(dá)，且其表達(dá)量與腎癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。同時，GRB2基因可能是通過調(diào)控ERBB以及EGFR信號通路影響細(xì)胞增殖和凋亡促進(jìn)腎癌的發(fā)生和發(fā)展。此將為進(jìn)一步闡明GRB2基因在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定理論基礎(chǔ)，為腎癌的臨床診斷和治療以及尋找可能的藥物靶標(biāo)提供數(shù)據(jù)參考。

作者聲明：何寧寧、解宸一、楊亞楠參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計；何寧寧、解宸一、王碩、趙萬東、呂志遠(yuǎn)、宋靜宜、楊亞楠參與了論文寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強(qiáng)）