遲秀梅 牛俊奇

摘要：HDV感染需要借助HBV的參與，感染后會加速疾病的進展，具有很高的發(fā)展為肝硬化、肝癌等終末期肝病的風(fēng)險。近年來全社會對丁型肝炎的認(rèn)識逐漸增強，一些針對丁型肝炎的治療藥物也成為研究的熱點，伴隨著臨床檢驗手段的逐步完善，對于丁型肝炎的流行病學(xué)調(diào)查開始被研究者重視。針對國內(nèi)HDV感染的具體情況雖已有多項研究，但由于研究隊列小、區(qū)域性強而數(shù)據(jù)偏差較大。本文就目前丁型肝炎流行病學(xué)調(diào)查中的調(diào)查人群及調(diào)查方法檢測指標(biāo)等進行簡要綜述，并對其中的關(guān)鍵問題進行討論，以期未來獲取更準(zhǔn)確的流行病學(xué)資料，能夠更有效地篩查HDV感染者，為臨床早期的干預(yù)和治療提供幫助。

關(guān)鍵詞：δ肝炎病毒; 流行病學(xué); 診斷技術(shù)和方法

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81970519）；?? 吉林省自然科學(xué)基金（YDZJ202201ZYTS016）

Epidemiological screening and detection indicators for hepatitis D and suitable populations

CHI Xiumei1， NIU Junqi2. （1. Gene Therapy Laboratory， Center of Infectious Diseases and Pathogen Biology， The First Hospital of Jilin University， Changchun 130061， China; 2. Department of Hepatology， Center of Infectious Diseases and Pathogen Biology， The First Hospital of Jilin University， Changchun 130021， China）

Corresponding author：NIU Junqi， junqiniu@jlu.edu.cn （ORCID：0000-0001-5415-2024）

Abstract：

Hepatitis D virus （HDV） infection requires the participation of hepatitis B virus （HBV）， which accelerates disease progression after infection and induces a high risk of progression to end-stage liver diseases such as liver cirrhosis and liver cancer. With the gradual increase in the understanding of hepatitis D in the whole society， some therapeutic drugs for hepatitis D have become a research hotspot in recent years， and with the further improvement in clinical testing methods， researchers have started to pay attention to the epidemiological investigation of hepatitis D. Although many studies have been conducted for the specific situation of HDV infection in China， large data deviation is observed due to small cohorts with strong regional features. This article briefly reviews the population， methods， and indicators in the current epidemiological investigation of hepatitis D and discusses related key issues， in order to obtain more accurate epidemiological data， effectively screen out HDV infection， and provide help for early clinical intervention and treatment.

Key words：

Hepatitis Delta Virus; Epidemiology; Diagnostic Techniques and Procedures

Research funding：National Natural Science Foundation of China （81970519）; Natural Science Foundation of Jilin Province （YDZJ202201ZTYS016）

HDV是慢性丁型肝炎的致病因素，其可以與HBV同時感染，也可以繼發(fā)于慢性HBV感染之后，是病毒性肝炎最嚴(yán)重的形式［1］。2017年10月世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)將HDV列入三類致癌物清單。若能早期準(zhǔn)確地篩選未知的HDV感染者，并對丁型肝炎流行病學(xué)有準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，臨床工作者就可以盡早進行干預(yù)，控制病情進展，合理分配醫(yī)療資源，為提高患者生存質(zhì)量作出貢獻。本文就目前丁型肝炎流行病學(xué)調(diào)查中的檢測指標(biāo)和方法及調(diào)查人群等進行簡要綜述，提出部分問題，僅供參考。

1 HDV生命周期

HDV是缺陷病毒，需要借助HBV來完成其生命周期。HDV的包膜蛋白正是HBV的包膜蛋白（HBsAg），HDV與HBV一樣需要借助于肝細胞表面的?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運多肽（NTCP）進入到細胞內(nèi)，在細胞漿中HDV的核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物被釋放，形成HDV基因組和HDV抗原（HDAg）兩部分［2-3］。 HDV的基因組是環(huán)狀單鏈反義RNA（HDV RNA），有8種基因型（HDV1～HDV8），根據(jù)基因型的不同含有1 672～1 697個核苷酸［3-4］，各種分型之間的序列分化度最高是1型和3型［5］，可高達40%。基因組進入到細胞核中首先生成反義基因組RNA（agRNA）和轉(zhuǎn)錄組mRNA，再進行HDV RNA的復(fù)制和產(chǎn)生病毒抗原蛋白。在宿主腺苷脫氨酶1的作用下，agRNA被修飾，從而產(chǎn)出兩種不同的病毒抗原蛋白L-HDAg和S-HDAg［6-8］。這兩種蛋白連接到病毒基因組形成RNP，在細胞漿中利用HBsAg形成包膜，再由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體分泌至細胞外［9］，準(zhǔn)備進行下一次的感染。

通過對HDV感染生命周期的分析可以看出參與HDV感染的兩個必要條件，即HBsAg的存在和HDV的入侵，是否存在HBV DNA可能并不重要。在該生命周期中有HDV RNA和HDAg。人體免疫細胞針對HDV將產(chǎn)生特異性的抗體，包括免疫球蛋白 M（IgM）抗體（抗HDV-IgM）和免疫球蛋白G（IgG）抗體（抗HDV-IgG），這些都將是HDV感染的檢測指標(biāo)。

2 HDV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)

我國在2009年6月實施《丁型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》（衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)號WS300-2008）后至今還沒有正式的丁型肝炎診療指南。單純根據(jù)臨床表現(xiàn)特征進行診斷不準(zhǔn)確，但是可以作為實驗室診斷的線索：（1）HDV流行區(qū)內(nèi)HBsAg攜帶者發(fā)生肝炎。（2）急性乙型肝炎出現(xiàn)血清ALT和膽紅素波動。（3）病情已趨穩(wěn)定的非活動性肝炎患者突然出現(xiàn)活動性肝炎，或慢性乙型肝炎病程中表現(xiàn)進行性惡化。（4）HBV復(fù)制指標(biāo)已降低或消失而臨床表現(xiàn)反見惡化的病例。但是，美國肝病學(xué)會在2018年的乙型肝炎治療指南［10］中明確指出，關(guān)于HDV感染確診決定于HDV組織學(xué)或血清學(xué)標(biāo)志的檢測，必須有血清HDV RNA的檢出。組織學(xué)診斷：肝活檢標(biāo)本肝細胞核內(nèi)HDV（HDAg或HDV RNA）組織染色為陽性。血清中抗HDV-IgM和抗HDV-IgG檢測陽性可以初步判斷已有HDV感染，但仍需要進一步檢測血清HDV RNA［10-12］，若確為陽性才能診斷。

3 HDV篩查的各項檢測指標(biāo)

3.1 抗HDV-IgM/抗HDV-IgG檢測 目前，抗體檢測通常用作HDV感染的主要篩查手段。抗HDV-IgM可在癥狀發(fā)作后2～3周被檢測到，并在急性感染后2個月消失［2，13］，一般用于疾病的早期診斷。然而，慢性丁型肝炎患者在疾病發(fā)作期間抗HDV-IgM也會升高［14］，因此抗HDV-IgM的檢測不能明確區(qū)分急性和慢性HDV感染。當(dāng)慢性HDV感染或HDV重疊感染時，抗HDV-IgG是識別慢性丁型肝炎的主要標(biāo)志?？笻DV-IgG在HDV感染和慢性HDV感染急性緩解患者中均呈陽性，并且在病毒清除后持續(xù)很長時間，雖然難以區(qū)分現(xiàn)癥和既往HDV感染，但仍是進行丁型肝炎初篩時的必要指標(biāo)。鑒于抗HDV-IgM存在時間較短，而抗HDV-IgG在體內(nèi)存在時間較長的優(yōu)勢，因此在篩選過程中進行抗體檢測時建議采用抗HDV-IgG。

抗體檢測普遍公認(rèn)的方法是酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）。ELISA方法檢測HDV抗體時受到許多因素的影響：（1）急性HDV感染時，HDV抗體存在時間很短很難檢出，所以HDV抗體陰性不能否定丁型肝炎的發(fā)生；而慢性HDV感染時，血液中的HDV抗體和抗原形成免疫復(fù)合物，會對檢測結(jié)果造成影響。（2）通常使用間接法檢測抗HDV-IgG，但是容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，不同廠家的試劑盒質(zhì)量參差不齊，抗HDV-IgG與肝細胞受損和炎癥活動密切相關(guān)，因此只能作為臨床HDV感染的初步篩查，明確診斷還需要聯(lián)合血清HDV RNA的檢測結(jié)果才能確診。

由于抗體檢測手段有一定的局限性，很多研究者開始探索更優(yōu)化的檢測方法。例如，目前ELISA試劑盒普遍使用酶催化底物的顯色反應(yīng)，存在靈敏度不高，特異度不強的缺點。對HDAg重新表達和純化，將其固定于固相載體，并且進一步與納米酶顯色技術(shù)相結(jié)合，可進一步提高檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。此外，抗HDV-IgG可以通過定量微陣列抗體捕獲（Q-MAC）方法進行定量檢測，這種定量熒光檢測的方法大大提高了檢測的靈敏度［11，15］。德國海德堡大學(xué)Urban團隊［16］開發(fā)了一種試紙條式快速診斷HDV抗體的試劑。試劑開發(fā)基于一種新型重組肝炎δ抗原，該抗原在所有已知的HDV基因型中具有泛基因型活性。該方法在474例患者樣本隊列中發(fā)現(xiàn)與ELISA方法相比，其靈敏度為94.6%（314/332），特異度為100%（142/142）。因其快速的診斷和便捷的方法，可以預(yù)見該新型HDV快速檢測方法將成為流行病學(xué)研究和臨床診斷的重要工具，特別是在目前缺乏可靠HDV檢測的地區(qū)。

3.2 HDAg檢測 HDAg存在于受感染的細胞內(nèi)和外周，出現(xiàn)比較早，但僅持續(xù)1～2周，由于檢測不及時，往往呈陰性反應(yīng)［17］。檢測血清HDAg，如為陽性，有助于早期診斷。慢性HDV感染時，由于血清中抗HDV-IgG滴度高，HDAg多以免疫復(fù)合物形式存在，游離狀態(tài)的抗原保持在低滴度水平［17-18］。

血清中抗原檢測一般采用免疫酶法或放射免疫法。血清HDAg的檢出有限，在急性感染的前2周可檢測到［17］。放射免疫測定是以放射性核素為標(biāo)志物的標(biāo)記分析法，用于定量檢測受檢標(biāo)本中的抗原。這種檢測方法既具有免疫反應(yīng)的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度，因此能精確測定各種具有免疫活性的極微量的物質(zhì)。但該檢測方法也不乏缺點，由于放射免疫分析是競爭性反應(yīng)，測量值是相對量而非絕對量；另外存在放射線輻射和污染等問題尚不能被廣泛應(yīng)用。肝內(nèi)HDAg可采用免疫熒光法或免疫組化技術(shù)檢測，能夠發(fā)現(xiàn)HDAg位于肝細胞核內(nèi)或位于肝細胞漿中，有利于診斷。也可應(yīng)用免疫印跡法分離HDAg，可檢測到HDAg-P24和HDAg-P27蛋白［19］，方法較為復(fù)雜。但以上方法在臨床應(yīng)用中較少，僅在研究性文章中有所描述。

3.3 HDV RNA檢測 HDV RNA是當(dāng)前診斷HDV感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”［20-21］，HDV RNA陽性是HDV復(fù)制和HDV感染的直接證據(jù)。同時HDV RNA的定量測定也用于監(jiān)測抗病毒治療的應(yīng)答［22-25］。

檢測血清HDV RNA可用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）。RT-PCR方法是實驗室常用的檢測手段。實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）是在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上增加信號系統(tǒng)，以達到對樣品進行實時定量檢測的目的。根據(jù)信號的不同，可分為熒光染料法和探針法［26］。目前，有許多商用試劑盒可用于定量測定HDV RNA。這些技術(shù)旨在靶向編碼HDAg或核酶結(jié)構(gòu)域保守區(qū)域的序列。HDV基因組具有強大的二級結(jié)構(gòu)，可通過在逆轉(zhuǎn)錄步驟前加入熱休克處理來破壞［27］，從而提高逆轉(zhuǎn)錄效率。使用一步法RT-qPCR可降低逆轉(zhuǎn)錄和擴增過程中的污染風(fēng)險［28］。大多數(shù)已發(fā)表的研究［27-28］中使用的標(biāo)準(zhǔn)是HDV質(zhì)粒DNA，但這并不評估逆轉(zhuǎn)錄步驟。其他研究使用體外合成的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)，雖然可以評估逆轉(zhuǎn)錄步驟，但合成的RNA不具有很強的二級結(jié)構(gòu)，HDV基因組的二級結(jié)構(gòu)也會影響病毒的定量［20］。目前RT-PCR檢測靈敏度可以達到103拷貝/μL，巢式PCR檢測下限可以達到10拷貝/μL［21］。盡管RT-PCR檢測具有快速、方便、特異等優(yōu)點，但是HDV RNA中GC含量和互補性高，為HDV擴增帶來了巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)，而且HDV的高度遺傳變異性也使得需要精心設(shè)計其引物和探針。由于HDV RNA的廣泛遺傳變異性，迄今為止尚無完全標(biāo)準(zhǔn)化的PCR檢測技術(shù)。不同實驗室的結(jié)果也不具有可比性。一項對全球12個國家的實驗室進行的綜合分析［12］表明，由于檢測技術(shù)和程序的差異，以及引物或探針設(shè)計的目標(biāo)區(qū)域不同，結(jié)果存在高度異質(zhì)性。因此，有必要建立國際上對HDV RNA進行定量的檢測系統(tǒng)。

RT-qPCR檢測方法已經(jīng)開發(fā)完成。然而，仍需要開發(fā)新的檢測方法，不僅具有較高的靈敏度和特異度，而且可以監(jiān)測HDV RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和定量等一系列過程，從而降低假陰性率，更早地識別丁型肝炎患者，并及時控制HDV傳播。目前針對核酸檢測技術(shù)有了很多新的進展。首先，基于微滴數(shù)字PCR技術(shù)，建立了可以絕對定量丁型肝炎患者體內(nèi)HDV RNA水平的ddPCR技術(shù)檢測方法［20-21］，檢測下限可低至單個拷貝［20］。其次，使用最新的CRISPR/Cas13a檢測技術(shù)建立了對HDV RNA進行精準(zhǔn)、快速的檢測方法，檢測下限分別低至10拷貝/μL和100拷貝/μL。相信經(jīng)過努力，未來研究成果可以投入HDV的臨床應(yīng)用檢測，更有利于HDV感染的早期篩查，為更多的臨床醫(yī)生和患者提供幫助。此外，還需要建立標(biāo)準(zhǔn)化程序，例如樣品類型、提取方法、引物/探針設(shè)計、實驗流程、使用儀器和檢測國際化單位的確定。因此，未來的目標(biāo)是將這一檢測標(biāo)準(zhǔn)化。新的方法如質(zhì)譜和實時生物傳感平臺［11］，可能也會應(yīng)用至對HDV RNA或其成分的監(jiān)測中。

4 HDV篩查人群

美國肝病學(xué)會建議僅對高風(fēng)險人群進行檢測，如HBV/HCV共感染者、HBV/HIV共感染者、乙型肝炎基礎(chǔ)上合并有靜脈吸毒者、高危險性行為者等［10］，而歐洲肝病學(xué)會/亞太肝病學(xué)會則建議對所有HBsAg陽性的肝病患者進行HDV抗體檢測［29-30］。多項Meta數(shù)據(jù)分析及綜述［2，5，11-12，31］都對HDV的流行病學(xué)進行了描述，但文中數(shù)據(jù)差距較大。Rizzetto等［31］分析指出，對HDV低風(fēng)險無癥狀HBsAg攜帶者的調(diào)查并不能反映感染的真實狀況，更應(yīng)該關(guān)注重癥和終末期乙型肝炎患者的HDV合并感染的情況。經(jīng)Meta分析［5］顯示美國和歐洲的HBsAg陽性患者中丁型肝炎患病率分別為2.6%和19.5%。最近的一項研究［32］結(jié)果顯示，在一個涉及1 556例的隊列中整體HDV感染率為15.2%，其中靜脈吸毒者HDV感染率為50.5%。由于北美地區(qū)與歐洲/亞太地區(qū)丁型肝炎感染率的差距明顯，因此美國肝病學(xué)會與歐洲肝病學(xué)會/亞太肝病學(xué)會的建議不一致。我國因HBV感染人群基數(shù)較大，對于重點人群應(yīng)做到應(yīng)檢盡檢，對于普通HBsAg陽性人群則可以根據(jù)具體情況選擇性篩查。關(guān)于優(yōu)化篩選人群，可以參考患者已知的HBsAg定量和HBV定量兩項指標(biāo)確定是否有必要進行丁型肝炎的篩查。本團隊研究（未發(fā)表數(shù)據(jù)）吉林省共計5 594例乙型肝炎患者進行抗HDV-IgG檢測，發(fā)現(xiàn)抗HDV-IgG陽性者中71%其HBsAg定量＞250 IU/mL，93%抗HDV-IgG陽性患者的HBV DNA定量＜2 000 IU/mL。城鎮(zhèn)居民對于健康意識較強，可能會主動進行體檢或篩查。而對于很多農(nóng)村地區(qū)、醫(yī)療資源不足的地區(qū)以及體檢意識較弱的大眾群體，疾控部門應(yīng)該有組織地對這些人員進行篩查。為了更有效地發(fā)現(xiàn)潛在的丁型肝炎患者，又能最大限度地節(jié)約資源，筆者建議篩查的主要對象應(yīng)該針對高危人群和已知的乙型肝炎患者（HBsAg＞250 IU/mL和/或HBV RNA＜2 000 IU/mL），做到應(yīng)檢盡檢。雖然這種篩查人員的選擇可能遺漏部分可能的HDV感染者，但是能夠更高效地利用醫(yī)療資源。此外，還可以根據(jù)個人意愿及臨床癥狀等隨時進行丁型肝炎的檢測，做到愿檢盡檢，多方共同參與，盡可能完成完善的丁型肝炎篩查工作。

5 小結(jié)

綜上所述，結(jié)合我國目前的臨床和試劑檢測等各方面的條件，在既有效又節(jié)約資源的前提下，為進一步了解HDV感染的總體情況，掌握基本可靠的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，除對重癥和終末期乙型肝炎患者及時進行HDV檢測外，普通大眾可以僅對已知HBsAg＞250 IU/mL和/或HBV RNA＜2 000 IU/mL的患者，進行抗HDV-IgG檢測。對于抗HDV-IgG陽性者根據(jù)臨床表現(xiàn)和抗體檢測光密度值判斷是否有進行HDV RNA檢測確診的必要。丁型肝炎篩查流程總結(jié)見圖1。

圖1 丁型肝炎篩查流程圖

Figure 1 Hepatitis D screening flowchar

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：遲秀梅負(fù)責(zé)查閱文獻，收集資料，撰寫文稿；牛俊奇負(fù)責(zé)擬定寫作思路，修改審閱文稿及最后定稿。

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收稿日期：

2023-02-09；錄用日期：2023-03-09

本文編輯：葛俊