唐薇 王冬梅

摘要：體外誘導肝樣細胞（HLC）是獲取大量具有應用價值的肝細胞的有效途徑之一，這些 HLC可以用于構(gòu)建疾病模型、藥物設(shè)計和藥物毒理學評價等。目前，HLC的體外誘導主要通過引入外源轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子或小分子化合物組合的處理。小分子化合物因其結(jié)構(gòu)多樣性、時間和劑量的可控性及操作上的便利和安全等優(yōu)勢，讓科學家們致力于篩選小分子化合物來取代外源轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子，其在再生醫(yī)學領(lǐng)域的應用前景廣闊。本文主要對體外誘導多能干細胞及其他成體細胞分化成HLC的研究進行概述，并總結(jié)了小分子化合物在體外誘導HLC中的應用，以期為HLC的體外誘導研究提供思路和借鑒。

關(guān)鍵詞：肝樣細胞； 小分子化合物； 再生醫(yī)學

基金項目：福建省自然科學基金項目（2020J05038）； 福建省教育廳項目（JAT190090）

Advances in in vitro induction of hepatocyte-like cells and the application of small-molecule compounds in inducing hepatocyte-like cells

TANG Wei， WANG Dongmei. （Fujian Key Laboratory of Development and Neurobiology， College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou 350117， China）

Corresponding author：

TANG Wei， 40720007@qq.com （ORCID：0000-0001-8841-4125）

Abstract：

The induction of hepatocyte-like cells （HLCs） in vitro is one of the effective ways to obtain a large number of useful hepatocyte， and these HLCs can be used in disease modeling， drug design， and toxicological evaluation. At present， the induction of HLCs in vitro is mainly achieved by introducing exogenous transcription factors， cytokines or small-molecule compounds. Since small-molecule compounds have the advantages of structural diversity， controllable time and dose， and convenient and safe operation， scientists are devoted to screening out the small-molecule compounds to replace exogenous transcription factors and cytokines， and such compounds have a promising application prospect in the field of regenerative medicine. This article reviews the studies on the in vitro induction of HLCs from pluripotent stem cells and other adult stem cells and summarizes the application of small-molecule compounds in the in vitro induction of HLCs， in order to provide ideas and references for the in vitro induction of HLCs.

Key words：

Hepatocyte-Like Cells; Small Molecules; Regenerative Medicine

Research funding：

Natural Science Foundation of Fujian Province （2020J05038）; Fujian Education Department （JAT190090）

肝臟疾病一直威脅著全人類的健康，終末期肝病更是有著較高的致死率。肝移植被認為是治療肝臟代謝類疾病、終末期肝病和急性肝病最為有效的方法［1-3］。然而可用于移植手術(shù)的肝臟供體器官非常緊缺，一般肝移植較為常見的方法是進行肝細胞移植［4］，即向患者體內(nèi)移植正常的肝細胞進行治療，這樣可以有效擴大供體肝臟的使用效率，并具有操作簡便、創(chuàng)傷小的優(yōu)點［5］。

目前將肝細胞移植技術(shù)廣泛運用于臨床治療仍然面臨著許多問題，如缺少高質(zhì)量的供體肝臟，缺少臨床級別的凍存和復蘇肝細胞的方法，以及合適的免疫抑制試劑等。如果在肝細胞來源方面有進一步突破，細胞移植將會更有效地應用于臨床，為患者提供更好的治療，提高生存機會。另一方面，肝細胞是藥物研發(fā)的重要工具，可以用于評價藥物毒性、穩(wěn)定性等。如果能在體外大量獲得肝樣細胞（hepatocyte-like cells，HLC）將非常有利于肝臟疾病的治療和新藥研發(fā)［6-7］。近年來，國內(nèi)外科研工作者一直致力于獲得不依賴于供體肝臟的功能型HLC。隨著干細胞技術(shù)、細胞轉(zhuǎn)分化技術(shù)的大力發(fā)展，誘導其他細胞分化為HLC的研究工作已成為再生醫(yī)學的研究熱點。眾多研究［1，8-9］表明胚胎干細胞、誘導多能性干細胞以及其他終末分化的細胞可通過導入外源基因、小分子化合物處理、細胞共培養(yǎng)或添加特定細胞因子、3D培養(yǎng)等方式來實現(xiàn)向肝細胞的誘導分化。小分子化合物因其作用靶點相對清晰、操作簡便等獨特優(yōu)勢，讓科研工作者們更致力于探索用小分子化合物的方法來不斷優(yōu)化細胞肝向分化的誘導過程。

1 HLC的體外誘導

1.1 多能干細胞來源的HLC 人多能干細胞（human pluripotent stem cells，hPSC）包含了人胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESC）和人誘導多能性干細胞（human-induced pluripotent stem cells，hiPSC）。hPSC體外誘導分化成肝細胞常見的方法有：細胞因子與胞外基質(zhì)共同誘導、化合物誘導、遺傳修飾以及與分化的成體細胞共培養(yǎng)等［5］。目前科學家在誘導hPSC體外分化成肝細胞時采用的主要策略是模擬人體胚胎發(fā)育過程中肝臟的形成［1］。主要經(jīng)歷了3個階段的分化：（1）激活Activin/Nodal通路，促使胚胎干細胞向內(nèi)胚層分化；（2）生長因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）刺激內(nèi)胚層向胎肝分化發(fā)育；（3）添加肝細胞生長因子（HGF）和抑瘤素 M（oncostatin M，OSM）促進肝細胞的成熟。具體的誘導肝向分化所涉及的細胞因子與相關(guān)信號通路如表1所示。目前已有研究通過優(yōu)化細胞培養(yǎng)基［10］、細胞共培養(yǎng)［11-12］、過表達相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子［13］等方式來提高誘導得到的HLC的成熟性。已有研究［14-15］表明肝細胞的極性對于膽管和膜轉(zhuǎn)運體的形成至關(guān)重要。Dao Thi等［15］將hESC誘導分化成柱狀極化的HLC，這些極化的HLC可以用于藥代動力學、藥物之間相互作用的研究。

科研人員在將hESC誘導分化成肝細胞的研究上已經(jīng)取得了很大的進展，構(gòu)建了多種分化誘導體系［4］。但hESC的使用依然面臨著倫理道德及個體間免疫排斥等問題，在一定程度上也限制了其臨床的應用。而hiPSC來源的肝細胞可以有效避免此問題?？梢韵扔没颊咦陨淼捏w細胞體外誘導成 hiPSC，再進一步將 hiPSC定向誘導分化為人肝樣細胞（hHLC），這類細胞被稱為hiPSC-HLC［9，16］。從患者自身取材誘導得到的細胞可以有效緩解免疫排斥的情況，且不存在倫理道德爭議。hiPSC-HLC還可用于構(gòu)建肝類器官，這種3D的肝類器官可以用于模擬肝臟的發(fā)育過程，探究肝臟疾病發(fā)病機制、藥物療效、細胞間以及細胞與基質(zhì)間的相互作用［17-19］。

hPSC來源的HLC已成功開發(fā)為多種肝相關(guān)疾病的細胞模型和類器官模型，在一定程度上解決了病理樣品有限的問題，可將其用于探究肝疾病發(fā)病機制，并設(shè)計針對性的治療方案。表2總結(jié)了一些 hPSC來源的肝疾病模型及其應用。hPSC來源的HLC在高通量藥物篩選、藥物毒性分析、藥代動力學和個體化差異作用評價等領(lǐng)域都發(fā)揮了重要價值［20-28］。

1.2 其他成體細胞來源的HLC 細胞轉(zhuǎn)分化技術(shù)也稱為譜系重編程，實質(zhì)是將分化成熟的體細胞直接轉(zhuǎn)變成其他譜系的功能細胞或者祖細胞，該過程無需經(jīng)歷干細胞的多能性狀態(tài)。轉(zhuǎn)分化技術(shù)操作簡便，較好地避免了多能干細胞技術(shù)在細胞療法中潛在的致瘤性，能夠為誘導培養(yǎng)功能型肝細胞、解決肝病患者需求提供新思路。

2011年中國科學家惠利健研究團隊［29］在Nature報道了采用3種轉(zhuǎn)錄因子 Foxa3、Hnf1α、Gata4 可以實現(xiàn)將小鼠皮膚細胞轉(zhuǎn)分化成HLC。這些HLC具有典型的上皮樣細胞形態(tài)，表達肝細胞特異性基因并具有類似肝細胞的功能，且在移植到Fah-/-小鼠體內(nèi)后能夠發(fā)揮一定的治療作用。有研究［30］表明，F(xiàn)oxa蛋白家族作為“先鋒因子”，可招募Hnf4α共同結(jié)合到染色質(zhì)上來激活肝特異性基因的表達。而Foxa3不同于Foxa1和Foxa2的是，其能遷移到目標基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，共同調(diào)控基因的表達。胡以平課題組［31］報道了利用另外兩種轉(zhuǎn)錄因子Hnf1β和Foxa3可將小鼠的胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為肝臟祖細胞，而肝臟祖細胞可以進一步分化為肝細胞和膽管細胞。隨著小鼠體系的轉(zhuǎn)分化誘導技術(shù)的成熟，科學家們也開始實現(xiàn)將人的成纖維細胞轉(zhuǎn)分化成hHLC。惠利健課題組［32］通過對人成纖維細胞過表達Foxa3、Hnf1α和Hnf4α而成功將其轉(zhuǎn)分化為hHLC。Inada等［33］采用外源轉(zhuǎn)錄因子Foxa3、Hnf1α和Hnf6將人臍靜脈和外周血源性內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化成肝前體細胞，通過體外3D培養(yǎng)來實現(xiàn)肝前體細胞向肝細胞和膽管細胞的分化。這些研究成果表明多種成體細胞是可以通過導入外源轉(zhuǎn)錄因子來實現(xiàn)向肝細胞的轉(zhuǎn)分化，但是外源轉(zhuǎn)錄因子的導入可能會引起細胞基因組插入后突變，而病毒的使用可能具有一定的致瘤性。目前有許多研究者致力于采用化合物誘導的方法來取代外源轉(zhuǎn)錄因子，讓細胞肝向轉(zhuǎn)分化的過程更加簡便、可控，且具有醫(yī)學應用價值。

2 小分子化合物在體外誘導HLC中的應用

2.1 小分子化合物在促進多能干細胞肝向分化中的應用 小分子化合物在細胞重編程過程中取代轉(zhuǎn)錄因子的作用要追溯到iPSC的體外誘導。2013年鄧宏魁課題組［34］采用7個小分子化合物VPA（丙戊酸）、CHIR99021、Repsox、Parnate、Forskolin、DZNep和TTNPB成功將小鼠體細胞誘導為iPSC，首次實現(xiàn)了全化合物組合的方法誘導體細胞重編程，實現(xiàn)了里程碑式的突破。運用全化合物誘導得到的iPSC被命名為化合物誘導多能性干細胞（chemical induced pluripotent stem cells，CiPSC）。CiPSC的出現(xiàn)也讓科學家們更多的嘗試將小分子化合物用于誘導多能干細胞的定向分化。Tasnim等［35］采用小分子化合物三步誘導法促使hPSC分化為HLC：LY294002和BIO（6-溴-靛玉紅-3′-肟）誘導定形內(nèi)胚層的形成；丁酸鈉（sodium butyrate，SB）和DMSO誘導內(nèi)胚層分化為肝前體細胞；最后聯(lián)合SB431542 將肝前體細胞誘導分化為HLC。Asumda等［36］發(fā)現(xiàn)小分子化合物組合（CHIR99021、DMSO和Dihexa）可以誘導hPSC分化為HLC。Du等［37］利用CHIR99021和DMSO促進 hPSC向定形內(nèi)胚層分化，然后采用A83-01、SB和 DMSO誘導內(nèi)胚層肝向分化，最后加入FH1和 FPH1促進HLC的成熟。

2.2 小分子化合物在促進其他細胞肝向分化中的應用 相較于細胞因子較為昂貴的價格和外源轉(zhuǎn)錄因子導入較為繁瑣的操作，小分子化合物因其結(jié)構(gòu)多樣性、操作便利可控及價格上的優(yōu)勢，使其成為體外誘導其他細胞重編程為 HLC的優(yōu)先選擇。目前已有不少研究結(jié)果表明小分子化合物可以促進其他成體細胞體外轉(zhuǎn)分化為HLC。Guo等［38］采用小分子化合物組合CRVPTD（C，CHIR99021；R，RepSox；V，VPA；P，Parnate；T，TTNPB；D，DZNep）結(jié)合外源轉(zhuǎn)錄因子Foxa3可以誘導小鼠成纖維細胞向肝細胞轉(zhuǎn)分化，并在肝損傷小鼠（Fah-/-小鼠）中驗證了這些HLC的功能；Tang等［39］將小分子化合物組合CRVPTD結(jié)合單個轉(zhuǎn)錄因子（Foxa3/Hnf1α/Hnf4α）誘導人尿細胞轉(zhuǎn)分化為 HLC；Lim等［40］發(fā)現(xiàn)單個轉(zhuǎn)錄因子（Hnf1α 或Hnf4α）結(jié)合BMP4、小分子化合物A-83-01和CHIR99021可以將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為HLC。然而，將小分子化合物A-83-01與化合物組合CRVPTD結(jié)合卻不能實現(xiàn)全化合物誘導成纖維細胞向肝細胞的轉(zhuǎn)分化［39］。也有研究將小分子化合物應用于間充質(zhì)干細胞的體外肝向分化誘導。Panta等［41］發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可以誘導間充質(zhì)干細胞分化為肝前體細胞，并促進其體外成熟；Luo等［42］采用小分子化合物組合（IDE1、CHIR99021、LY294002、FH1）誘導人間充質(zhì)干細胞體外分化為HLC；Cipriano等［43］采用表觀遺傳調(diào)控分子曲古菌素A（TSA）、5-氮雜胞苷（5-AZA）聯(lián)合DMSO誘導人臍帶來源間充質(zhì)干細胞分化為HLC。表3將不同小分子化合物在體外誘導其他細胞分化為HLC中的應用進行了總結(jié)和歸納。

小分子化合物也可用于誘導原代肝細胞轉(zhuǎn)化為具有增殖能力的肝前體細胞。Katsuda等［44］發(fā)現(xiàn)小分子化合物Y-27632、A-83-0和CHIR99021可使小鼠肝細胞轉(zhuǎn)化為可增殖的、并具有雙向分化潛能的前體細胞，以實現(xiàn)小鼠肝細胞的體外增殖，并將該技術(shù)用于治療肝疾病小鼠?；堇≌n題組［45］則發(fā)現(xiàn)在條件培養(yǎng)基中加入Y-27632和A-83-01可促使人原代肝細胞進入一種可增殖的中間過渡態(tài)（具有一定分化潛能），實現(xiàn)人肝細胞的體外增殖并誘導其定向分化。這些研究成果為體外大量獲得功能性肝細胞提供了非常好的策略，但其原代肝細胞的獲得仍需依賴于供體肝臟。如何實現(xiàn)全化合物誘導其他細胞分化成具有成熟肝細胞功能的HLC，而不再依賴于供體肝臟是科學界未來想要解決的問題。

3 小分子化合物在HLC誘導中的作用機制

小分子化合物在HLC誘導過程中的作用機制可以大致分為兩個方面（表4）。在誘導多能干細胞肝向分化的第一階段——定形內(nèi)胚層的形成，常用到的小分子化合物有CHIR99021、BIO、IDE1和LY294002。作為糖原合成激酶3（GSK-3）抑制劑的CHIR99021和BIO，主要是通過激活Wnt/β-catenin通路來上調(diào)內(nèi)胚層標志性基因的表達，促進定形內(nèi)胚層的形成［35-37］。IDE是一種定形內(nèi)胚層誘導物，作用與Activin A相似，通過介導Smad2磷酸化，激活Activin/Nodal通路來促進內(nèi)胚層的形成［42，46］。第二階段是細胞肝向分化和HLC的成熟。許多研究［35-37］表明適當濃度的DMSO能夠驅(qū)動定形內(nèi)胚層的肝向分化，促進HLC的成熟。但也有研究者對此持不同意見。Wang等［51］認為細胞的肝向分化效率并不受DMSO影響。DMSO作為含硫有機化合物，可以與蛋白質(zhì)的疏水基團相互作用，引起蛋白質(zhì)變性，進而影響細胞的代謝活動，這對其在細胞肝向分化中的作用帶來了一定的爭議性，具體作用機制有待闡明。

有些小分子化合物能推進體細胞的重編程，加速細胞從間質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)化（MET，調(diào)節(jié)細胞命運轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵過程），如 A83-01和RepSox作為活化素受體樣激酶抑制劑（抑制TGFβ）能夠促進細胞MET的過程［8，37，48］，從而有利于肝前體細胞的生成和肝細胞的成熟。組蛋白去乙?；种苿ㄈ鏢B、VPA和TSA）也常用于誘導細胞肝向分化，其可以促進肝細胞代表性基因的表達，有利于內(nèi)胚層向肝細胞分化［41，43，47］。還有一些表觀遺傳調(diào)控分子，如Parnate（賴氨酸特異性脫甲基酶抑制劑）、DZNep（組蛋白甲基化抑制劑）和 5-AZA（DNA甲基化酶抑制劑），能夠創(chuàng)造一種開放的狀態(tài)來調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄水平上促進細胞向肝臟譜系的轉(zhuǎn)化［8，43，49］。TTNPB 可通過激活視黃酸受體參與調(diào)控肝核受體介導的信號通路，從而推動細胞的肝向轉(zhuǎn)分化［50］。小分子化合物FH1和FPH1可以分別取代細胞因子HGF和OSM來促進肝細胞的成熟［37］。目前，小分子化合物在促進其他細胞向肝細胞的轉(zhuǎn)化過程中所發(fā)揮的精確作用和機制尚不完全清楚，未來需要篩選更多的小分子化合物并確定最優(yōu)的組合和適用濃度，以實現(xiàn)對細胞肝向分化誘導的精準調(diào)控。

4 總結(jié)與展望

肝移植是治療終末期肝病唯一有效的方法，但因為供體肝臟的短缺以及需要忍受長期的免疫抑制治療而無法被廣泛應用。肝細胞體外誘導技術(shù)的發(fā)展是解決供體肝臟不足的有效方法，尤其是hPSC來源的HLC在產(chǎn)量上能夠?qū)崿F(xiàn)無限供給，可以廣泛用于肝疾病藥物開發(fā)、肝疾病模型建立、個性化藥物設(shè)計、藥物毒理學評價等領(lǐng)域。且hiPSC-HLC還可取材于患者自身細胞，用于體外功能性肝臟器官的誘導，具有重大的臨床意義。體外誘導HLC主要采用的是外源性細胞因子誘導、外源基因?qū)胍约靶》肿踊衔锏亩ㄏ蛘T導。小分子化合物的誘導方式相比轉(zhuǎn)基因操作要更加安全、可控且易于操作。目前小分子化合物還不能完全取代外源轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子在誘導其他細胞肝向分化中的作用，需要尋找更多有效、安全的小分子化合物來實現(xiàn)全化合物誘導以及提高誘導得到的HLC的成熟性。未來，如何更高效、安全地獲得HLC以及科學、系統(tǒng)地評價獲得的HLC的功能用途是體外誘導細胞肝向分化研究的努力方向。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：唐薇參與文獻調(diào)研和文章撰寫；王冬梅參與文章的文獻查閱與內(nèi)容修改。

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收稿日期：

2022-09-05；錄用日期：2022-10-12

本文編輯：王瑩