劉玉婷 唐志慧 賓瓊

關(guān)鍵詞：肝豆?fàn)詈俗冃? 高通量核苷酸序列分析; ATP7B基因

基金項目：廣西自然科學(xué)基金（2018JJB140029）;? 廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點學(xué)科項目

A case of hepatolenticular degeneration caused by ATP7B p.Ser1369Tyrfs*24 mutation

LIU Yuting， TANG Zhihui， BIN Qiong. （Department of Pediatrics， The Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guilin， Guangxi 541001， China）

Corresponding author：

BIN Qiong， binqiong1386@126.com （ORCID：0000-0002-0555-4219）

Key words：

Hepatolenticular Degeneration; High-Throughput Nucleotide Sequencing; ATP7B Gene

Research funding：

Natural Science Foundation of Guangxi Province （2018JJB140029）; Guangxi Medical and Health Key Disciplines

肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson?。╓ilsons disease， WD），是由一種銅代謝障礙所致的常染色體隱性遺傳病，其發(fā)病機制主要是位于第13號染色體長臂（13q14.3～q21.1）上的ATP7B基因突變，導(dǎo)致ATP7B蛋白功能障礙引起銅排泄障礙，進(jìn)而造成銅大量沉積于組織器官，尤以肝臟、大腦多見［1］。目前WD全球患病率為1/5 000～1/30 000，ATP7B突變基因攜帶率為1/90［2-3］，該疾病主要通過血清銅藍(lán)蛋白、24 h尿銅、青霉胺負(fù)荷試驗、肝細(xì)胞含銅測定及基因測序等檢查進(jìn)行輔助診斷［1］。WD是一種早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可有效遏制疾病進(jìn)展、預(yù)后良好的遺傳性疾病，因此早期診斷和治療可大大減少該病的致殘率及死亡率。本文通過對先證者及其家系的基因檢測并結(jié)合相關(guān)輔助檢查，明確了患兒及其胞兄WD的診斷，進(jìn)一步豐富了ATP7B基因突變譜。

1 病例資料

先證者，患兒男性，5歲3月齡，1年前因體檢發(fā)現(xiàn)肝功能異常，未予處理。于2021年11月以“發(fā)現(xiàn)肝功能異常1年”為主訴至本院兒科住院。查體：肝肋下4 cm可觸及，質(zhì)韌，邊鈍，無壓痛，余無特殊。完善WD相關(guān)檢查：肝功能示總膽紅素4.95 μmol/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶180.59 U/L，天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶119.6 U/L；銅藍(lán)蛋白5.9 mg/dL；24 h尿銅92.7 μg；頭顱MRI未見明顯異常；腹部MRI提示脂肪肝，肝肋下4 cm；眼部檢查提示雙眼上方角鞏膜緣見血管翳，下方角鞏膜緣見少量色素沉著，裂隙燈檢查未見明顯角膜色素環(huán)（K-F環(huán)）；其余檢查：凝血功能示纖維蛋白原1.71 g/L；凝血因子檢測示多種凝血因子活性降低，其中凝血因子Ⅱ活動度54.5%，凝血因子Ⅸ活動度60.3%，凝血因子Ⅹ活動度65.1%，凝血因子Ⅺ活動度62.9%；肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒核酸、自身免疫性肝病相關(guān)檢查均未見異常。追問家族史，先證者胞兄亦有長期肝功能異常病史，檢查銅藍(lán)蛋白5.0 mg/dL，父母否認(rèn)肝功能異常，因此建議該家族完善WD相關(guān)基因檢測。采集先證者、父母及兄長外周血2～3 mL，根據(jù)核酸提取及純化試劑（博奧木華）操作說明書要求，從外周血中提取基因組DNA。采用QIAseq FX DNA Library Kit試劑盒及定制的單基因病panel，制備包含ATP7B基因全部外顯子及剪切區(qū)域的文庫，采用AMPure XP beads純化體系進(jìn)行純化并采用Quant-iTTM 1X dsDNA HS Assay Kit和QubitTM熒光計對文庫進(jìn)行定量檢測。采用NadPrep NanoBlockers（for Illumina）、NadPrep Hybrid Capture Reagents、KAPA Library Amplification、NovaSeq 6000 Reagent試劑盒，按照操作說明書要求，對先證者文庫雜交捕獲并進(jìn)行捕獲后產(chǎn)物的擴(kuò)增、純化并在NovaSeq 6000測序儀上進(jìn)行高通量測序。與hg19的參考序列和基因組分析工具包進(jìn)行比對，進(jìn)行變異調(diào)用。使用ANNOVAR工具對變異進(jìn)行分析，該工具包含注釋數(shù)據(jù)庫，如1000基因組數(shù)據(jù)庫、dbSNP數(shù)據(jù)庫、ClinVar數(shù)據(jù)庫、多態(tài)性表型v2數(shù)據(jù)庫以及SIFT數(shù)據(jù)庫。對先證者的可疑致病位點設(shè)計相應(yīng)引物，進(jìn)行Sanger測序驗證。擴(kuò)增區(qū)域1∶chr13∶52523855+52524461，對應(yīng)的引物序列正向為CAACGTCAAAGTTGACATGATG，反向為TGGATGGGAAAGTCCTGG；擴(kuò)增區(qū)域2∶chr13∶52509545+52510015，對應(yīng)的引物序列正向為AATTGCCTGCTCATGGTG，反向為CAGCTTTCTAGGAAGCCTCAC，擴(kuò)增長度為500 bp。采用ABI9700 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件如下：95 ℃變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物純化后用ABI3730基因分析儀進(jìn)行雙向測序，Sequencher軟件分析測序結(jié)果。

先證者家系遺傳圖及基因測序結(jié)果如圖1所示，先證者的ATP7B基因編碼區(qū)存在2個變異，其中遺傳自母親的c.2662A＞C（p.Thr888Pro）為ATP7B基因編碼區(qū)的錯義變異（圖1a），該基因位點突變最近已有文獻(xiàn)［4-5］報道為WD的致病突變，且與現(xiàn)有文獻(xiàn)［6-8］報道的WD致病突變（p.Ile1148Thr；p.Pro992Leu）呈反式排列，故該變異確定為致病變異。另一變異遺傳自父親的c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）為ATP7B基因編碼區(qū)的移碼變異（圖1b），該變異目前未見ATP7B基因變異數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)報道，為新發(fā)突變。同時，先證者兄長的ATP7B基因測序結(jié)果同先證者，突變位點詳見表1。通過基因分析可見，該家系中父親的ATP7B基因發(fā)生c.4106delC缺失突變，引起第1369位點發(fā)生移碼突變，由絲氨酸突變?yōu)槔野彼幔⒗^續(xù)編碼23個氨基酸后終止。此突變理論上導(dǎo)致該基因編碼氨基酸序列的提前終止，該變異下游仍有多個無義變異致病的報道［9-11］，提示該變異所致氨基酸序列缺失部分對蛋白質(zhì)功能有重要作用。先證者和兄長均有WD的表型，基因測序結(jié)果顯示二者基因型相同，根據(jù)遺傳圖譜分析（圖1c），父母分別攜帶1個突變，2個小孩均遺傳了2個突變，符合常染色體隱性遺傳模式中復(fù)合雜合突變致病的機制。根據(jù)以上證據(jù)，ATP7B c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）考慮為新發(fā)的致病突變。

2 討論

WD發(fā)病可見于任何年齡，但多起病于兒童及青少年期［12］，根據(jù)臨床癥狀可分為以下分型。（1）肝型：WD中最常見類型，該型多見于兒童及青少年，以肝損傷為表現(xiàn)，可見進(jìn)行性轉(zhuǎn)氨酶升高、急性或慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化甚至急性肝衰竭，但也可以無癥狀表現(xiàn)。（2）腦型：以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主，常較肝型發(fā)病晚10年，可出現(xiàn)智力倒退、構(gòu)音障礙、吞咽障礙、運動障礙、不自主運動、震顫、精神癥狀，該型癥狀輕時不易發(fā)現(xiàn)，察覺時已進(jìn)入中后期。（3）其他型：如出現(xiàn)腎臟疾病、骨病、肌肉疾病、皮膚色素沉著、K-F環(huán)及溶血性貧血等。（4）混合型：以上各型的組合［1，13］。WD的診斷金標(biāo)準(zhǔn)為肝穿刺活組織檢查肝細(xì)胞銅含量＞250 μg/g，但其為有創(chuàng)性檢查，故臨床應(yīng)用較少［14］。目前該病主要通過臨床表現(xiàn)結(jié)合輔助檢查如生化指標(biāo)、影像學(xué)及基因檢測進(jìn)行診斷，其中生化指標(biāo)主要包括血清銅藍(lán)蛋白＜200 mg/L、24 h尿銅＞100 μg，影像學(xué)例如腹部彩超、CT、MRI及頭顱MRI（最常見的是基底節(jié)區(qū)或橋腦的改變）等。結(jié)合本病例，先證者為學(xué)齡前兒童，以肝臟病變?yōu)槭装l(fā)癥狀，出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高、多種凝血因子活動度降低、脂肪肝，肝大、血清銅藍(lán)蛋白明顯降低、尿銅升高等表現(xiàn)，因此考慮可能為肝型WD，為進(jìn)一步驗證，建議家屬完善家系基因檢測。

隨著基因檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，加之ATP7B基因突變位點的報道增加，基因檢測成為WD的一線篩查方法。根據(jù)人類基因數(shù)據(jù)庫記載，目前ATP7B基因發(fā)現(xiàn)有938個突變位點，種族、地域分布與突變的頻率和種類顯著相關(guān)，其中歐洲WD以c.3207C＞A（His1069Gln）為最常見的突變位點，基因頻率為13%～61%，亞洲WD以c.2333G＞T（Arg778Leu）為常見突變位點，基因頻率為34%～38%［13］。另外Cheng等［15］針對中國WD人群研究發(fā)現(xiàn)，肝型多見于p.Ser406Ala、p.Val456Leu突變，腦型多見于c.2755C＞G（p.Arg919Gly）、c.3443T＞C （p.I1e1148Thr）突變，而c.2804C＞T（p.Thr935Met）突變常表現(xiàn)為混合型。Li等［16］研究統(tǒng)計結(jié)果顯示，WD先證者的直系兄弟姐妹患WD的概率為25%，而其子女患WD的概率為0.5%。在歐洲兒童WD診療指南［17］中也提出，一旦確診WD，先證者的一級親屬（兄弟姐妹、后代及父母）均應(yīng)完善肝功能、銅代謝指標(biāo)及基因檢測。

根據(jù)2001年德國萊比錫第8次WD國際會議上制訂的Leipzig評分［18］，并結(jié)合本病例已完善的相關(guān)檢查結(jié)果進(jìn)行評分，先證者Leipzig評分為5分（24 h尿銅92.7 μg計1分，ATP7B基因外顯子測序為復(fù)合雜合突變計4分），其兄長Leipzig評分為4分（ATP7B基因外顯子測序為復(fù)合雜合突變計4分），兩者總分均≥4分，故均診斷為WD。

綜上，通過本病例研究明確了c.2662A＞C（p.Thr888Pro）及c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）突變位點為該家系患有WD的遺傳因素，同時該家系的c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）移碼突變?yōu)锳TP7B基因新發(fā)突變位點，進(jìn)一步豐富了ATP7B基因突變譜。年齡＜10歲的患者若以肝臟疾病為首發(fā)癥狀起病時，需警惕WD可能。對高度疑似及確診的WD患者應(yīng)進(jìn)行直系親屬的WD篩查，以便于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，進(jìn)而有效遏制疾病進(jìn)展，減少該病的致殘率及死亡率。

倫理學(xué)聲明：本例報告已獲得患者家屬知情同意。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉玉婷負(fù)責(zé)撰寫論文；唐志慧負(fù)責(zé)收集資料；賓瓊負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章，修改文章及最后定稿。

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收稿日期：

2022-08-04；錄用日期：2022-09-05

本文編輯：葛俊